Informations

Pouvez-vous utiliser des images prises à différents temps d'exposition dans l'analyse d'images Western Blot ?


Je fais une analyse de données Western blot où j'ai des images d'un certain nombre d'expériences (où les échantillons des expériences sont des répliques biologiques/techniques). Pour chaque expérience, j'ai marqué la membrane avec des anticorps contre les mêmes protéines d'intérêt.

Je veux combiner les données de ces expériences afin qu'elles soient toutes affichées sur le même graphique.

J'ai pris mes images à différents temps d'exposition (par exemple 5 s, 30 s, 1 min, etc.). Pour une protéine X, j'ai trouvé que les images prises à 30 secondes d'exposition sont les meilleures pour l'analyse, car les bandes sont saturées à des temps d'exposition plus élevés.

Cependant, pour une expérience, pour le marquage de la protéine X, je ne peux pas utiliser l'image d'exposition de 30 secondes pour mon analyse car il y a des bandes fantômes. J'ai une image prise à une exposition de 5 secondes que je peux utiliser à la place.

Je me demandais, lors de la combinaison de données d'images western blot de différentes expériences, pour une protéine d'intérêt spécifique (par exemple, la protéine X), toutes les images doivent-elles être prises au même temps d'exposition? Toutes les images de protéine X que j'utiliserai ont été prises à une exposition de 30 secondes, à l'exception d'une qui est prise à une exposition de 5 secondes.

Toutes les idées sont appréciées.


Généralement non, vous ne pouvez pas les comparer directement et vous ne pouvez pas facilement comparer entre les gels. J'ai effectué plusieurs centaines de western blots, dont une grande partie était destinée à la quantification, et en général la quantification sur western blots est difficile (en raison de l'incohérence entre les opérations) et pas très quantitative - un changement de 2 fois est détectable et probablement réel , mais un changement de 10 % - il est peu probable qu'il soit réel.

Si vous voulez un exemple réel de la façon de comparer et d'observer cela (fonctionne avec le système Bio-Rad ou d'autres où le transfert est dans le même espace) - exécutez exactement la même quantité de protéine sur deux gels identiques, placez-les tous les deux dans le même bac de transfert. Comparer la coloration des protéines sur les membranes après transfert. Celui le plus proche de la borne noire aura une coloration plus forte = un meilleur transfert.

Cependant, ce que vous pouvez faire est de convertir les nombres que vous obtenez en une expression relative sur chacun des blots, puis d'utiliser ces nombres à des fins de comparaison.

Par exemple, vous comparez l'expression de la protéine X à un normalisateur (souvent l'actine B) et obtenez des données de changement de pli à partir de cela, ou vous pouvez comparer l'échantillon X non traité aux traitements A, B, C et obtenir les données de cette façon.


Les 4 étapes importantes de la quantification par Western Blot

En tant que scientifiques, nous n'aimons rien de plus que les données quantitatives ! Oh ouais! Mais si vous ne quantifiez pas correctement vos Western blots, vous vous retrouverez dans un endroit désagréable, irremplaçable et totalement dénué de sens. Et tandis que certains scientifiques sont d'accord pour habiter dans un endroit sans signification, j'espère que vous ne l'êtes pas. Passez en revue ces concepts importants sur la façon de quantifier correctement votre prochain Western blot.


Systèmes d'imagerie Invitrogen iBright

Simplifiez la capture et l'analyse des données de transfert Western et de gel avec nos systèmes d'imagerie iBright. Les systèmes d'imagerie iBright rationalisent l'expérience d'imagerie grâce à une combinaison de matériel puissant, de fonctionnalités automatisées et d'une interface facile à utiliser.

Système d'imagerie iBright CL1500

Applications d'imagerie de base :

  • Western blot chimiluminescent
  • Gels et taches de protéines colorés
  • Gels d'acides nucléiques colorés

Système d'imagerie iBright FL1500

Applications d'imagerie de base :

  • Western blot fluorescent
  • Western blot chimiluminescent
  • Gels et taches de protéines colorés
  • Gels d'acides nucléiques colorés

Présentation des fonctionnalités des systèmes d'imagerie iBright :

  • Caméra CCD refroidie de 9,1 MP : haute sensibilité et plage dynamique pour aider à permettre la détection de différences subtiles dans les échantillons
  • Cinq canaux de fluorescence : multiplexez et capturez jusqu'à quatre protéines en un seul transfert pour des expériences plus significatives et représentatives (modèle FL1500 uniquement)
  • Technologie d'exposition intelligente : fournit une détermination rapide du temps d'exposition optimal pour aider à minimiser le besoin de répéter les expositions pour acquérir le signal souhaité
  • Interface simplifiée : disposition claire des fonctions et fonctionnalités combinée à un écran tactile capacitif de 12,1 pouces pour une expérience d'imagerie fluide
  • Fonctionnalités automatisées avancées : la rotation automatique des échantillons, le zoom automatique et la mise au point automatique aident à rationaliser la capture d'image
  • Champ de vision 22,5 x 18,0 cm : grand champ de vision pour l'imagerie à haut débit (image jusqu'à quatre mini ou deux midi blots à la fois)
  • Transilluminateur à LED verte : excitent efficacement les colorants d'ADN populaires tels que le bromure d'éthidium et les colorants Invitrogen SYBR Green avec une alternative aux transilluminateurs à base d'UV
  • Connectivité flexible : exportez les images capturées via une connexion Ethernet, Wi-Fi (avec accessoire en option), USB ou directement vers la plate-forme Connect basée sur le cloud
  • Plusieurs options d'analyse d'images : effectuez la densitométrie, la quantification et la normalisation directement à l'aide du logiciel intégré à l'instrument, ou pour une analyse plus approfondie, utilisez le logiciel d'analyse iBright (disponible dans les versions bureau et cloud)

Le film Thermo Scientific CL-XPosure est un excellent film photographique à utiliser avec des substrats à chimiluminescence améliorée (ECL) pour la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP).

Couleur du filmBleu
DétectionChimiluminescence
Isotopes 35 S, 32 P, 14 CH
ApplicationsMéthodes de transfert de Western par chimiluminescence, d'ADN et d'ARN isotopiques, y compris les méthodes de transfert de Southern et de Northern et de gel-shift (EMSA)

Tailles disponibles

Comparaison entre les options de capture d'images pour la détection par chimiluminescence

Filmcaméras CCD
AvantagesLimitesAvantagesLimites
Expositions prolongées - des temps d'exposition illimités peuvent être utilisés pour capturer des cibles extrêmement peu abondantesPlage dynamique de 1,5 ordre de grandeurPlage dynamique supérieure à 4 ordres de grandeurDes expositions prolongées avec des signaux faibles peuvent entraîner une augmentation du bruit de fond de la caméra, affectant le rapport signal/bruit global
Faible coût d'entréePeut nécessiter plusieurs expositions pour obtenir une image idéaleLes algorithmes d'exposition automatique aident à déterminer le temps d'exposition optimal (moins de temps nécessaire pour optimiser l'exposition pour le meilleur équilibre signal/bruit)Coûts initiaux des instruments
Nécessite un espace de chambre noire et un processeur de film dédiés. Le processeur de film peut nécessiter une maintenance continue.La capture numérique des données simplifie l'archivage des résultats
QualitatifQualitatif
Le film nécessite une étape de traitement avant que le signal puisse être visualiséVisualisation instantanée des résultats

Le western blotting chimiluminescent continue d'être une application fondamentale pour caractériser les protéines. Le film radiographique a traditionnellement été utilisé pour capturer le signal chimioluminescent généré par des anticorps conjugués à une enzyme (peroxydase de raifort et/ou phosphatase alcaline). Cependant, aujourd'hui, les instruments d'imagerie à base de caméra CCD (dispositif à couplage de charge) remplacent rapidement les films radiographiques.

Les caméras CCD utilisent des puces en silicium sensibles à la lumière qui convertissent les photons en signaux numériques. Les améliorations apportées à la conception des puces ont permis le développement de caméras sensibles à base de CCD refroidies avec des performances de capture de la lumière supérieures à celles des films radiographiques. Les puissantes caméras CCD refroidies haute résolution dans des instruments tels que les systèmes d'imagerie iBright permettent la capture et l'analyse de Western blots avec une sensibilité de signal, une linéarité et une plage dynamique supérieures à celles des films radiographiques.

Analyse quantitative avec imagerie CCD

La linéarité du signal est un facteur important pour la mesure quantitative. Lorsque la relation entre l'intensité du signal et la quantité d'échantillon est linéaire, des quantités d'échantillon inconnues peuvent être calculées à l'aide d'un modèle de régression linéaire simple. Visuellement, les expositions Western blot sur film radiographique peuvent sembler avoir une large plage de linéarité du signal, cependant, l'analyse de densitométrie indique que les signaux sur film ont une plage dynamique linéaire étroite. Les instruments basés sur une caméra CCD ont une plage dynamique linéaire accrue par rapport au film radiographique (qui a 1,5 ordre de plage dynamique). Les caméras des systèmes d'imagerie iBright et d'autres systèmes d'imagerie CCD 16 bits équivalents affichent une plage dynamique d'au moins 4 fois, permettant la capture de signaux chimiluminescents puissants sans sacrifier la détection des bandes faibles. Cette large plage dynamique améliore le potentiel de quantifier avec précision les résultats de western blot.

Figure 1. Plage dynamique accrue avec l'imagerie CCD. Les lysats HeLa ont été dilués en série, transférés sur membrane de nitrocellulose et sondés pour la cyclophiline B, la -tubuline ou la DDX3. Les taches ont été exposées à un film radiographique ou imagées à l'aide de l'exposition intelligente sur le système d'imagerie iBright FL1000. Les signaux ont été quantifiés à partir d'une seule image capturée. Dans toutes les expériences, les signaux forts ont rapidement atteint un plateau lorsqu'ils sont détectés avec un film. Le signal du système iBright a donné une plage de réponse linéaire plus large que le film pour chacune des cibles analysées. Plage linéaire indiquée par régression linéaire.

