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Au cours du processus de correction des mutations par thérapie génique, le gène défectueux est-il supprimé ?


Tout récemment commencé à se renseigner sur la thérapie génique, de nombreux sites Web expliquent que l'ADN corrigé peut être ajouté au génome en utilisant un vecteur et tout ça. Je ne comprends tout simplement pas ce qui arrive à l'autre séquence de bases azotées qui code pour la mauvaise protéine. Merci d'avance pour n'importe quelle réponse :)


Pour être précis: Je parle ici de thérapie génique adulte et somatique, et les expériences de thérapie génique germinale sont toujours une mine terrestre pour des raisons éthiques.

Le gène défectueux code pour une protéine défectueuse, qui joue généralement un rôle dans les voies. Étant donné que la protéine est également défectueuse, cette voie est également rendue défectueuse à cause de cette protéine, et généralement, lorsque les voies deviennent défectueuses, de mauvaises choses se produisent.

Il existe trois approches cibles de la thérapie génique :

  1. Silençage génique par thérapie oligonucléotidique antisens
  2. Chirurgie du génome par ZFN, Crispr/Cas9 etc…
  3. Remplacement de gènes par des vecteurs viraux

La seule méthode qui corrige le gène défectueux ici est la méthode de chirurgie du génome. En utilisant Zinc Finger Nucleases, ou Crispr/Cas9s, TALENS ou d'autres méthodes similaires, la protéine défectueuse est corrigée au niveau du génome, ce qui corrige automatiquement l'ARNm et la protéine, et tout fonctionne comme il se doit.

D'autres méthodes comme Antisense empêchent simplement la formation de la protéine incorrecte. Ceci est vraiment utile si la protéine défectueuse est elle-même toxique pour le corps, et une protéine de remplacement peut être obtenue en masquant la région défectueuse pour produire une protéine tronquée mais fonctionnelle.

Le remplacement de gène insère généralement une copie saine du gène, qui fonctionne avec la copie défectueuse, ce qui résout la majorité des problèmes car la voie affectée n'est plus rendue inactive, car la protéine saine prend le relais de la voie défectueuse. La protéine défectueuse est toujours produite, mais ne fait rien (ou plutôt, devient discutable au fur et à mesure que la protéine saine prend le relais) et est éliminée lors de l'entretien régulier de la cellule.

Maintenant, selon le type de maladie de l'individu, le remplacement du gène peut également avoir lieu avec le knock-out du gène (selon si le gène défectueux est toxique), mais évidemment de nombreuses considérations doivent être prises en compte avant que la thérapie combinatoire puisse être utilisée (toxicité du traitement lui-même étant la principale préoccupation, suivie de près par l'efficacité).

Maintenant, une question évidente avec le remplacement génique, l'antisens ou toute autre forme de thérapie génique est de savoir comment amener l'agent thérapeutique à toutes les cellules, et oui c'est un défi majeur, et c'est pourquoi la thérapie génique est chère. Et non, la thérapie ne corrige pas toutes les cellules de votre tissu affecté, mais elle vise à corriger la majorité des cellules, et cela devrait restaurer la fonction (au moins dans les myopathies comme les dystrophies musculaires)

Comme vous pouvez le voir ici, dans la DMD, la dystrophine est mutée en raison d'une mutation. ou micro dystrophine) qui reprend la fonction de la dystrophine dans la majorité (si nous avons de la chance) des cellules, et le phénotype global de l'individu s'améliore. Les progrès récents de la chirurgie du génome sont également à l'étude pour améliorer les symptômes de la maladie. La raison pour laquelle je me suis concentré sur la DMD est que la thérapie génique pour la DMD est mon doctorat. Donc excuses pour le biais.


Troubles génétiques et thérapie génique

Les gènes se trouvent dans les chromosomes et sont des unités physiques et fonctionnelles de base de l'hérédité. Ce sont des séquences spécifiques de bases qui codent pour fabriquer des protéines. Les gènes sont importants en raison des protéines, ce sont des protéines qui remplissent la plupart des fonctions de la vie. Les protéines contribuent également à construire nos nombreuses structures cellulaires. (Citation 4)

Lorsque les gènes sont modifiés de sorte que les protéines codées sont incapables de remplir leurs fonctions normales, des troubles génétiques peuvent en résulter. Ces altérations peuvent se former à plusieurs niveaux ou échelles différents. Une mutation ponctuelle dans un gène (c'est-à-dire lorsqu'un seul nucléotide est modifié par erreur pendant la synthèse) n'est généralement pas grave. Par exemple, la drépanocytose, qui est une exception car il s'agit en fait d'une maladie grave, est causée par une mutation ponctuelle sur la chaîne β-globine de l'hémoglobine. L'acide glutamine hydrophile est remplacé par l'acide aminé hydrophobe valine en sixième position. La mutation se produit sur le chromosome 11. Dans l'anémie falciforme, les globules rouges prennent la forme d'une faucille, provoquant ainsi des problèmes de circulation sanguine et de capacité de transport d'oxygène. Les personnes qui héritent d'un gène de l'hémoglobine drépanocytaire d'un parent et d'un gène normal de l'autre parent ont une maladie appelée trait drépanocytaire

D'autres mutations peuvent se produire sur une base plus large, parfois, par exemple, en raison de l'ajout d'un nucléotide supplémentaire dans un gène ou de l'élimination du nucléotide. Ces deux éléments peuvent déplacer l'ensemble du cadre de lecture de la synthèse à partir du point où ils sont supprimés ou ajoutés.

Classification des troubles génétiques

Les troubles génétiques peuvent être classés sur la base de :

Niveau 1: Troubles monogéniques

Troubles qui surviennent lorsqu'une mutation provoque l'altération, la différenciation ou l'absence du produit protéique d'un seul gène.

Niveau 2: Anomalies chromosomiques

Dans les troubles de niveau 2, des chromosomes entiers ou entiers, ou de grands segments de chromosomes, sont manquants, dupliqués ou altérés.

Niveau 3: Troubles multifactoriels

Les troubles multifactoriels sont ceux qui résultent de mutations dans plusieurs gènes. Ils sont complexes, souvent associés à des causes environnementales. (Citation 5)

Les troubles génétiques sont souvent mortels. La plupart d'entre eux sont présents à la naissance ou au début de la vie. Beaucoup d'entre eux entraînent des situations mettant la vie en danger, un handicap mental, physique ou sexuel, voire des tournants fatals.

Ce qui aggrave encore les troubles génétiques, c'est que certains d'entre eux peuvent être héréditaires, cela signifie que certains membres des populations ne peuvent être que porteurs d'une maladie génétique, tenant ainsi la maladie génétique sans la ressentir réellement. Ainsi, une maladie peut se transmettre sans le savoir jusqu'à ce qu'elle affecte une génération.

Les maladies génétiques sont largement répandues Fibrose kystique, par exemple, est une maladie génétique qui affecte les poumons et le système digestif d'environ 30 000 enfants et adultes aux États-Unis (70 000 dans le monde). Environ 83 000 enfants et adolescents trisomiques vivaient aux États-Unis en 2002. Il a été démontré que le cancer a également une cause génétique, tout comme de nombreux autres troubles.

Ainsi, la question clé est : que peut-on faire contre les troubles génétiques ?

C'est ici que thérapie génique entre dans

Thérapie génique est défini comme une « technique de correction des gènes défectueux responsables du développement de la maladie ». (Citation 6)

La thérapie génique implique, dans son sens le plus élémentaire, l'application d'un traitement au niveau génétique afin de fournir une thérapie ou de guérir des maladies génétiques.

Il existe plusieurs types d'approches en thérapie génique. Une approche courante consiste simplement à remplacer un gène défectueux par un bon gène en utilisant des vecteurs manipulés, tels que des virus, ou même la microchirurgie, en utilisant la nanotechnologie. Une autre méthode consiste à éditer le chromosome lui-même afin d'éliminer tout gène défectueux. Les gènes responsables d'une maladie peuvent être « activés » ou désactivés. Les gènes pourraient également subir une mutation inverse en gènes normaux.

Qu'est-ce qui différencie la thérapie génique des autres types de thérapies ? Premièrement, la thérapie génique est une solution un peu plus permanente. La désactivation du gène causant une maladie, comme le cancer, par exemple, serait plus efficace que de fournir des traitements non génétiques constants pour le cancer. Comme l'écrivent les créateurs du site Web « Learning Genetics » de l'Université de l'Utah, la thérapie génique s'apparente à la réparation d'une fenêtre cassée : on a la possibilité soit de réparer la fenêtre fissurée avec du ruban adhésif, soit d'installer une toute nouvelle fenêtre. De la même manière, les thérapies géniques peuvent impliquer le remplacement complet du gène défectueux, empêchant ainsi de futures occurrences ou rémissions de la maladie. Alors que la plupart des approches médicamenteuses ne servent qu'à guérir les symptômes, la thérapie génique fournit un moyen de résoudre un problème à sa source. (Citation 7)

Une visualisation de la thérapie génique germinale. En thérapie génique germinale, notez que l'enfant en bonne santé transmettra également les gènes correctifs à ses enfants. En même temps qu'elle présente un avantage supplémentaire, la thérapie génique germinale est également très controversée et donc pas aussi rigoureusement

Thérapie génique somatique ex-vivo. La thérapie génique somatique est principalement réalisée chez l'homme développé et ne fournit le gène sain que pour le patient. Sa progéniture ne portera pas le gène correctif.

Un modèle de thérapie génique ex-vivo. La thérapie génique ex-vivo est plus couramment utilisée.

La partie gauche montre une approche in-vivo de la thérapie génique. Ici, l'acide nucléique thérapeutique est inséré directement dans le patient. Le gène est emballé dans l'un de plusieurs types de vecteurs et délivré avec un dispositif à un organe cible. Dans le visuel montré, le gène est incorporé dans un plasmide et délivré au foie via un cathéter dans la veine porte.