Algorithmes d'exposition automatique pour trouver le temps d'exposition optimal

De nouveaux systèmes de documentation Western blot sont équipés d'algorithmes pour aider à déterminer rapidement le temps d'exposition optimal pour les signaux chimioluminescents et fluorescents. Les signaux chimiluminescents peuvent facilement être saturés sur le film en raison de la plage dynamique limitée. L'imagerie numérique a permis de visualiser la saturation et d'ajuster le temps d'exposition en conséquence, alors que cette information n'est pas évidente lors de l'utilisation d'un film. Les systèmes d'imagerie iBright sont dotés de la technologie d'exposition intelligente qui prédit rapidement le temps d'exposition optimal, aidant à minimiser le potentiel d'images sur ou sous-exposées, et donc la nécessité de répéter les expositions pour obtenir le signal souhaité.

Figure 2. Smart Exposure fournit une image optimale sans qu'il soit nécessaire de capturer plusieurs images. L'exposition intelligente et l'exposition manuelle sur un système d'imagerie iBright ont été utilisées pour analyser les lysats HeLa dilués en série et sondés pour HDAC1. Grâce à l'exposition intelligente, une large gamme de signaux est capturée là où seule la charge la plus élevée de HeLa est saturée, fournissant la plus grande gamme de signaux de la charge la plus élevée à la charge la plus faible dans une image. L'exposition intelligente a empêché la surexposition et la sous-exposition, ce qui a permis d'obtenir des données pouvant fournir une quantification plus significative. La saturation est indiquée en rouge.


Résumé

Introduction

Le Western blot est une technique de base pour la détection des protéines. Pour des protéines de moindre abondance ou des anticorps de moins bonne qualité, une sensibilité accrue est souvent souhaitée. Bien qu'il soit généralement connu que des concentrations plus élevées d'anticorps et des temps d'exposition prolongés du film aideront à améliorer la sensibilité des western blots, les deux mesures comportent leurs propres risques, et il est souvent difficile de savoir dans quelle mesure ces mesures doivent être appliquées.

Méthodes

Nous avons mené des études chronologiques pour étudier les interactions protéine-anticorps et les interactions anticorps primaires-anticorps secondaires dans le Western blot. Nous proposons également un protocole d'exposition de films empilés et l'avons testé dans des courbes standard et des échantillons de cellules cancéreuses.

Résultats

Notre étude a révélé que les interactions protéine-anticorps primaires et les interactions anticorps primaires-anticorps secondaires pouvaient prendre plus de temps que celles couramment utilisées « une heure » ​​ou « une nuit », et dans certains cas plus de 48 h, pour atteindre sa liaison maximale. Nous montrons également que le protocole modifié d'exposition de films empilés fonctionne bien pour les courbes standard et les échantillons biologiques, atteignant une sensibilité maximale dans les transferts western sans brouiller les signaux cibles ou augmenter les arrière-plans.

Discussion

En plus de l'optimisation régulière des concentrations d'anticorps et du temps d'exposition du film, une incubation prolongée avec des anticorps et une exposition de films empilés contribueront également à améliorer la sensibilité et à réduire le bruit de fond dans le transfert de Western.


Discussion

Dans cette étude, nous avons développé une méthode optimisée pour la fixation des protéines sur les membranes d'immunotransfert avant l'étape de blocage. Cette méthode convient à la détection de protéines provenant de différentes sources, y compris les lysats cellulaires, les échantillons de tissus et les sérums. Notre méthode a été développée pour une application sur des membranes de PVDF et de nitrocellulose pendant l'immunotransfert et la LB, et montre des avantages significatifs dans la détection de protéines de faible poids moléculaire.

La membrane PVDF est une surface extrêmement hydrophobe, liant les protéines à travers le dipôle et les interactions hydrophobes 19 . Le traitement des protéines avec de l'acétone est une méthode de préparation courante dans la recherche en protéomique. Le chauffage de la membrane buvard accélère l'évaporation de l'eau, offrant un environnement plus favorable pour la liaison des protéines à la membrane PVDF. De plus, l'application prolongée de chaleur (30 min) entraîne une diminution de la compacité de la protéine dénaturée, ce qui modifie sa structure, passant du regroupement hydrophobe persistant et des formes secondaires résiduelles à une structure lâche, où les chaînes latérales hydrophobes et les glycanes compactés sont exposés. 25 . Cette dénaturation permet aux protéines d'interagir avec la membrane par des interactions hydrophobes, ainsi que la détection de glycanes en utilisant des lectines. Nous avons montré que le traitement à l'acétone à 0 °C est plus bénéfique qu'à température ambiante, tandis que le chauffage des échantillons à 50 °C après le traitement à l'acétone représente une amélioration supplémentaire de cette méthode. Pris ensemble, nos résultats indiquent que le nombre d'interactions hydrophobes a augmenté au cours de l'étape de fixation modérée (chauffage à 50 °C et 75 °C), cependant, la dénaturation à des températures plus élevées entraîne une exposition des groupes hydrophobes internes et des changements de conformation, diminuant l'accessibilité d'épitopes. De plus, avec l'augmentation de la dénaturation des protéines, une diminution de la reconnaissance des épitopes par les anticorps spécifiques a été observée23. Cependant, lors de la fixation des protéines lors de l'analyse LB, une augmentation du degré de dénaturation a facilité la détection des glycanes.

Différentes caractéristiques des membranes en nitrocellulose et PVDF exigent des procédures de fixation différentes. En raison de la nature non hydrophobe des membranes de nitrocellulose, les protéines se lient à ces membranes par des interactions électrostatiques 26,27, ce qui entraîne une capacité de liaison aux protéines inférieure pour ces membranes par rapport à celle des membranes PVDF (80 contre 170 mg BSA lié /cm 2 ) 19 . Cela a également été observé dans nos expériences de LB et d'immunotransfert. Les membranes de nitrocellulose étaient facilement dissoutes dans des solvants organiques tels que l'acétone et le méthanol, et se sont avérées avoir une faible résistance aux traitements acides et alcalins 27 . Par conséquent, nous avons exploré plusieurs mélanges d'eau et de différents solvants organiques. Parmi les conditions étudiées, l'application de 75 % de méthanol, 50 % d'acétone et le chauffage de l'échantillon à 50 °C s'est avéré plus bénéfique pour la fixation des protéines que l'application de 50 % de méthanol et le chauffage à 50 °C. Cependant, en raison du signal de fond élevé de la première méthode, cette dernière a été choisie comme méthode de fixation optimale.

L'immunomarquage des protéines sur les membranes d'acétate de cellulose implique généralement une fixation acide à l'aide d'acide sulfosalicylique ou d'acide trichloroacétique 28,29. L'acide peut hydrolyser l'acide sialique, un sucre terminal important des chaînes glucidiques des glycoprotéines. La fixation des protéines à l'aide de notre méthode n'a pas éliminé l'acide sialique, comme l'a démontré l'analyse à l'aide de SNA.

Afin de vérifier l'universalité et les avantages significatifs de ces méthodes optimisées, des protéines de lysats cellulaires totaux ont été particulièrement testées. La protéine CFTR était difficile à étudier et à analyser en raison des faibles niveaux et des taux de renouvellement élevés dans les cellules 30 . La méthode de fixation optimisée a grandement facilité sa détection. La protéine HIF-1α s'est avérée dégradée dans des conditions normoxiques, ce qui a rendu sa détection difficile 31 . Cependant, il a été clairement détecté même avec une très petite quantité de protéines totales suite à l'application de la méthode optimisée. En outre, les niveaux de protéine HIF-1α ont augmenté en réponse à l'hypoxie 31, ce qui a également été attesté dans notre étude (Fig. 4 supplémentaire). De plus, la détermination de N-les taux de glycanes dans le sérum de patients atteints de cancer de la prostate en utilisant cette méthode optimisée nous ont aidés à identifier une protéine fucosylée de 43 kDa, qui pourrait représenter un nouveau marqueur diagnostique. De plus, quant aux protéines fucosylées de 30 kDa et 25 kDa et à la glycoprotéine bissectrice de 40 kDa, elles n'ont été initialement détectées que chez les patients atteints d'un cancer de la prostate lorsqu'aucune étape de fixation n'a été utilisée, ce qui peut suggérer que ces protéines sont spécifiques du cancer de la prostate. les patients. Cependant, l'analyse couplée à l'étape de fixation de l'échantillon a démontré que ces protéines peuvent également être trouvées dans les sérums de sujets sains, à des niveaux inférieurs. Ici, nous rapportons les altérations de la bissectrice N-glycanes dans le sérum de patients atteints de cancer de la prostate, qui est catalysé par la glycosyltransférase GnT-III. Auparavant, les études se sont concentrées sur les oligosaccharides 1,6-ramifiés pour explorer les relations potentielles entre la progression du cancer de la prostate et la glycosyltransférase GnT-V ou GnT-IX (Vb) 32,33. Par conséquent, nous avons démontré que cette méthode de fixation permet l'identification de protéines associées au développement du cancer et d'autres maladies.

D'autres facteurs, tels que la quantité de SDS dans le gel, la composition du tampon, la durée de transfert et de blocage, les méthodes de transfert et les différents réactifs de détection ECL, affectent également l'analyse par immunoblot. Ici, nous avons étudié la méthode optimale de rétention des protéines séparées sur les membranes après leur transfert. D'autres études devraient explorer et définir les conditions optimales de Western Blot à travers une évaluation complète d'une variété de facteurs. La sensibilité accrue de l'étape de fixation nouvellement développée permet la détection de traces de protéines et de différences subtiles entre différents échantillons, ce qui peut faciliter l'identification et le développement de biomarqueurs cliniquement utiles.


Western Blot Doctor™ — Problèmes de fond de tache

28/02/23 09:30 AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,EST,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN et LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0

Le Western Blot Doctor est un guide d'auto-assistance qui vous permet de résoudre vos problèmes de Western Blot. Dans cette section, vous pouvez trouver des solutions aux problèmes de signal de fond de tache.