Comme indiqué sur le côté droit, une approche ex-vivo consiste à récolter des cellules à partir d'un tissu d'intérêt, à les transduire avec un gène in vitro et à administrer à nouveau les cellules génétiquement modifiées au patient.

Une conformation globulaire constituée d'un domaine riche en gènes de 500 kilobases. Il est situé sur le chromosome humain numéro 16. Les protéines sont vitales pour le fonctionnement des protéines sont produites lorsque les gènes sont synthétisés.

Plusieurs types de mutations peuvent entraîner des problèmes dans un gène. Remarquez comment certaines mutations modifient la composition en acides aminés de la protéine synthétisée.

Maladies neurologiques causées par des amplifications répétées de triplets dans les zones de locus chromosomiques.

Une cause de maladie génétique : la non-disjonction des chromosomes. La méiose normale est montrée en A). B) montre la non-disjonction dans la méiose I, processus de division cellulaire, et (C) montre la non-disjonction dans la méiose II, la deuxième phase de la méiose.

Une thérapie génique potentielle conçue et développée par ArmaGen pour traverser la barrière hémato-encéphalique afin de sauver les nerfs mourants.

Il existe deux types de base de thérapie génique.

Thérapie génique de la lignée germinale - La thérapie génique de la lignée germinale consiste à modifier la constitution génétique d'un gène d'un ovule ou d'un spermatozoïde avant la fécondation, ou de modifier la composition génétique d'un blastomère au cours d'un stade précoce de sa division.

  • Avantages - La thérapie génique de la lignée germinale est effectuée avant que l'organisme ne se soit développé ou développé, par conséquent, le remède est hérité par les générations futures de cet organisme. De plus, la thérapie génique de la lignée germinale permet à un gène souhaité de s'intégrer complètement dans l'organisme avant l'activation. Par conséquent, l'un des facteurs influençant les réponses immunitaires indésirables (au gène) est supprimé.
  • Désavantages - La thérapie génique des lignées germinales est très controversée. De plus, en raison de cette nature controversée et d'autres facteurs limitatifs, la thérapie génique germinale n'est pas pleinement poursuivie pour le développement. La thérapie génique de la lignée germinale comporte également de nombreux risques, tels qu'une marge d'erreur possible lors de la « transplantation » du gène

Thérapie génique somatique - La thérapie génique somatique, contrairement à la thérapie génique germinale, consiste à modifier le code génétique ou les chromosomes d'une personne. somatique cellules ou cellules du corps. Il est principalement effectué dans des organismes entièrement développés.


Mécanismes et risques de la thérapie génique

Les maladies humaines qui résultent de mutations génétiques sont souvent difficiles à traiter avec des médicaments ou d'autres formes de thérapie traditionnelles, car les signes et symptômes de la maladie résultent d'anomalies dans le génome d'un patient. Par exemple, un patient peut avoir une mutation génétique qui empêche l'expression d'une protéine spécifique requise pour le fonctionnement normal d'un type cellulaire particulier. C'est le cas des patients atteints d'immunodéficience combinée sévère (SCID), une maladie génétique qui altère le fonctionnement de certains globules blancs essentiels au système immunitaire.

La thérapie génique tente de corriger les anomalies génétiques en introduisant un gène fonctionnel non muté dans le génome du patient. Le gène non muté code pour une protéine fonctionnelle que le patient serait autrement incapable de produire. Des vecteurs viraux tels que l'adénovirus sont parfois utilisés pour introduire le gène fonctionnel. La partie du génome viral est supprimée et remplacée par le gène souhaité (figure 1). Des formes plus avancées de thérapie génique tentent de corriger la mutation au site d'origine du génome, comme c'est le cas avec le traitement du SCID.

Figure 1. La thérapie génique utilisant un vecteur adénoviral peut être utilisée pour traiter ou guérir certaines maladies génétiques dans lesquelles un patient a un gène défectueux. (crédit : modification des travaux par les National Institutes of Health)

Jusqu'à présent, les thérapies géniques se sont révélées relativement inefficaces, à l'exception possible des traitements pour fibrose kystique et déficit en adénosine désaminase, un type de SCID. D'autres essais ont montré les risques évidents de tenter une manipulation génétique dans des organismes multicellulaires complexes comme les humains. Chez certains patients, l'utilisation d'un adénovirus vecteur peut déclencher une réponse inflammatoire imprévue du système immunitaire, ce qui peut entraîner une défaillance d'un organe. De plus, comme les virus peuvent souvent cibler plusieurs types de cellules, le vecteur viral peut infecter des cellules non ciblées pour la thérapie, endommageant ces autres cellules et pouvant entraîner des maladies telles que le cancer. Un autre risque potentiel est que le virus modifié redevienne infectieux et provoque une maladie chez le patient. Enfin, il existe un risque que le gène inséré inactive involontairement un autre gène important dans le génome du patient, perturbant le cycle cellulaire normal et conduisant éventuellement à la formation de tumeurs et au cancer. Parce que la thérapie génique comporte de nombreux risques, les candidats à la thérapie génique doivent être pleinement informés de ces des risques avant de fournir consentement éclairé subir la thérapie.

La thérapie génique a mal tourné

Les risques de la thérapie génique ont été réalisés dans le cas de Jesse en 1999 Chanteur de gel, un patient de 18 ans qui a reçu une thérapie génique dans le cadre d'un essai clinique à l'Université de Pennsylvanie. Jesse a reçu une thérapie génique pour une maladie appelée déficit en ornithine transcarbamylase (OTC), ce qui conduit à une accumulation d'ammoniac dans le sang en raison d'un traitement déficient de l'ammoniac. Quatre jours après le traitement, Jesse est décédé des suites d'une réponse immunitaire massive au vecteur adénovirus. [1]

Jusque-là, les chercheurs n'avaient pas vraiment considéré qu'une réponse immunitaire au vecteur était un risque légitime, mais après enquête, il semble que les chercheurs disposaient de preuves suggérant qu'il s'agissait d'un résultat possible. Avant le traitement de Jesse, plusieurs autres patients humains avaient subi des effets secondaires du traitement, et trois singes utilisés dans un essai étaient morts des suites d'une inflammation et de troubles de la coagulation. Malgré ces informations, il semble que ni Jesse ni sa famille n'aient été informés de ces résultats lorsqu'ils ont consenti à la thérapie. Le décès de Jesse était le premier décès d'un patient dû à un traitement de thérapie génique et a entraîné l'arrêt immédiat de l'essai clinique dans lequel il était impliqué, l'arrêt ultérieur de tous les autres essais de thérapie génique à l'Université de Pennsylvanie et l'enquête sur tous les autres essais de thérapie génique aux États-Unis. En conséquence, la réglementation et la surveillance de la thérapie génique dans son ensemble ont été réexaminées, entraînant de nouveaux protocoles réglementaires qui sont toujours en place aujourd'hui.

Pensez-y


LE CHEMIN VERS LA NOUVELLE THÉRAPIE GÉNIQUE : 7 étapes vers l'IND

Avec le trio d'approbations de thérapie génique de la Food and Drug Administration en 2017, les vannes de l'innovation se sont ouvertes. Les entreprises pharmaceutiques et biotechnologiques cherchent à capitaliser sur une approche thérapeutique révolutionnaire autrefois jugée trop risquée. Avec les résultats cliniques prometteurs des premières thérapies géniques, l'argent du capital-risque se libère enfin pour permettre à cette nouvelle génération de médecine passionnante.

Cependant, même les programmes de thérapie génique les mieux financés sont extrêmement complexes à naviguer à travers le développement préclinique. Ces tests d'innocuité et d'efficacité, qui sont nécessaires avant que les médicaments puissent être étudiés chez l'homme, sont peut-être l'étape la plus périlleuse de l'ensemble du processus de développement. Les sociétés pharmaceutiques doivent concevoir des études qui démontrent, avec des données solides, que la thérapie est sûre et efficace avant que les régulateurs ne la jugent appropriée pour le dosage chez les patients.

Les enjeux ne pourraient pas être plus élevés. Selon les résultats des études précliniques de sécurité et de biodistribution, les thérapies géniques expérimentales passeront soit à la dernière étape de l'examen de la FDA, soit elles échoueront, renvoyant les scientifiques à la case départ.

Lovelace Biomedical mène des études de sécurité et de biodistribution sur les thérapies géniques expérimentales depuis plus d'une décennie, ce qui en fait l'un des programmes de thérapie génique les plus anciens du pays dans l'espace préclinique. Avec de récents projets de thérapie génique dans la mucoviscidose, la maladie de Pompe et une variété d'autres maladies rares avec un besoin critique des patients, l'équipe Lovelace comprend les nuances de la conception et de la mise en œuvre d'un programme préclinique soutenant une soumission IND qui répond à toutes les questions réglementaires.
Ici, avec la contribution de toute l'équipe de thérapie génique de Lovelace, nous fournissons un aperçu des étapes que la plupart des sponsors de médicaments doivent suivre pour faire progresser une thérapie génique potentielle à travers des études précliniques en vue d'une éventuelle approbation réglementaire. Une chose est claire : il n'y a pas de chemin à suivre pour les produits de thérapie génique. Dans un espace thérapeutique émergent, chaque étape nécessite une approche personnalisée et hautement informée.

« Je pense que la thérapie génique deviendra un pilier du traitement et peut-être de la guérison de bon nombre de nos maladies les plus dévastatrices et les plus difficiles à traiter. » Scott Gottlieb, M.D. « Commissaire de la FDA, décembre 2017

01 – SÉLECTIONNER UN VECTEUR
Comment l'ADN correctif au cœur d'une thérapie génique sera-t-il délivré dans les cellules des patients ? Typiquement, la réponse est à travers un virus. Les virus associés aux adénos (AAV), les adénovirus et les lentivirus sont le plus souvent utilisés comme vecteurs pour l'administration de médicaments. Ce choix dépend de l'approche thérapeutique : les vecteurs AAV fournissent une expression génique à long terme et des sous-types naturels (sérotypes), ce qui permet une certaine spécificité tissulaire cible. Les vecteurs adénoviraux peuvent être optimaux lorsque l'expression génique à court terme est l'objectif. Et les lentivirus sont le plus souvent utilisés pour transférer du matériel génétique aux cellules du patient en culture (moelle osseuse ou cellules sanguines) qui sont ensuite réinjectées au patient comme thérapie pour traiter les déficits immunitaires ou la drépanocytose.