Autres sections du Western Blot Doctor:

Problèmes et solutions

Cliquez sur la vignette la plus représentative de votre propre tache pour découvrir les causes probables et trouver des solutions spécifiques au problème.

Problème : taches ou régions blanches sur la tache

Tampons en mousse pour les systèmes de buvardage de réservoir humide Bio-Rad :

  • Mini système Trans-Blot ® (1703933)
  • Buvard Criterion&trade (1704086)
  • Système Trans-Blot (1703914)
  • Système Trans-Blot Plus (1703995)

En tant que test de diagnostic, vous pouvez vérifier la qualité du transfert en imageant les protéines sur le gel et en blot. Si vous prévoyez d'utiliser le transfert dans les étapes en aval, assurez-vous que votre tache peut être enlevée ou est compatible avec la détection d'anticorps. Par exemple, le Coomassie et l'or colloïdal ne sont pas compatibles avec les étapes en aval (voir Bio-Rad Protein Stains et le Protein Stain Selection Guide).

  • Les transferts à haute intensité dans l'échantillon de transfert de réservoir peuvent provoquer un échauffement du tampon, entraînant la formation de bulles, garantissant que le tampon reste froid
    • Réduisez le courant et augmentez le temps de transfert pour compenser
    • Effectuer le transfert dans un appareil de réservoir placé dans de la glace ou une pièce à température contrôlée (4°C)
    • Réfrigérer les tampons avant utilisation
    • Utilisez un serpentin de refroidissement ou un insert &ldquoblue ice&rdquo dans la cellule
    • Mini système Trans-Blot (1703919)
    • Buvard de critère (1704076, 1704087)
    • Système Trans-Blot (1703912)
    • Système Trans-Blot Plus (1703990)
    • Nitrocellulose : Les régions blanches sur la membrane de nitrocellulose indiquent des zones sèches où les protéines ne se lieront pas. Si le mouillage ne se produit pas immédiatement par immersion de la feuille dans le tampon de transfert, chauffer l'eau distillée jusqu'à ce qu'elle soit juste en dessous du point d'ébullition et faire tremper la membrane jusqu'à ce qu'elle soit complètement mouillée. Équilibrer dans le tampon de transfert jusqu'au moment de l'utilisation
    • PVDF : les régions blanches sur la membrane PVDF indiquent les zones où la membrane a été soit préhumidifiée de manière inappropriée, soit laissée sécher. En raison de la nature hydrophobe du PVDF, la membrane doit être préalablement humidifiée dans du méthanol avant équilibrage dans un tampon de transfert aqueux. Une fois mouillée, ne laissez pas la membrane sécher. Si la membrane sèche, remouillez-la dans du méthanol et rééquilibrez-la dans du TBS-T (attention : peut nuire aux processus de détection en aval)

    Problème : bruit de fond élevé sur la tache

    • Augmenter la concentration de bloqueur (par exemple, 3&ndash5% BSA, caséine ou lait écrémé en poudre)
    • Augmenter la durée de l'étape de blocage (une nuit à 4°C au lieu de 1 heure à température ambiante, ou une incubation plus longue à température ambiante)
    • Augmenter la température à laquelle le blocage est effectué, (jusqu'à la température ambiante)
    • Utilisez un autre réactif de blocage (albumine, gélatine, BSA, caséine ou lait écrémé en poudre)
    • Plus de réactifs bloquants :
    • Utilisez une protéine pure telle que la BSA ou la caséine comme bloqueur (voir Détergents et réactifs de blocage)
    • Ne pas réutiliser les tampons bloquants
    • Réduisez le temps d'incubation avec le substrat de détection
    • Si vous utilisez un réactif colorimétrique, retirez le blot de la solution de substrat lorsque le niveau signal/bruit est acceptable et plongez-le dans de l'eau déminéralisée.
    • Réduire/optimiser les concentrations d'anticorps primaires et/ou secondaires
    • Utilisez un essai de transfert de points pour optimiser les concentrations d'anticorps
    • Réduire/optimiser les temps d'incubation
    • Assurez-vous que tous les plateaux d'incubation sont entièrement nettoyés entre les expériences
    • Utiliser des plateaux jetables
    • Charge excessive de protéines
    • Trop de SDS dans le tampon de transfert
    • Charge excessive de protéines :
    • Réduire la quantité de protéines sur le gel
    • Optimiser le chargement des échantillons, voir Détermination de la charge d'échantillons appropriée pour le protocole Western Blots
    • Réduire la concentration de SDS dans le tampon de transfert
    • Ajouter une deuxième feuille de membrane pour lier l'excès de protéines
    • Essayez d'autres réactifs bloquants, par exemple, l'albumine, la gélatine, la BSA, la caséine ou le lait écrémé en poudre (voir Détergents Bio-Rad et réactifs bloquants et plus de réactifs bloquants)
    • N'utilisez pas de lait pour bloquer les membranes lors de l'utilisation du système avidine-biotine car le lait contient de la biotine
    • Augmenter la durée et/ou le nombre d'étapes de lavage (minimum 5 x 5 min)
    • Utiliser un plus grand volume de tampon de lavage
    • Utiliser un temps d'exposition plus court
    • Utiliser la fonction multi-acquisition sur le logiciel d'acquisition de données
    • Utilisateurs de films :
      • Attendez 5 à 10 minutes, puis réexposez la tache au film (film)
      • Réduire le temps d'exposition et/ou de développement (film)
      • Envisagez de passer à un système d'imagerie numérique tel que Bio-Rad&rsquos ChemiDoc&trade Imaging Systems
      • Assurez-vous que la membrane est bien mouillée au début de la procédure
      • Répétez la procédure en veillant à ce que le blot ne se dessèche pas au cours d'une étape en utilisant des volumes suffisants et en agitant tout au long
      • Assurez-vous que la membrane reste immergée dans les tampons d'incubation et de lavage tout au long de toutes les étapes
      • Utilisez une nouvelle aliquote d'anticorps qui a été stockée à &ndash20°C ou en dessous
      • Si vous stockez un anticorps pendant une très longue période, vous souhaiterez peut-être le stocker à &ndash80°C
      • Faire des aliquotes d'anticorps et ne les décongeler qu'une à la fois selon les besoins pour les transferts
      • Évitez les cycles de gel-dégel répétés
      • Essayez une température d'incubation plus basse telle que 4°C
        Remarque : il faudra augmenter le temps d'incubation
      • Essayez plutôt la nitrocellulose (voir Western Blotting Membranes)
      • Augmenter la rigueur des étapes de lavage :
      • Utilisez du TBS contenant 0,05&ndash0,1% de Tween 20
      • Essayez un détergent plus fort tel que le NP-40
      • Utiliser de nouveaux tampons
      • Filtrez tous les tampons à travers un filtre de 0,2 & microm avant de les utiliser pour le lavage ou le blocage et avant d'ajouter l'anticorps

      Problème : arrière-plan tacheté ou inégal

      • Utiliser un agitateur pendant toutes les étapes d'incubation
      • Assurez-vous que la membrane est bien mouillée au début de la procédure
      • Répétez la procédure en veillant à ce que la tache ne se dessèche pas au cours d'une étape en utilisant des volumes suffisants et en agitant tout au long. Assurez-vous que la tache est toujours immergée
      • Ne pas manipuler la membrane à mains nues. Portez toujours des gants propres et manipulez les taches avec des pinces propres dans la mesure du possible
      • Assurez-vous que l'équipement d'électrophorèse, l'équipement de transfert et les plateaux d'incubation sont propres et exempts de contaminants
      • Évitez de toucher la tache aux surfaces
      • Augmenter le volume du tampon de lavage
      • Utiliser un agitateur pendant toutes les étapes d'incubation et de lavage
      • Éviter d'empiler les blots dans un seul récipient d'incubation
        • Lors de l'empilement de blots dans un seul récipient d'incubation, assurez-vous qu'un flux suffisant de tampon existe entre les blots. Les taches doivent se déplacer librement les unes sur les autres avec agitation pendant les étapes d'incubation et de lavage

        Problème : taches inégales sur fond tacheté ou tacheté

        • Faire tourner l'anticorps secondaire et/ou filtrer pour éliminer les agrégats
        • Assurez-vous que le réactif de blocage est complètement dissous dans le tampon avant utilisation
        • Fabriquer de nouveaux tampons si vous fabriquez un tampon de blocage à partir de réactifs secs
        • Vérifiez les tampons de blocage préfabriqués pour les précipités avant utilisation
        • Ajouter 0.05&ndash0.1% Tween 20 au tampon de blocage
        • Filtrez le tampon de blocage à travers un filtre de 0,2 et microm avant utilisation
        • Wash blot avec tampon de lavage avant incubation avec des anticorps
        • Essayez un autre réactif de blocage, par exemple de l'albumine, de la gélatine, de la BSA, de la caséine ou du lait écrémé en poudre (voir Détergents et réactifs de blocage Bio-Rad et d'autres réactifs de blocage)
        • Retirez toutes les traces résiduelles de gel d'acrylamide de la surface de la membrane après le transfert avant de passer aux étapes en aval
        • Vérifiez que les surfaces de numérisation et de cassette sont propres
        • Utilisez des tampons frais. Faire un nouveau lot de tampon et répéter le blot
        • Tampons filtrants pour le blocage et le lavage à travers un filtre de 0,2 & microm
        • L'emballage des taches dans une pellicule plastique ou des sacs thermosoudés est une bonne protection contre la contamination particulaire et la déshydratation des taches lors de l'étape d'acquisition d'image

        Problème : ombre de la cassette de gel transférée sur blot (buvards de réservoir)

        • Nettoyer ou remplacer les coussinets en mousse
          • Tampons en mousse pour les systèmes de buvardage de réservoir humide Bio-Rad :
            • Mini système Trans-Blot ® (1703933)
            • Buvard Criterion&trade (1704086)
            • Système Trans-Blot (1703914)
            • Système Trans-Blot Plus (1703995)
            • Réduire la quantité de protéines sur le gel
            • Optimiser le chargement des échantillons, voir Détermination de la charge d'échantillons appropriée pour le protocole Western Blots
            • Réduire la quantité de SDS dans le tampon de transfert
            • Ajouter une deuxième feuille de membrane pour lier l'excès de protéines
            • Préparez un nouveau tampon de transfert. Faire un nouveau lot de tampon et répéter le blot
            • Tampons filtrants pour le blocage et le lavage à travers un filtre de 0,2 & microm

            28/02/23 09:30 AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,EST,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN et LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0


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            Voir James H. Abbs, 61 Fed. Rég. 15806 (9 avril 1996) (traçages modifiés sur le contrôle musculaire en changeant d'étiquette, en changeant les niveaux de force et l'échelle), John Hiserodt, 59 Fed. Rég. 14623 (29 mars 1994) (photographies modifiées d'autoradiogrammes), Tetsuya Matsuguchi, 60 Fed. Rég. 58628 (28 novembre 1995) (assombri une bande sur deux autoradiographies et manipulé trois bandes dans l'empreinte d'un immunoblot), et Samar Roy, 64 Fed. Rég. 4108 (27 janvier 1999) (utilisant une exposition différente du même autoradiogramme).