D'autres modes de livraison de gènes incluent les liposomes (particules lipidiques) et les nanoparticules qui peuvent être conçues pour cibler des types de cellules spécifiques pour la livraison. L'avantage de ces derniers est qu'ils ne produisent pas de réponses immunitaires associées à l'utilisation de vecteurs viraux.

"Vous devez amener le vecteur dans le tissu, convaincre les cellules d'incorporer le vecteur, puis obtenir le matériel génétique pour exprimer le gène", explique Jake McDonald, directeur scientifique de Lovelace. "Pour la plupart des thérapies géniques en développement, qui cherchent à fournir un traitement curatif pour les maladies héréditaires, vous voulez que les patients expriment ce gène pour le reste de leur vie."

02 – DETERMINER L'ITINÉRAIRE ET LE CALENDRIER D'ADMINISTRATION
La voie d'administration du médicament dépend de l'organe ou du tissu cible où le gène défectueux est exprimé. Par exemple, avec des thérapies oculaires, articulaires ou cérébrales, le vecteur est délivré directement à l'œil, à l'articulation, au cerveau ou au liquide céphalo-rachidien. Dans le cas de la maladie de Pompe, qui endommage les cellules musculaires et nerveuses dans tout le corps, le vecteur est administré soit par voie intraveineuse, soit dans le diaphragme ou le muscle squelettique. Pour les thérapies cardiaques, le médicament peut être administré via un cathéter aux vaisseaux coronaires, ou directement appliqué à la surface du cœur. Pour le déficit en alpha-1 antitrypsine, une maladie génétique qui entraîne des problèmes pulmonaires et hépatiques, le vecteur est administré par voie intraveineuse ou dans l'espace pleural entre les côtes et le poumon.

Quant au moment du traitement, il s'agit également d'un facteur important pour les études précliniques. Avec les maladies héréditaires, il est optimal d'administrer le médicament au fœtus ou au nourrisson dès que possible après le diagnostic. Cependant, à quelques exceptions près, la FDA exige des tests chez les adultes ou les enfants d'au moins 12 ans avant d'autoriser l'accouchement aux bébés ou aux jeunes enfants.

"Ces décisions sont critiques, car les patients n'ont qu'une seule chance de bénéficier d'une thérapie génique", a déclaré McDonald. « Une fois que le corps est exposé au nouveau matériel génétique une deuxième fois, le système immunitaire le rejettera. De nouvelles technologies sont en cours de développement qui pourraient éviter ce défi, mais c'est la situation à ce jour. »

03 – ÉVALUER LA BIODISTRIBUTION
À l'exception des cas dans lesquels le vecteur est administré dans des espaces confinés tels que l'œil ou l'articulation, l'expérience a montré que la thérapie génique se distribue vers des sites hors cible. Cependant, cet effet indésirable peut être atténué en incorporant des « promoteurs » dans le vecteur pour limiter ou contrôler l'expression des gènes. Certains promoteurs uniques ont une sensibilité à la lumière ou à la tension d'oxygène pour contrôler l'expression des gènes. Avec la maladie de Pompe, un promoteur spécifique de la desmine limite l'expression à un ensemble limité de tissus, y compris le muscle, bien que le vecteur AAV se distribue par le sang à la plupart des tissus du corps.

04 – SÉLECTIONNER LES ESPÈCES À ÉTUDIER
Le choix d'une espèce pour les tests précliniques de thérapies géniques est l'une des décisions les plus difficiles de la conception de l'étude. En effet, la plupart des thérapies géniques visent à traiter des maladies rares, qui peuvent être difficiles voire impossibles à reproduire chez un animal.

Certains modèles auront une mutation naturelle, tandis que d'autres sont génétiquement modifiés (comme on le voit dans le modèle knock-out GAA de la maladie de Pompe ou le modèle de souris Sandoff de la maladie de Tay Sachs). Des modèles animaux peuvent être développés chimiquement, comme pour l'arthrose induite par le mono-iodoacétate, ou par des moyens physiques, comme pour l'insuffisance cardiaque chez le porc induite par une occlusion vasculaire ou une stimulation électrique. En outre, le promoteur peut mener des études in vitro pour démontrer à la FDA qu'une thérapie donnée sera absorbée par les cellules d'une espèce choisie d'une manière similaire à l'absorption dans les cellules humaines, ou que les récepteurs ciblés dans les cellules humaines sont également présent dans l'espèce animale.

"Il peut y avoir de nombreuses couches de complications qui influencent la décision du sponsor du médicament ici", a déclaré McDonald. « Vous livrez un gène humain à un animal. Et un animal peut ou non répondre à la protéine humaine de la même manière qu'il le ferait à une protéine de sa propre espèce. C'est l'une des raisons pour lesquelles une entreprise peut décider d'évaluer sa thérapie chez deux espèces, telles que la souris et le primate non humain. »
La justification des espèces utilisées doit être justifiée dans le package pré-IND et dans l'IND - et c'est quelque chose pour lequel Lovelace apporte un vaste aperçu. Par exemple, alors que les primates non humains peuvent servir de modèle de maladie pour certaines conditions, de nombreux primates ont naturellement un certain niveau d'anticorps neutralisants contre le vecteur utilisé pour administrer la thérapie génique, ce qui signifie que l'animal ne montrerait aucune réponse à une thérapie génique. Pour cette raison, tous les primates non humains doivent être présélectionnés.

À ce stade de la recherche, il est essentiel d'avoir à ses côtés les meilleurs vétérinaires. Lors de la mesure de la maladie et de la réponse au traitement dans un modèle animal, l'équipe doit être capable de faire la distinction entre la maladie elle-même et les effets toxicologiques du traitement, ce qui nécessite des compétences et de l'expérience. Dans certains cas, les scientifiques évaluent l'efficacité et l'innocuité en même temps et dans le même modèle.

05 – ÉLABORER LA CONCEPTION DE L'ÉTUDE
De nombreux facteurs sont pris en compte lors de la conception de l'étude préclinique, à partir du nombre de groupes de dose, du nombre d'animaux par groupe de dose, des types de contrôles et du nombre de points temporels d'échantillonnage. À moins qu'une maladie génétique ne survienne chez un seul sexe, les deux sexes sont inclus dans les études d'innocuité et de biodistribution. Dans la plupart des cas, au moins deux doses de vecteur sont utilisées. Plusieurs points de temps d'échantillonnage sont inclus, commençant au moment où l'expression vectorielle atteint son pic (généralement 7 à 14 jours) et s'étendant sur plusieurs mois à un an.

06 – FIXER LES LIMITES CRITIQUES
Les critères d'évaluation courants d'une étude de thérapie génique comprennent : le poids corporel, les signes cliniques, l'hématologie, la chimie du sérum, la biodistribution du vecteur (telle qu'évaluée par PCR), l'expression génique dans le tissu cible et dans les tissus ayant une forte concentration pré-spécifiée de capside du vecteur (la coquille du virus), des anticorps neutralisants dans le sérum contre la protéine de capside et le transgène, les réponses immunitaires (à médiation cellulaire contre la protéine de capside et la protéine exprimée) et l'histopathologie (et l'immunohistochimie pour l'évaluation microscopique de l'expression des gènes). D'autres critères d'évaluation peuvent être inclus, en fonction de la maladie. Un autre point clé à noter ici : si le promoteur du médicament cherche à obtenir une approbation réglementaire en Europe, une étape supplémentaire peut être nécessaire pour évaluer la concentration de vecteurs dans les fluides corporels et les excréments afin de déterminer l'excrétion.

07 – PRÉPAREZ-VOUS POUR L'IND
Une fois les résultats précliniques évalués à l'aide des derniers outils et rapports bioanalytiques, il est temps de remplir l'application IND - en affichant les données solides qui indiquent que votre médicament est prêt à être testé chez les patients. Toutes les études d'innocuité précliniques des thérapies géniques sont menées conformément aux directives de bonnes pratiques de laboratoire (BPL). Un rapport final audité avec des données récapitulatives, des statistiques et des annexes contenant des rapports scientifiques et des données animales individuelles est soumis au sponsor pour inclusion dans le package IND.


Introduction

La bêta-thalassémie (β-thal) et la drépanocytose (SCD), deux des maladies génétiques les plus courantes, sont causées par des mutations dans le HBB gène codant pour la forme postnatale de la sous-unité bêta de l'hémoglobine. Après la naissance, les tétramères d'hémoglobine contiennent deux sous-unités alpha et deux bêta-globines codées par le HBB gène qui est exprimé pendant et après la naissance. Avant cela, les bêta-globines codées par l'un des deux HBG gènes qui sont exprimés au stade fœtal et normalement réduits au silence après la naissance. Alors qu'une mutation ponctuelle dans le codon 6 (GUNEG > GTG, entraînant la substitution de l'acide glutamique à l'acide aminé valine) dans le HBB gène crée un trait SCD, diverses mutations dans HBB Le gène entraînant une réduction ou l'absence de protéine HBB provoque un -thal dès la petite enfance. Plus de 200 types différents de mutations dans le HBB ont été identifiés chez des patients atteints de -thal, qui pourrait être situé n'importe où dans le segment d'ADN de ∼ 1 600 paires de bases (pb) contenant les trois exons codants, les sites d'épissage et d'autres éléments régulateurs 1 . Les patients présentant des mutations dans les deux HBB les allèles qui réduisent considérablement la production de protéines HBB (appelés β-thal majeur ou anémie de Cooley) souffrent d'anémie sévère et d'anomalies squelettiques, et ont un taux de mortalité élevé ou une espérance de vie réduite s'ils ne sont pas traités 1 . De même, les patients porteurs des deux copies du SCD HBB ou une mutation SCD hétérozygote plus une copie d'une mutation β-thal sévère produira une protéine HBB dysfonctionnelle qui entrave les fonctions de l'hémoglobine 1 .