            Voir Michael Ganz, 68 Fed. Rég. 123–124 (2 janvier 2003) (copies topographiquement modifiées de photographies), Bernd Hoffman, 69 Fed. Rég. 8446 (24 février 2004) (suppression d'une bande de poids moléculaire d'une voie et amélioration du mouvement des vésicules le long des microtubules dans un film publié sur Internet), Regina Horvat, 69 Fed. Rég. 35629 (25 juin 2004) (un groupe intensifié dans un Western blot), David Jacoby, 66 Fed. Rég. 35982-35983 (10 juillet 2001) (logiciel utilisé pour intensifier une bande et supprimer les taches d'arrière-plan dans une image), Xiaowu Li, 70 Fed. Rég. 61443 (24 octobre 2005) (cellules cancéreuses de souris faussement signalées comme cellules cancéreuses humaines), Jason Lilly, 70 Fed. Rég. 32619–32620 (3 juin 2005) (deux cellules faussement colorées dans une partie agrandie d'une figure et modifiées les données d'image d'un seul test pour les faire apparaître sous forme de tests multiples), Heather Muenchen, 67 Fed. Rég. 61889 (2 octobre 2002) (manipulations informatiques d'analyses de transfert Western, y compris couper et coller des voies entières pour produire les voies supplémentaires dans un film publié), Tirunelveli Ramalingam, 69 Fed. Rég. 43420-43421 (20 juillet 2004) (masque noir superposé sur une partie d'une figure et dupliqué un panneau et utilisé plusieurs fois dans une image), Clifford Robinson, 71 Fed. Rég. 67870-67871 (24 novembre 2006) (spectres de fluorescence falsifiés et mesures de dichroïsme circulaire dans deux panneaux d'une figure), Kristin Roovers, 72 Fed. Rég. 38836-38837 (16 juillet 2007) (données falsifiées dans dix-neuf panels de données Western blot et dans neuf panels de données immunoblot), Charles Rudick, 69 Fed. Rég. 58445 (30 sept. 2005) (illustrations falsifiées dans Photoshop traitant de traces inédites d'enregistrements électrophysiologiques de courants postsynaptiques), Robert Tracy, 67 Fed. Rég. 36007–36008 (22 mai 2002) (ajout de bandes discrètes là où il y avait eu un frottis uniforme de radioactivité à l'aide d'une image Photoshop d'une impression ImageQuant inaltérable), Rebecca Uzelmeier, 72 Fed. Rég. 16366-16367 (4 avril 2007) (films autoradiographiques falsifiés et fabriqués et images informatiques numérisées à partir de ces films), et Lingjie Zhao, 71 Fed. Rég. 38166-38167 (5 juillet 2006) (assombri une bande sur deux voies de film autoradiographique et falsifié le western blot en assombrissant quatre voies à l'origine du gel).

            Voir NSF 01-18 (le répondant a fabriqué des points de données dans une figure). En 02-41, NSF n'a pas trouvé d'inconduite, bien que l'intimé ait admis avoir fabriqué une image. La recherche n'était pas financée par la NSF à l'époque et son inclusion dans la proposition était prétendument par inadvertance.

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            Lettre rapportant les conclusions du panel d'enquête de Fawwaz Ulaby à Alan Price, datée du 6 août 2001, à la pp. 6. Ces informations sont disponibles via une demande en vertu de la Freedom of Information Act.


            Procédure et stratégies d'optimisation clés pour une méthode d'immunoessai automatisée basée sur l'électrophorèse capillaire

            Un immunoessai capillaire utilisant une plate-forme commerciale pour mesurer les protéines cibles à partir de préparations de protéines totales est démontré. De plus, les paramètres de dosage du temps d'exposition, de la concentration en protéines et de la dilution des anticorps sont optimisés pour un système de modèle de culture cellulaire.

            Résumé

            Les nouvelles technologies qui utilisent des immunoessais capillaires promettent une évaluation plus rapide et plus quantitative des protéines par rapport aux immunoessais traditionnels. Cependant, à l'instar d'autres dosages de protéines à base d'anticorps, l'optimisation des paramètres de dosage immunologique capillaire, tels que la concentration de protéines, la dilution des anticorps et le temps d'exposition, est une condition préalable importante à la génération de données significatives et fiables. Les mesures doivent se situer dans la plage linéaire du dosage où les changements de signal sont directement proportionnels aux changements de concentration de lysat. Le processus de choix des concentrations de lysat, des dilutions d'anticorps et des temps d'exposition appropriés dans la lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine, BEAS-2B, est démontré ici. La linéarité du test est montrée sur une gamme de concentrations de protéines d'extraits de cellules entières avec des anticorps p53 et α-tubuline. Un exemple d'épuisement du signal est observé aux concentrations les plus élevées avec des temps d'exposition longs, et une courbe de dilution d'anticorps α-tubuline est montrée démontrant la saturation. De plus, des exemples de résultats expérimentaux sont rapportés pour des cellules traitées à la doxorubicine en utilisant des paramètres optimisés.

            Introduction

            Les dosages immunologiques par électrophorèse capillaire mesurent l'expression des protéines dans les lysats cellulaires à l'aide de systèmes de séparation de taille ou de charge et offrent plusieurs avantages par rapport aux dosages immunologiques traditionnels. Par exemple, par rapport au western blot, la procédure automatisée à base de capillaires élimine le besoin de gels, de dispositifs de transfert et de lavages manuels. De plus, la quantité absolue de protéines requise est environ 10 fois moindre, ce qui rend les systèmes à base de capillaires idéaux pour une utilisation avec des types de cellules rares ou un échantillon limité 1 , 2 . Les résultats sont obtenus en aussi peu que 3 h à l'aide de systèmes automatisés et il a déjà été démontré qu'ils étaient plus quantitatifs et reproductibles que les procédures conventionnelles de western blot 3 , 4 , 5 . Le processus des dosages basés sur la taille consiste à charger des échantillons contenant du dodécyl sulfate de sodium (SDS), du dithiothréitol (DTT) et des marqueurs de poids moléculaire marqués par fluorescence dans des colonnes capillaires contenant des matrices d'empilement et de séparation. La tension appliquée aux capillaires sépare les protéines des échantillons en fonction de leur taille, et la lumière UV immobilise les protéines séparées sur la paroi capillaire. Le capillaire est ensuite immuno-sondé avec un anticorps primaire spécifique de la cible et un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP). Le luminol et le peroxyde catalysent la génération de lumière chimiluminescente qui est mesurée par une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) et analysée pour quantifier les protéines.

            Malgré la facilité et la vitesse relatives d'une plate-forme de dosage immunologique électrophorétique automatisée à base de capillaires, l'optimisation des conditions de dosage telles que la concentration en protéines, la dilution des anticorps et le temps d'exposition est importante pour obtenir des résultats précis et reproductibles. En général, les procédures suivantes doivent être effectuées pour optimiser un dosage pour ces systèmes :

            1) Un criblage doit être effectué pour évaluer et choisir les anticorps pour le signal et la spécificité à la cible protéique. Si disponible, une protéine purifiée ou un épitope cible peut être utilisé pour évaluer la spécificité, cependant, il est toujours important d'évaluer le signal non spécifique potentiel dans la protéine totale provenant du système modèle.

            2) Ensuite, la plage dynamique du dosage doit être déterminée. Dans une situation idéale, un doublement du signal (mesuré à l'aide de l'aire de pic) est observé lorsque la concentration de l'échantillon est doublée, cependant, en pratique, un changement proportionnel du signal à entrer de manière prévisible (par exemple., ajustement linéaire) est suffisant pour la quantification des protéines. De plus, cette optimisation définira la concentration de protéines avec un signal élevé mais toujours dans la plage linéaire pour le modèle expérimental.

            3) Déterminer la concentration d'anticorps optimale en utilisant la concentration de protéine fixe choisie à l'étape d'optimisation 2. À mesure que la concentration d'anticorps augmente, le signal augmente jusqu'à ce qu'il atteigne un plateau à saturation. Une concentration d'anticorps proche de ce niveau de saturation est requise pour une mesure précise de la concentration en protéines.

            Le processus utilisé pour optimiser les concentrations de protéines, les dilutions d'anticorps et les temps d'exposition pour un dosage automatisé de la taille des capillaires 6 est démontré à l'aide d'extraits de cellules entières isolés de BEAS-2B, une lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine transformée par SV-40. L'isolement des protéines à partir d'extraits cellulaires ou tissulaires peut être effectué à l'aide d'un certain nombre de protocoles publiés 7, 8, 9 et ne sera pas couvert ici. Les résultats d'une expérience d'essai utilisant les conditions optimisées sont également rapportés pour la p53 totale et phosphorylée (sérine 15, sérine 20) dans des cultures exposées à la doxorubicine (un agent chimiothérapeutique courant qui induit l'apoptose cellulaire 10 ) à 1,2, 1,8 et 2,4 µg /mL de milieu pendant 4 h avant la récolte. Les aires de pic de p53 sont normalisées à la ɑ-tubuline, qui est utilisée comme contrôle de charge.

            Protocole

            REMARQUE : Assurez-vous que tous les réactifs et échantillons sont préparés conformément au protocole du fabricant, décrit ci-dessous. Veuillez porter un équipement de protection individuelle approprié pendant cette procédure, qui comprend des gants en nitrile, une blouse de laboratoire, des chaussures fermées et des lunettes de sécurité. Un tableau des matériaux, réactifs et équipements spécifiques requis est fourni séparément. La concentration totale en protéines des échantillons doit être déterminée au préalable en utilisant des méthodologies établies qui sont compatibles avec le tampon de lysat utilisé, comme le test Bradford 11 .

            1. Préparation des échantillons et des réactifs à partir du pack standard fourni par le fabricant

            1. Pour préparer la solution de travail 400 mM de dithiothréitol (DTT), ajouter 40 µL d'eau déminéralisée dans le tube transparent contenant le stock fourni par le fabricant. Il est important d'éviter d'introduire des bulles dans la solution en mélangeant la solution avec un pipetage lent et doux.
            2. Ajouter 20 µL de tampon d'échantillon 10X et 20 µL de la solution DTT 400 mM préparée au tube rose contenant le master mix 5X fluorescent (voir le Table des matières).
              REMARQUE : Le Master Mix (MM) est scellé par le fabricant avec un couvercle en aluminium et doit être percé par une pointe de pipette. Mélanger doucement par pipetage lent pour éviter les éclaboussures de DTT dans la pipette.
            3. Ensuite, ajoutez 16 µL d'eau déminéralisée, 2 µL de tampon d'échantillon 10X fourni et 2 µL de la solution DTT 400 mM préparée au tube échelle biotinylé blanc fourni par le fabricant. Mélanger doucement et transférer dans un tube de 0,6 mL pour dénaturer.
            4. Préparez un tampon d'échantillon 0,1x en diluant la solution 10X fournie à 1:100 avec de l'eau. Préparez suffisamment de tampon d'échantillon 0,1x pour diluer tous les échantillons.
            5. Calculez la quantité de tampon d'échantillon 0,1x qui est ajoutée à un échantillon, qui dépendra de la concentration finale souhaitée de la protéine totale. Mélanger 1 partie 5x fluorescent MM avec 4 parties d'échantillon dilué pour atteindre la concentration finale souhaitée en protéines.
              1. Calculez les volumes comme suit : (i) Volume 5x MM fluorescent = (Concentration finale souhaitée en protéines)/5 (ii) Volume de stock de protéines = (Concentration finale souhaitée en protéines x Volume total nécessaire)/Concentration du stock de protéines (iii) Volume 0,1x échantillon tampon = Volume total - Volume 5x MM - Volume du stock de protéines.

              2. Dénaturation des échantillons et de l'échelle

                Placer les échantillons préparés et l'échelle biotinylée dans un bloc chauffant à 95 °C pendant 5 min. Tubes Vortex immédiatement après l'incubation, exécutez une rotation pour

              3. Préparation des anticorps

              1. Comme déterminé par l'optimisation (voir Résultats représentatifs et vidéo), préparer la ou les dilutions souhaitées d'anticorps primaire (par exemple., 1:50, 1:100) dans le diluant d'anticorps fourni 2.
                REMARQUE : Les anticorps sont généralement utilisés à des concentrations plus élevées pour le dosage immunologique capillaire que pour le transfert western traditionnel. L'anticorps secondaire fourni est prêt à l'emploi sans dilution.

              4. Préparation de Luminol-S et de peroxyde

              1. Préparez un mélange 1:1 de luminol-S et de peroxyde.
              2. Vortex pour mélanger et conserver sur de la glace.
                REMARQUE : Il est important que ce mélange soit préparé frais pour chaque essai expérimental. Un mélange total de 250 ul est nécessaire pour faire fonctionner une assiette pleine.

              5. Préparation de la plaque de dosage

              1. Comme représenté sur la Figure 1, chargez les échantillons et réactifs préparés ci-dessus dans la plaque de dosage. Voir les instructions détaillées ci-dessous pour chaque ligne. Pour minimiser l'évaporation des puits, assurez-vous que le couvercle de la plaque est remis en place entre les ajouts de réactifs.
              2. Dans la rangée A, pipeter 5 µL d'échelle biotinylée dans le godet A1. Pour la rangée restante, pipeter les échantillons préparés (5 µL chacun) dans les puits A2-A25.
                REMARQUE : Il est impératif que le puits A1 contienne toujours une échelle, car le premier capillaire de la cartouche est optimisé pour exécuter cette norme.
              3. Dans la rangée B, pipeter 10 µL d'Antibody Diluent 2 dans chaque puits (B1-B25).
              4. Dans la rangée C, pipeter 10 µL d'Antibody Diluent 2 dans le godet C1. Dans les puits C de la rangée restante, pipeter 10 181 L d'anticorps primaire (puits C2-C25).
              5. Dans la rangée D, pipeter 10 µL de Streptavidin-HRP dans le godet D1. Dans les puits de la rangée D restants, pipeter 10 181 L d'anticorps secondaire (puits D2-D25).
              6. Dans la rangée E, pipeter 10 µL du mélange luminol-peroxyde fraîchement préparé dans chaque puits (E1-E25).
              7. Enfin, ajoutez 500 µL de tampon de lavage par compartiment à chacune des 3 premières rangées de puits de tampon.
                REMARQUE : Il est important de minimiser la formation de bulles en pipetant doucement et en n'expulsant pas le volume final de la pointe, car les bulles peuvent interférer avec le chargement et l'exécution des capillaires.
              8. Une fois tous les puits chargés, centrifuger la plaque à


              Figure 1. Gabarit de pipetage pour plaque de dosage. Le codage couleur représente les réactifs et les échantillons appropriés (jusqu'à 24 au total) ajoutés à la plaque de dosage. Ajouter l'échelle biotinylée au puits A1 (orange), les échantillons préparés des puits A2 à A25 (bleu clair), le diluant d'anticorps 2 aux puits B1-B25 et C1 (vert clair), l'anticorps primaire aux puits C2 à C25 (bleu), streptavidine-HRP dans le puits D1 (rose foncé), anticorps secondaire dans les puits D2 jusqu'à D25 (vert foncé) et mélange luminol-peroxyde dans les puits E1 jusqu'à E25 (violet). Le tampon de lavage est ajouté aux trois premières rangées des plus grands puits de la plaque médiane (bleu foncé). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

              6. Démarrage de l'instrument de dosage immunologique capillaire

              1. Assurez-vous que l'instrument et l'ordinateur qui l'accompagne sont allumés. Aucun temps de préchauffage n'est nécessaire.
              2. Ouvrez le logiciel d'instrumentation sur l'ordinateur. Tout d'abord, sélectionnez l'onglet "Assay" sur la droite de la fenêtre et "New Assay" sous le "Menu Fichier" sur la gauche. Sélectionnez la taille, la gamme de taille (par exemple., 12-230 kDa) et le type de cartouche (par exemple., 25 capillaire) qui a été utilisé pour le dosage particulier.
                REMARQUE : On peut également entrer des paramètres de dosage, y compris la concentration de protéines, le type d'anticorps et la dilution, si désiré, mais ceux-ci ne sont pas nécessaires pour démarrer le dosage.
              3. Ouvrez la porte de l'instrument en appuyant sur le bouton situé en haut du panneau orange.
              4. Retirez délicatement la cartouche capillaire de son emballage. Sans toucher les capillaires en verre eux-mêmes, placez la cartouche dans le porte-cartouche. Vérifiez l'assise de la cartouche en observant le changement de lumière intérieure de l'orange au bleu.
              5. Tenez fermement la plaque sur le banc et retirez soigneusement le joint d'évaporation de la partie inférieure de la plaque. Faites éclater toutes les bulles observées dans ces puits de matrice de séparation avec une petite pointe de pipette ou une aiguille propre (par exemple., aiguille stérile de calibre 25 "rep top").
              6. Placer la plaque de dosage sur le support de plaque, en s'assurant qu'elle est bien en place, et fermer la porte de l'instrument.
              7. Cliquez sur le bouton "Start" dans le logiciel.
                REMARQUE : si aucun bouton Démarrer n'apparaît, la connexion avec l'instrument a été perdue. Choisissez Instrument dans le menu en haut à gauche, puis Connecter. Une fenêtre contextuelle devrait apparaître avec le numéro de série de l'instrument, sélectionnez-le, puis cliquez sur Connecter. Le bouton Démarrer devrait maintenant apparaître.
              8. Une fois l'analyse terminée, jetez la plaque. Retirez la cartouche et placez-la dans un conteneur pour objets tranchants pour l'élimination, avec toutes les aiguilles qui ont pu être utilisées pour faire éclater des bulles. Laissez l'appareil sous tension pour éviter les problèmes de connexion si l'instrument est utilisé régulièrement (par exemple., au moins une fois par semaine).
              1. Avant l'analyse, assurez-vous que les contrôles de qualité suivants sont effectués.
                1. Vérifiez les étalons fluorescents en sélectionnant l'icône "Afficher les étalons". Vérifiez que les normes sont correctement identifiées dans l'onglet "Graph View". S'ils sont incorrects, accédez à l'icône "Single View", faites un clic droit sur le pic correct et sélectionnez "Force Standard", ou cliquez avec le bouton droit sur le pic incorrect et sélectionnez "Not a Standard". Effectuez ce contrôle pour chaque nouveau capillaire.
                2. Vérifiez l'échelle biotinylée en cliquant sur les icônes "Samples" et "Single View". Sélectionnez l'échelle dans l'onglet Expérience. Si un pic est mal identifié, cliquez dessus avec le bouton droit dans "Graph View" et sélectionnez "Remove Peak".
                  REMARQUE : Par exemple, l'échelle biotinylée utilisée pour le kit 12 - 230 kDa doit afficher des pics de dimensionnement de 12, 40, 66, 116, 180 et 230 kDa. Si cette étape n'est pas effectuée, le dimensionnement des pics de l'échantillon sera mal calculé, produisant des résultats erronés.
                3. Affichez et analysez les pics d'échantillons. Dérivez les données du tableau des pics, y compris le poids moléculaire, la surface du pic, la hauteur du pic et le signal sur bruit (S/N), selon les besoins pour les calculs expérimentaux.