Bien que la transfusion chronique de globules rouges et de certaines petites molécules améliore les symptômes des patients β-thal et SCD, il est hautement souhaitable de développer un remède pour traiter ces maladies monogéniques dues à HBB mutations génétiques. Greffe de moelle osseuse (GMO) utilisant des cellules souches hématopoïétiques (CSH) d'un donneur allogénique avec le type sauvage HBB Le gène a été exploré au cours des dernières décennies pour le traitement du -thal et de la SCD. Bien que couronnée de succès dans certains cas, la technologie BMT est limitée en raison de la réaction du greffon contre l'hôte et du manque de donneurs immunologiquement compatibles qui ne sont pas liés aux patients traités 2 . Une autre approche consiste à insérer une copie fonctionnelle du HBB gène dans les CSH du patient suivi par BMT. Au cours des dernières décennies, les scientifiques ont surmonté de nombreux obstacles à la livraison efficace d'une copie fonctionnelle du HBB gène ex vivo dans les CSH humaines, qui vont se loger dans la moelle du patient, se différencier en érythrocytes et exprimer un niveau élevé de l'ajout HBB gène 2, 3 . Actuellement, l'approche la mieux développée de la thérapie génique pour le traitement des patients β-thal et SCD repose sur l'utilisation de vecteurs lentiviraux d'insertion du génome qui portent le HBB ou connexe HBG séquence codante (CDS) ainsi que des éléments régulateurs raccourcis, les insérant de façon permanente dans le génome des CSH autologues 2-4. Bien que les essais cliniques en cours détermineront en fin de compte l'équilibre entre l'efficacité et les risques pour le traitement des patients β-thal et SCD, la nature incontrôlable de l'insertion de vecteurs lentiviraux qui favorise les régions codantes est toujours un risque potentiel, en particulier à long terme 2-7. Ces dernières années, les scientifiques sont revenus pour réaliser une édition précise du génome via la réparation dirigée par homologie (HDR) d'un HBB mutation explorée depuis 1985 mais avec une efficacité très faible (10 -6 ) 7, 8 .

L'avènement récent des nucléases modifiées qui provoquent une rupture de l'ADN double brin (DSB) a considérablement amélioré notre capacité à réaliser la HDR et d'autres formes de réparation et de recombinaison de l'ADN dans les cellules humaines non transformées. De plus, la disponibilité de cellules souches humaines immortalisées abritant HBB les mutations capables de se différencier en érythrocytes accélèrent considérablement le développement de la correction fonctionnelle de HBB mutations. Depuis 2008, il est devenu possible de générer des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSCs) à partir de patients β-thal et SCD qui ont des propriétés uniques HBB mutation 9-12. Pendant ce temps, des nucléases modifiées telles que Zinc Finger Nucleases, Transcription Activator Like Effector Nucleases et Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas systèmes ont également été développés pour améliorer le HDR et réaliser une édition précise du génome pour corriger un HBB mutation dans iPSCs 6-8. Bien que l'efficacité HDR soit encore relativement faible (<1%) dans les cellules non transformées, de rares clones d'iPSCs après correction génique médiée par HDR peuvent être sélectionnés, caractérisés et étendus de manière extensive. Aidé par des nucléases validées ciblant des emplacements spécifiques de divers HBB mutations, la correction précise du génome de la mutation ponctuelle SCD dans l'exon 1, de la délétion TCTT dans l'exon 2 ou de la mutation IVS2-654 dans l'intron 2 a été obtenue lorsqu'une matrice d'ADN de donneur spécifique à chaque type HBB mutation est également fournie 13-23. La facilité et la robustesse du système CRISPR/Cas9 est devenu le choix privilégié ces dernières années pour réaliser un DSB spécifique dans le HBB locus et atteindre le HDR pour corriger un HBB mutation génique 17-23 .

Pour les futures applications cliniques de la correction de divers HBB mutations, il est hautement souhaitable de développer une stratégie universelle pour corriger la plupart sinon la totalité des >200 types de HBB mutations en utilisant des ARN guides CRISPR validés et une matrice d'ADN de donneur pour HDR. Pour fournir une preuve de principe, nous avons développé une stratégie d'utilisation de deux ARN guides validés (ciblant le HBB exon 1 et 3'-non traduit (UTR)) et une matrice d'ADN fournissant tous les HBB CDS. De cette façon, un événement HDR à proximité de l'ARN guide apportera une correction fonctionnelle de HBB mutations not only in exon 1, but also exon 2 and 3 or any downstream sites. We used iPSC lines from two transfusion-dependent β-thal patients with HBB mutations in exon 2 and intron 2 as well as an exon 1 mutation to test this new and more universal strategy. To provide a simple readout, we linked a GFP reporter gene downstream to the HBB coding cDNA via the 2A self-cleaving peptide so that the GFP reporter expression is indicative of the HBB expression from the same transcript and pro-peptide. Our data provide evidence that this universal approach is able to correct various HBB gene mutations and restore HBB protein production. In addition, it provides an experimental system to screen bioactive molecules and to improve HBB protein expression in iPSC-derived erythrocytes based on coexpression of GFP reporter.


Gene therapy of hematological disorders: current challenges

Recent advances in genetic engineering technology and stem cell biology have spurred great interest in developing gene therapies for hereditary, as well as acquired hematological disorders. Currently, hematopoietic stem cell transplantation is used to cure disorders such as hemoglobinopathies and primary immunodeficiencies however, this method is limited by the availability of immune-matched donors. Using autologous cells coupled with genome editing bypasses this limitation and therefore became the focus of many research groups aiming to develop efficient and safe genomic modification. Hence, gene therapy research has witnessed a noticeable growth in recent years with numerous successful achievements however, several challenges have to be overcome before gene therapy becomes widely available for patients. In this review, I discuss tools used in gene therapy for hematological disorders, choices of target cells, and delivery vehicles with emphasis on current hurdles and attempts to solve them, and present examples of successful clinical trials to give a glimpse of current progress.


Gene therapy techniques

There are several techniques for carrying out gene therapy. Ceux-ci inclus:

Gene augmentation therapy

  • This is used to treat diseases caused by a mutation that stops a gene from producing a functioning product, such as a protein.
  • This therapy adds DNA containing a functional version of the lost gene back into the cell.
  • The new gene produces a functioning product at sufficient levels to replace the protein that was originally missing.
  • This is only successful if the effects of the disease are reversible or have not resulted in lasting damage to the body.
  • For example, this can be used to treat loss of function disorders such as cystic fibrosis by introducing a functional copy of the gene to correct the disease (see illustration below).

Gene inhibition therapy

  • Suitable for the treatment of infectious diseases, cancer and inherited disease caused by inappropriate gene activity.
  • The aim is to introduce a gene whose product either:
    • inhibits the expression of another gene
    • interferes with the activity of the product of another gene.

    Killing of specific cells

    • Suitable for diseases such as cancer that can be treated by destroying certain groups of cells.
    • The aim is to insert DNA into a diseased cell that causes that cell to die.
    • This can be achieved in one of two ways:
      • the inserted DNA contains a “suicide” gene that produces a highly toxic product which kills the diseased cell
      • the inserted DNA causes expression of a protein that marks the cells so that the diseased cells are attacked by the body’s natural immune system.


      Gene Therapy for Beta-Hemoglobinopathies: Milestones, New Therapies and Challenges

      Inherited monogenic disorders such as beta-hemoglobinopathies (BH) are fitting candidates for treatment via gene therapy by gene transfer or gene editing. The reported safety and efficacy of lentiviral vectors in preclinical studies have led to the development of several clinical trials for the addition of a functional beta-globin gene. Across trials, dozens of transfusion-dependent patients with sickle cell disease (SCD) and transfusion-dependent beta-thalassemia (TDT) have been treated via gene therapy and have achieved reduced transfusion requirements. While overall results are encouraging, the outcomes appear to be strongly influenced by the level of lentiviral integration in transduced cells after engraftment, as well as the underlying genotype resulting in thalassemia. In addition, the method of procurement of hematopoietic stem cells can affect their quality and thus the outcome of gene therapy both in SCD and TDT. This suggests that new studies aimed at maximizing the number of corrected cells with long-term self-renewal potential are crucial to ensure successful treatment for every patient. Recent advancements in gene transfer and bone marrow transplantation have improved the success of this approach, and the results obtained by using these strategies demonstrated significant improvement of gene transfer outcome in patients. The advent of new gene-editing technologies has suggested additional therapeutic options. These are primarily focused on correcting the defective beta-globin gene or editing the expression of genes or genomic segments that regulate fetal hemoglobin synthesis. In this review, we aim to establish the potential benefits of gene therapy for BH, to summarize the status of the ongoing trials, and to discuss the possible improvement or direction for future treatments.


      Conclusion et perspectives

      The last few decades witnessed a revolution in the development and application of gene therapy. There is currently no doubt that gene modification approaches have turned into a valuable biotechnology and therapeutic tool. New and safer vector designs along with a better comprehension of vectors biology led to successful utilization of these valuable tools in several clinical contexts now. The success of retro and lentivirus-based gene therapies helped to turn gene therapy into a solid and flourishing field. Non-viral integrative vectors, such as transposons, have the potential to extend this success story, hopefully making gene therapy approaches more straightforward, simple and cost-effective.

      The newly developed genome-editing technologies such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) represent the most recent tools for genetic manipulation. Even if clinical safety of these tools are still to be clarified and there is undoubtedly still room for the improvement of such approaches, the ability to edit specific genome sequences could revolutionize the whole cell biology, biotechnology, cell engineering and gene therapy areas. Such tools may allow approaches such as add back of gene function, site-directed gene corrections and gene replacements, impacting activities such as animal transgenesis and the incipient logic-systems and biological fields. Hopefully the combination of gene delivery approaches such as those described in this review with the new gene editing tools will turn gene therapy into a more effective and curative approach.