                Résultats représentatifs

                Temps d'exposition - Détermination de l'épuisement du signal

                L'épuisement du signal peut se produire lorsque le substrat de luminol et de peroxyde s'épuise trop rapidement. Ceci peut être déterminé en examinant les données à différents temps d'exposition à la chimiluminescence. Dans le logiciel d'analyse, accédez à "Edit -> Analysis -> Images". Les expositions vont de 5 à 480 s. L'axe des y dans un électrophérogramme indique le signal/temps, de sorte que les données de chaque exposition doivent avoir un coefficient signal/temps similaire. Ce coefficient diminue avec des expositions séquentiellement plus longues si le luminol s'épuise, comme on le voit avec l'anticorps p53 DO-1 (Figure 2). En raison de l'épuisement du substrat, ce test peut être considéré comme mesurable jusqu'à la concentration de 0,2 µg/µL uniquement aux expositions de 5 à 30 s. Par conséquent, dans cet exemple, 15 s ont été déterminés comme étant le temps d'exposition optimal pour l'analyse des données pour p53.

                Titrage du lysat - Détermination de la plage dynamique linéaire

                Il est important que les mesures soient prises dans la plage dynamique linéaire de chaque test, où les changements de signal mesurés par la surface du pic sont proportionnels aux changements de la quantité de protéine dans l'échantillon. En utilisant le temps d'exposition optimal de 15 s choisi dans la section précédente, la linéarité du dosage est démontrée pour la p53 et la ɑ-tubuline sur une plage de concentration supérieure à 15 fois (figure 3). D'après notre expérience, une valeur R 2 de &# 620,9 d'un ajustement de régression linéaire est considérée comme acceptable pour une plage de dilution de protéine purifiée de quantité connue (si le dosage est une mesure quantitative absolue) ou de lysat d'échantillon de protéine cible inconnue (si le dosage est une mesure quantitative relative).

                Optimisation de la dilution des anticorps

                L'utilisation d'anticorps à des concentrations saturantes permet de garantir que tous les changements de signal mesurés sont dus uniquement à des changements dans la quantité de protéines. À titre de démonstration, deux extraits de cellules entières de la lignée cellulaire BEAS-2B (0,2 µg/µL de protéine totale chargée dans le test) ont été sondés avec des concentrations d'anticorps ɑ-tubuline dilués en série allant de 1:25 à 1:800 (Figure 4). Le signal chimiluminescent (ici, mesuré en tant qu'aire de pic) a été tracé en fonction de la dilution de l'anticorps. La saturation a été observée près de la dilution 1:50 où la courbe commence un plateau notable.

                Essai expérimental - Traitement à la doxorubicine dans des cellules BEAS-2B

                En utilisant des conditions de dosage optimisées, la culture cellulaire BEAS-2B a été traitée avec trois concentrations différentes de doxorubicine (1,2, 1,8 et 2,4 µg/mL) pendant 4 h (Figure 5, Tableau 1). L'activation de p53 par des modifications post-traductionnelles médie plusieurs réponses cellulaires, y compris l'arrêt du cycle cellulaire, la sénescence et l'apoptose 12 . Plus précisément, la phosphorylation de la sérine 15 a été attribuée à l'activation transcriptionnelle de p53, entraînant l'apoptose après traitement à la doxorubicine 13 . Dans cette démonstration, les zones de pic normalisées à la ɑ-tubuline sont présentées comme un pli de contrôle. Fait intéressant, des augmentations de 3,5 à 4 fois de la phosphorylation de p53 à la sérine 15 et des augmentations de 2 fois du niveau de p53 phosphorylée à la sérine 20 ont été observées après 4 h d'exposition à la doxorubicine. Ces résultats indiquent une activation de p53 cependant, aucune dose-réponse n'est observée pour les concentrations choisies (à l'inverse, la dose la plus faible testée a provoqué la réponse la plus élevée). La p53 totale n'a pas démontré de réponse claire au traitement dans ce système modèle. Nous avons déjà observé l'activation de la phosphorylation de p53 en l'absence d'augmentation des niveaux de p53 totale dans des conditions similaires dans des cellules BEAS-2B 14 traitées au zinc.


                Figure 2. Comparaison d'images d'exposition pour détecter l'épuisement du signal. Les vues de voie montrent des concentrations de protéines décroissantes pour les lysats de BEAS-2B sondés avec l'anticorps p53 DO-1 à une dilution de 1:500. Les coefficients de signal de chimiluminescence, rapportés sous forme de hauteurs de pic dans le logiciel de l'instrument, sont superposés. Contrairement aux hauteurs de pic, les intensités des bandes visuelles sont automatiquement générées et ajustées par l'instrument pour faciliter la visualisation des bandes et ne sont pas comparables d'un panneau à l'autre. Notez la diminution du signal de chimiluminescence à mesure que le temps d'exposition augmente, le signal commençant à disparaître (pic divisé) aux deux expositions les plus longues, indiquant l'épuisement du substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


                figure 3. Titrage du lysat montrant les vues des voies. Titrage de lysat montrant les vues des voies (UNE) de lysat BEAS-2B lorsqu'il est sondé avec 1:500 p53 DO-1 ou 1:50 ɑ-tubuline. Contrairement aux valeurs de la zone de pic, les intensités des bandes visuelles sont générées et ajustées automatiquement par l'instrument pour faciliter la visualisation des bandes et ne sont pas comparables d'un panneau à l'autre. Analyse de régression linéaire (B) confirme que les dosages sont linéaires sur toute la plage testée, de 0,01 à 0,20 µg/µL et de 0,025 à 0,40 µg/µL, avec des valeurs R 2 de 0,999 et 0,985, respectivement. Les concentrations totales de protéines au milieu de la plage linéaire ont été choisies pour tenir compte des variations potentielles de protéines cibles dans les deux sens (par exemple., 0,2 µg/µL pour α-tubuline). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


                Figure 4. Courbes de dilution d'anticorps antitubuline pour deux lysats de protéines BEAS-2B distincts avec et sans normalisation de la ligne de base. Un écart certain par rapport à la linéarité est observé à la dilution 1:50 (0,02), indiquant une saturation. 1:50 a donc été choisi comme dilution optimale pour cet anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


                Figure 5.Effet d'un traitement de 4 h à la doxorubicine (DXN) sur l'expression de la protéine p53 phosphorylée totale et à la sérine des cellules BEAS-2B. Les zones de pic sont normalisées à la tubuline α et tracées en tant que pli de contrôle (CTL). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


                Tableau 1. Effet d'un traitement de 4 h à la doxorubicine (DXN) sur l'expression de la protéine p53 phosphorylée totale et à la sérine des cellules BEAS-2B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce tableau.

                Discussion

                Pendant des décennies, le développement de méthodes d'immunodosage à base d'électrophorèse capillaire a suscité un intérêt soutenu en raison de la faible consommation d'échantillons et de réactifs, d'un temps de traitement réduit par rapport aux méthodes traditionnelles et d'une compatibilité élevée pour automatiser la procédure 4, 15. Il existe un certain nombre de protocoles différents pour la séparation des protéines qui ont utilisé des capillaires, y compris des méthodes électrophorétiques, électrocinétiques, de tamisage de polymère et isoélectriques, qui isolent les protéines par différentes propriétés (respectivement, charge électrostatique, équilibre de partition, propriétés de tamisage de la matrice de séparation , et pH) 16 . Ici, nous décrivons une méthode d'électrophorèse capillaire à base d'anticorps (ou immunoessai), en utilisant une séparation par tamisage de polymère, qui a été automatisée et commercialement adoptée 3 . Les avantages de ce système incluent la facilité d'utilisation et de fonctionnement, des réactifs standardisés et disponibles dans le commerce, et des mesures fiables et sensibles qui nécessitent moins de réactifs et d'échantillons par rapport aux dosages de protéines traditionnels tels que le western blot, le dosage immunoenzymatique et d'autres formats 3 , 4 , 5 . Il a été noté dans les évaluations précédentes de cette technologie que la gamme de tailles de protéines pouvant être évaluées a été limitée par la matrice de séparation disponible 4 , cependant des offres récentes ont élargi la gamme mesurable de 2 à 440 kDa 17 . De plus, certains tampons de lysat sont connus pour être incompatibles avec le dosage 18, donc la sélection des réactifs expérimentaux utilisés doit être envisagée au préalable.

                Un avantage majeur d'une procédure automatisée avec des composants disponibles dans le commerce est la cohérence des résultats grâce à des méthodes et des réactifs standardisés. Cela minimise les risques d'échec du test en automatisant les étapes critiques de la procédure. Cependant, il est important de noter que certaines pratiques doivent être respectées pendant le protocole pour minimiser les problèmes avec le dosage immunologique basé sur l'électrophorèse capillaire. Premièrement, il est essentiel que le mélange luminol-S/peroxyde soit préparé frais et immédiatement avant le chargement de la plaque. Une synchronisation cohérente entraînera une luminescence cohérente après l'ajout de l'agent oxydant, ce qui entraînera des mesures cohérentes pour un test d'anticorps particulier après le test. En outre, il est important que des réactifs non périmés soient utilisés, ce qui affecte principalement la puissance de l'agent oxydant. De plus, il est important que l'ordre de chargement des échantillons, anticorps et autres réactifs soit strictement respecté (voir Figure 1). Tout réactif pipeté hors de sa place entraînera un échec du test et une analyse perdue.

                Outre ces étapes critiques, les principaux problèmes rencontrés avec la technique peuvent généralement être surmontés grâce à l'optimisation. En effet, ces conditions sont spécifiques à chaque combinaison système/anticorps modèle et doivent donc être déterminées empiriquement pour chaque nouveau dosage. Dans cet article, nous nous concentrons sur trois procédures d'optimisation courantes : le temps d'exposition, le titrage du lysat et la dilution des anticorps primaires. La capacité à générer des résultats mesurables dépend de l'analyse d'un temps d'exposition lorsque le substrat de luminol ne s'épuise pas rapidement, car l'épuisement du substrat entraîne une perte de signal. Le titrage du lysat détermine la plage dynamique linéaire de chaque test, qui peut différer avec différents systèmes modèles, ainsi qu'avec différents anticorps, même pour la même cible protéique. Les dilutions d'anticorps choisies à des concentrations saturantes ou proches de celles-ci garantissent que les changements de signal ne seront pas affectés par une pénurie d'anticorps libres, mais uniquement par une quantité différente d'épitope cible de protéine disponible. D'autres considérations au cours du processus d'optimisation peuvent inclure le temps d'incubation des anticorps et le temps d'empilement/de chargement des échantillons. Dans la plupart des cas, les paramètres par défaut de l'instrument offrent le meilleur équilibre entre résolution et sensibilité. Cependant, dans certains cas, une mauvaise résolution ou sensibilité peut être améliorée en ajustant ces paramètres.

                Les méthodes de dosage immunologique basées sur l'électrophorèse capillaire fournissent des mesures de protéines rapides, efficaces et reproductibles. Bien que ces méthodes aient été principalement utilisées dans des contextes de recherche et de développement, la cohérence de ces technologies a une utilité potentielle dans les applications réglementaires et cliniques. Par exemple, l'identification de sous-populations sensibles aux toxiques environnementaux ou de patients présentant une progression de la maladie peut être basée sur des biomarqueurs protéiques mesurés dans des matrices accessibles, telles que le sang, l'urine et la salive. À mesure que les coûts des réactifs et des opérations baissent et que le nombre d'échantillons et de cibles pouvant être évalués simultanément augmente, nous verrons probablement des méthodes de dosage immunologique basées sur l'électrophorèse capillaire utilisées pour ces types d'applications.

                Divulgations

                Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents. Ce manuscrit a été examiné par le Laboratoire national de recherche sur les effets sur la santé et l'environnement et approuvé pour publication. Le contenu ne reflète pas nécessairement les points de vue de l'US EPA et la mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation d'utilisation.

                Remerciements

                Les auteurs tiennent à remercier Keith Tarpley de l'équipe graphique et média du Bureau de la recherche et du développement de l'US EPA-Research Triangle Park (ORD-RTP) pour le développement, l'enregistrement et l'édition de la vidéo d'instruction. Nous tenons également à remercier Deborah Pritchett de ProteinSimple pour les conversations utiles concernant l'optimisation de nos données. JM Guynn a été soutenu par l'Oak Ridge Institute for Science and Education Research/Participation Program de l'Environmental Protection Agency des États-Unis.


                DISCUSSION

                Le transport actif des ions Na + et K + à travers la membrane plasmique, une tâche importante effectuée par la pompe Na + /K +, est essentiel pour le maintien du potentiel de repos membranaire et la régulation de l'activité électrique des neurones (Therien et Blostein, 2000). Par conséquent, la modification du courant généré par la pompe Na + /K + affecte les propriétés physiologiques des neurones. Cette étude est en ligne avec nos précédentes investigations sur l'effet de 10 mT SMF sur l'activité de la pompe Na + /K + (Nikolić et al., 2012) et démontre en outre que l'expression de la pompe Na + /K + dans la membrane plasmique la surface et la densité de courant de pompe sont modifiées après exposition des neurones d'escargot à 10 mT de SMF.

                La régulation à court terme de l'activité des pompes Na + /K + par phosphorylation et déphosphorylation est obtenue en modifiant les propriétés fonctionnelles (par exemple le taux de renouvellement) des pompes déjà présentes au niveau de la membrane plasmique, ainsi qu'en modulant la pompe Na + /K + expression à la surface cellulaire (Therien et Blostein, 2000). Ce dernier est accompli en recrutant un pool de protéines intracellulaires de la pompe à la membrane plasmique, et par l'internalisation du pool associé à la membrane plasmique (Barlet-Bas et al., 1990 Chibalin et al., 1999 Gonin et al., 2001 Budu et al., 2002 Efendiev et al., 2003 Vinciguerra et al., 2003 Efendiev et al., 2007). Nos découvertes précédentes (Nikolić et al., 2012) et les résultats obtenus dans la présente étude indiquent que l'augmentation induite par le SMF de l'activité de la pompe Na + /K + peut être médiée par des mécanismes à court terme de régulation de l'activité de la pompe. Nos résultats suggèrent que le SMF a agi pour redistribuer la pompe Na + /K + des compartiments intracellulaires vers la membrane plasmique, car l'expression de la sous-unité de la pompe Na + /K + était significativement augmentée dans la zone de la membrane plasmique alors qu'elle montrait une tendance vers une diminution du cytoplasme. Sur la base de nos découvertes précédentes (Nikolić et al., 2012), un tel effet de SMF pourrait être médié par des voies de signalisation de phosphorylation et de déphosphorylation qui régulent l'expression de la pompe Na + /K + au niveau de la membrane plasmique. En fait, nos données indiquent qu'une augmentation de 13% de l'expression de la sous-unité de la pompe Na + /K + au niveau de la membrane plasmique ne pourrait pas être seule responsable de l'augmentation de 57% de la densité de courant de pompe Na + /K + observée. après 10 mT d'exposition au SMF. Cet écart pourrait donc être attribué aux processus de phosphorylation et de déphosphorylation susmentionnés (Nikolić et al., 2012) qui ont directement affecté l'activité des pompes déjà présentes dans la membrane plasmique. Des données antérieures ont montré qu'une exposition de 15 minutes à un SMF modéré suivi d'une récupération de 30 minutes et d'un jour provoquait des changements importants dans l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire dans la lignée cellulaire embryonnaire humaine et les neurones de rat hippocampique en culture, respectivement (Hirai et al., 2002 Wang et al., 2009). Dans nos expériences, l'expression globale de la sous-unité de la pompe Na + /K + n'était pas significativement modifiée après 15 min d'exposition à 10 mT de SMF. Ces résultats pouvaient être anticipés, car l'expression de la sous-unité de la pompe Na + /K + dans notre étude a été analysée immédiatement après la cessation de l'exposition de 15 min à 10 mT SMF.

                La distribution de la sous-unité de la pompe Na + /K + dans la zone de la membrane plasmique ainsi que la densité de courant de pompe dans les neurones exposés à 10 mT SMF ont été décrites avec l'ajustement gaussien unique. En comparaison, la somme de deux ajustements gaussiens était nécessaire pour décrire la distribution de la sous-unité de pompe Na + /K + dans la zone de la membrane plasmique et la densité de courant de pompe dans les neurones de contrôle, indiquant que la population de neurones de contrôle est composée de deux groupes. Ainsi, l'augmentation induite par le SMF de l'expression de la sous-unité de la pompe Na + /K + dans la zone de la membrane plasmique et l'augmentation des courants liés à la pompe ont rendu la population de neurones homogène. Par rapport aux données d'immunofluorescence, les deux groupes de neurones témoins étaient clairement distinguables au niveau électrophysiologique. La capacité de distinguer clairement les groupes de neurones de contrôle en fonction de leur densité de courant de pompe Na + /K + pourrait être attribuée aux processus de phosphorylation et de déphosphorylation qui régulent les propriétés fonctionnelles des pompes déjà présentes au niveau de la membrane plasmique. De plus, on peut affirmer que les neurones de contrôle ont des compositions différentes d'isoformes fonctionnelles de la sous-unité α de la pompe Na + /K +. Les isoformes de la sous-unité α des invertébrés et des vertébrés ont des propriétés similaires, à savoir que les isoformes de la sous-unité des deux diffèrent par leur sensibilité aux inhibiteurs de la pompe Na + /K + et les concentrations d'ions Na + et K + (Cortas et al., 1989 Blanco et Mercer, 1998). Bien qu'il n'y ait pas de connaissances détaillées sur les isoformes de la sous-unité de la pompe Na + /K + dans le système nerveux des escargots, sur la base des données existantes (Cortas et al., 1989 Blanco et Mercer, 1998), il serait raisonnable de supposer que les neurones d'escargot expriment différentes isoformes de la sous-unité de la pompe Na + /K + qui présentent certaines similitudes avec les isoformes de la sous-unité dans les neurones des mammifères. Il a été montré que les neurones des mammifères expriment les isoformes α1 et 3 de la sous-unité catalytique de la pompe Na + /K + (Hieber et al., 1991 Watts et al., 1991 Pietrini et al., 1992 Brines et Robbins, 1993). De plus, des recherches antérieures ont révélé un regroupement de différents types et même de sous-types de neurones de mammifères en fonction de leur densité de courant de pompe Na + /K + (Dobretsov et al., 1999a Anderson et al., 2010). Nos données sont en accord avec ces résultats car nous avons identifié deux groupes de neurones d'escargot (C1 et C2) différenciés par le niveau de réponse à l'ouabaïne. Cependant, la corrélation des réponses des groupes neuronaux C1 et C2 assignés arbitrairement avec le type neuronal spécifique nécessite une étude électrophysiologique plus approfondie. De plus, nos résultats révèlent que les groupes neuronaux C1 et C2 ont répondu différemment au SMF 10 mT appliqué, car l'augmentation induite de la densité de courant Na + /K + n'était significative que dans la population de neurones C1. Néanmoins, l'effet global de SMF était une augmentation significative de la densité de courant de pompe Na + /K + dans la population totale de neurones examinés (C1 avec C2). Nous n'avons pu observer aucune différence dans la résistance membranaire et la taille neuronale entre les groupes de neurones C1 et C2. De plus, les données obtenues ne nous ont pas permis d'identifier les groupes C1 et C2 en tant que neurones d'une activité et d'une fonction bioélectriques particulières dans le système nerveux de l'escargot. Dans cette étude, nous avons examiné l'expression de l'isoforme Na + /K + pompe α1, qui s'est avérée être une isoforme dominante dans le système nerveux central du rat (Watts et al., 1991). Cependant, des données antérieures ont également montré que les neurones de mammifères exprimant l'isoforme α1 expriment également l'isoforme de pompe 3 Na + /K + dans leur membrane plasmique (Dobretsov et al., 1999b Matsumoto et al., 2011). Par conséquent, nous suggérons que des réponses clairement séparées des neurones d'escargot C1 et C2 à l'ouabaïne sont associées à des isoformes de la sous-unité α de la pompe Na + /K + coexprimées combinées dans différents rapports dans la membrane plasmique de ces neurones. Ainsi, il est possible de spéculer que la sensibilité différente des groupes neuronaux C1 et C2 à 10 mT SMF peut être liée à une isoforme de pompe Na + /K + particulière. Cette hypothèse peut être étayée par une étude plus approfondie de l'expression de différentes isoformes de la sous-unité α de la pompe Na + /K + dans les neurones de l'escargot.

                Effets différentiels de 10 mT SMF sur la densité de courant de pompe Na + /K + dans des neurones d'escargot isolés. (A) Panneau de gauche : traces représentatives d'enregistrements de voltage-clamp de cellules entières provenant de neurones de contrôle d'environ la même taille (capacité membranaire Cm≈45 pF) montrant des réponses de courant entrant variables sensibles à l'ouabaïne à l'application de 100 μmol l -1 d'ouabaïne (barre noire, OB). Potentiel de maintien, -50 mV. Panneau de droite : la densité de courant de pompe Na + /K + des neurones de contrôle est mieux ajustée par la somme des deux distributions gaussiennes (R 2 = 0,81). Notez que les neurones de contrôle sont clairement séparés selon le courant d'inhibition de la pompe Na + /K + dans un groupe présentant une faible densité de courant (marqué arbitrairement C1, 0,16 ± 0,01 pA pF -1 , N=10) et des neurones présentant un pic de densité de courant important (marqué arbitrairement C2, 0,28±0,01 pA pF -1 , N=8).(B) Panneau de gauche : trace représentative d'enregistrements de tension-clamp de cellule entière de la réponse de courant sensible à l'ouabaïne provoquée par l'application de 100 mol l -1 d'ouabaïne (barre noire, OB) dans un neurone exposé à 10 mT SMF (Cm=25pF). Potentiel de maintien, -50 mV. Panneau de droite, la densité de courant de pompe Na + /K + des neurones exposés au SMF est mieux adaptée par une distribution gaussienne unique (R 2 = 0,96). (C) La densité de courant de pompe Na + /K + calculée est significativement différente entre les neurones de contrôle C1 (N=10) et les neurones exposés au SMF (N= 13), et entre les neurones C1 et les neurones C2 (N=8) (*P<0.05, ANOVA sur les rangs).

                Effets différentiels de 10 mT SMF sur la densité de courant de pompe Na + /K + dans des neurones d'escargot isolés. (A) Panneau de gauche : traces représentatives d'enregistrements de voltage-clamp de cellules entières provenant de neurones de contrôle d'environ la même taille (capacité membranaire Cm≈45 pF) montrant des réponses de courant entrant variables sensibles à l'ouabaïne à l'application de 100 μmol l -1 d'ouabaïne (barre noire, OB). Potentiel de maintien, -50 mV. Panneau de droite : la densité de courant de pompe Na + /K + des neurones de contrôle est mieux ajustée par la somme des deux distributions gaussiennes (R 2 = 0,81). Notez que les neurones de contrôle sont clairement séparés selon le courant d'inhibition de la pompe Na + /K + dans un groupe présentant une faible densité de courant (marqué arbitrairement C1, 0,16 ± 0,01 pA pF -1 , N=10) et des neurones présentant un pic de densité de courant important (marqué arbitrairement C2, 0,28±0,01 pA pF -1 , N=8). (B) Panneau de gauche : trace représentative d'enregistrements de tension-clamp de cellule entière de la réponse de courant sensible à l'ouabaïne provoquée par l'application de 100 mol l -1 d'ouabaïne (barre noire, OB) dans un neurone exposé à 10 mT SMF (Cm=25pF). Potentiel de maintien, -50 mV. Panneau de droite, la densité de courant de pompe Na + /K + des neurones exposés au SMF est mieux adaptée par une distribution gaussienne unique (R 2 = 0,96). (C) La densité de courant de pompe Na + /K + calculée est significativement différente entre les neurones de contrôle C1 (N=10) et les neurones exposés au SMF (N= 13), et entre les neurones C1 et les neurones C2 (N=8) (*P<0.05, ANOVA sur les rangs).

                Propriétés des membranes cellulaires neuronales caractérisées par différentes densités de courant de pompe Na + /K +

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                Le changement d'activité de la pompe Na + /K + peut altérer l'activité des échangeurs Na + dépendant du gradient, des canaux ioniques voltage dépendants et des canaux K + ATP dépendants (Glitsch, 2001). Dans cette étude, nous avons constaté que le changement de l'activité de la pompe Na + /K + affecte les propriétés de la membrane neuronale. Après inhibition de la pompe Na + /K + avec de l'ouabaïne, la résistance membranaire a augmenté dans chaque groupe de neurones examinés, mais significativement dans les neurones exposés au C2 et au SMF. Il est plausible que la modification de l'activité de la pompe Na + /K + contribue uniquement à la modification de la résistance membranaire des neurones d'escargot, cette contribution étant plus prononcée dans les neurones exposés au C2 et au SMF, tous deux avec une densité de courant de pompe plus élevée. Cependant, nous supposons que le changement observé dans la résistance membranaire peut être interprété comme la contribution à la fois du changement de l'activité de la pompe Na + /K + et du changement des conductances affectées par la pompe Na + /K +. De plus, il a été montré que le blocage de la pompe Na + /K + par l'ouabaïne réduit les courants sortants dans les neurones du ganglion noueux du rat (Matsumoto et al., 2011) et des interneurones hippocampiques de la souris (Richards et al., 2007). Il est important de mentionner qu'une étude précédente a indiqué que les effets du SMF modéré sur la résistance membranaire des neurones d'escargot identifiés sont médiés par les cellules gliales, car leur élimination par traitement du cerveau d'escargot avec 1% de pronase a aboli l'effet observé (Balaban et al. ., 1990). Cependant, dans notre étude, un changement dans la résistance membranaire a encore pu être observé dans les neurones exposés au SMF après traitement du cerveau d'escargot avec 0,5% de pronase. Une explication possible de l'écart dans les effets SMF observés sur la résistance membranaire des neurones d'escargot pourrait être la différence dans la préparation des neurones examinés. Contrairement aux neurones dissociés et individuels examinés dans notre étude, l'étude de Balaban et ses collègues a examiné les neurones identifiés dans les ganglions de l'escargot dont les connexions synaptiques étaient préservées (Balaban et al., 1990). Par conséquent, il est possible que d'autres neurones, via des entrées synaptiques, et des cellules gliales via une interaction avec les neurones, modulent la réponse d'un neurone examiné au SMF. Dans notre étude, cependant, une telle interaction entre les neurones a été exclue. Néanmoins, une contribution des cellules gliales aux effets du SMF sur la résistance membranaire des neurones de l'escargot observée dans notre étude reste à déterminer.

                Notre étude ne fournit pas de preuves sur le site cellulaire primaire de l'action de 10 mT SMF. Cependant, selon les données de la littérature, le changement induit par le SMF dans les propriétés des canaux ioniques et des pompes intégrés à la membrane peut être la conséquence d'une influence du champ magnétique sur la fluidité de la membrane plasmique en raison des propriétés diamagnétiques de la bicouche phospholipidique ( Braganza et al., 1984 Rosen, 2003b Petrov et Martinac, 2007). Ainsi, il a été montré que les propriétés de la bicouche phospholipidique affectent l'activité de la pompe Na + /K + (Johannsson et al., 1981). De plus, en plus de sa fonction fondamentale de pompage ionique, des recherches récentes ont révélé un rôle supplémentaire de la pompe Na + /K + dans la transduction du signal dans diverses voies de signalisation (Reinhard et al., 2013). Il est plausible que la modification de l'activité de la pompe Na + /K + induite par le SMF influence les voies de signalisation de la phosphorylation et de la déphosphorylation. Sur la base de nos recherches précédentes (Nikolić et al., 2012) et actuelles, nous suggérons que l'augmentation induite par le SMF de l'activité de la pompe Na + /K + est médiée par les voies de signalisation de phosphorylation et de déphosphorylation qui régulent l'expression et les propriétés fonctionnelles de la pompe dans la membrane plasmique. De plus, comme le révèle le changement de résistance membranaire, l'augmentation induite par le SMF de la densité de courant de pompe Na + /K + a très probablement affecté les conductances ioniques dépendantes du gradient Na +. Ainsi, tous ces changements induits par le SMF influenceraient certainement le schéma de décharge des neurones de l'escargot.

                Les effets du SMF modéré examinés dans diverses études sont considérés comme thérapeutiquement bénéfiques, bien que la force appropriée du SMF et la durée d'exposition doivent encore être déterminées avec précision. Dans cette étude, nous avons constaté que l'expression de la pompe Na + /K + dans la zone de la membrane plasmique et la densité de courant de la pompe sont modifiées par 10 mT SMF. Nos résultats sont significatifs car ils révèlent les réponses cellulaires suscitées par un SMF comparable en force au champ magnétique utilisé à des fins thérapeutiques. L'importance de nos résultats est mise en évidence par les rapports de diminution de l'activité de la pompe Na + /K + observée dans de nombreux troubles du système nerveux (Lees, 1991). En observant l'augmentation induite par le SMF de l'activité des pompes Na + /K +, nous pouvons commencer à comprendre les effets bénéfiques d'un champ magnétique appliqué à des fins thérapeutiques sur le système nerveux, d'autant plus que les pompes Na + /K + présentent une similitude essentielle entre les neurones de diverses espèces animales.