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Pourquoi de grandes quantités d'ADN sont-elles nécessaires pour l'analyse ?


Je sais que la PCR est utilisée pour créer de grandes quantités de copies de gènes et que c'est une percée scientifique, mais je veux comprendre pourquoi. Pourquoi avons-nous besoin de grandes quantités d'ADN pour pouvoir l'analyser, l'utiliser. Une seule molécule d'ADN ne suffit-elle pas ?


Premièrement, un échantillon d'ADN obtenu à partir d'une cellule ou autre ne contiendra jamais uniquement la séquence d'ADN que vous souhaitez, mais contiendra à la place l'intégralité de l'ADN génomique, des plasmides, des séquences d'ARN et ainsi de suite. En utilisant la PCR, vous pouvez multiplier sélectivement la quantité de séquence d'ADN souhaitée sans que les séquences indésirables ne soient copiées. Continuez la PCR assez longtemps et la quantité d'ADN indésirable par rapport à la séquence d'ADN souhaitée deviendra négligeable. À ce stade, vous pouvez faire l'expérience que vous voulez avec votre échantillon d'ADN et être raisonnablement sûr que le résultat que vous obtenez est entièrement causé par la séquence d'ADN qui vous intéresse.

Deuxièmement, même si vous pouviez isoler une seule molécule d'ADN, que feriez-vous avec ? Vous ne pouvez pas déterminer sa longueur par électrophorèse sur gel, car une seule molécule d'ADN ne créerait pas de bande visible et sa construction dans un plasmide échouera très probablement car vous n'avez qu'une seule chance. Vous ne seriez probablement même pas en mesure de dire que vous avez une molécule d'ADN, car les machines de votre laboratoire de tous les jours ne sont pas assez sensibles pour détecter une seule molécule d'ADN.

Troisièmement, avoir une grande quantité d'ADN vous permet d'effectuer différentes expériences à partir du même échantillon. La plupart des méthodes d'analyse d'ADN que je connais sont destructrices en ce sens que l'ADN utilisé ne peut pas être réutilisé pour une autre expérience, donc une quantité suffisamment importante d'ADN pour effectuer toutes les expériences planifiées sans avoir à obtenir un nouvel échantillon (et introduire toutes sortes de problèmes potentiels) est utile.

Ainsi, en résumé, la PCR nous permet de filtrer la séquence d'ADN souhaitée à partir d'un échantillon, d'effectuer une analyse significative sur cette séquence et nous permet d'utiliser un échantillon pour plusieurs expériences. Il pourrait y avoir encore plus d'avantages à la PCR que j'ai manqués, mais ceux-ci sont ceux qui me viennent à l'esprit.


De nombreuses méthodes utilisées pour visualiser la présence d'ADN, telles que l'électrophorèse sur gel, reposent sur une analyse visuelle, que ce soit par l'œil humain ou par une machine. Une quantité importante d'ADN au-delà de ce qui pourrait être extrait directement d'une source particulière est nécessaire pour cela. Ce besoin est exercé par le fait que l'ADN est typiquement décomposé en fragments pour analyse.

Faites défiler vers le bas de ce lien pour voir un exemple de gel. https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophorèse


RFLP et les applications d'analyse d'ADN

Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) est une méthode moléculaire d'analyse génétique qui permet d'identifier des individus sur la base de schémas uniques de coupure d'enzymes de restriction dans des régions spécifiques de l'ADN.

Également appelée analyse RFLP, la technique tire parti des polymorphismes des codes génétiques des individus. Même si tous les membres d'une espèce ont essentiellement la même constitution génétique, ces légères différences expliquent les variations de phénotype, telles que l'apparence ou le métabolisme, entre les individus.


Pourquoi de grandes quantités d'ADN sont-elles nécessaires pour l'analyse ? - La biologie

Figure 1. Friedrich Miescher (1844-1895) a découvert des acides nucléiques.

Notre compréhension actuelle de l'ADN a commencé avec la découverte des acides nucléiques suivie du développement du modèle à double hélice. Dans les années 1860, Friedrich Miescher (figure 1), médecin de profession, a isolé des produits chimiques riches en phosphate à partir de globules blancs (leucocytes). Il a nommé ces produits chimiques (qui seraient finalement connus sous le nom d'ADN) nucléine car ils ont été isolés des noyaux des cellules.

Pour voir Miescher mener une expérience étape par étape, cliquez sur cette revue de la façon dont il a découvert le rôle clé de l'ADN et des protéines dans le noyau.

Un demi-siècle plus tard, en 1928, le bactériologiste britannique Frederick Griffith rapporta la première démonstration de transformation bactérienne - un processus dans lequel l'ADN externe est absorbé par une cellule, modifiant ainsi sa morphologie et sa physiologie. Griffith a mené ses expériences avec Streptococcus pneumoniae, une bactérie qui cause la pneumonie. Griffith a travaillé avec deux souches de cette bactérie appelées rugueux (R) et lisse (S). (Les deux types de cellules ont été appelés « rugueux » et « lisse » après l'apparition de leurs colonies cultivées sur une plaque de gélose nutritive.)

La souche R est non pathogène (ne provoque pas de maladie). La souche S est pathogène (causant des maladies) et possède une capsule à l'extérieur de sa paroi cellulaire. La capsule permet à la cellule d'échapper aux réponses immunitaires de la souris hôte.

Lorsque Griffith a injecté la souche S vivante à des souris, celles-ci sont mortes d'une pneumonie. En revanche, lorsque Griffith a injecté la souche R vivante à des souris, elles ont survécu. Dans une autre expérience, lorsqu'il a injecté à des souris la souche S tuée par la chaleur, elles ont également survécu. Cette expérience a montré que la capsule seule n'était pas la cause de la mort. Dans une troisième série d'expériences, un mélange de souche R vivante et de souche S tuée par la chaleur a été injecté à des souris et, à sa grande surprise, les souris sont mortes. Lors de l'isolement des bactéries vivantes de la souris morte, seule la souche bactérienne S a été récupérée. Lorsque cette souche S isolée a été injectée à des souris fraîches, les souris sont mortes. Griffith a conclu que quelque chose était passé de la souche S tuée par la chaleur à la souche R vivante et l'avait transformée en la souche S pathogène. Il appelait cela le principe de transformation (Figure 2). Ces expériences sont maintenant connues sous le nom d'expériences de transformation de Griffith.

Figure 2. Deux souches de S. pneumoniae ont été utilisés dans les expériences de transformation de Griffith. La souche R est non pathogène. La souche S est pathogène et cause la mort. Lorsque Griffith a injecté à une souris la souche S tuée par la chaleur et une souche R vivante, la souris est morte. La souche S a été récupérée chez la souris morte. Ainsi, Griffith a conclu que quelque chose était passé de la souche S tuée par la chaleur à la souche R, transformant ainsi la souche R en souche S. (crédit “living mouse” : modification du travail par NIH crédit “dead mouse” : modification du travail par Sarah Marriage)

Les scientifiques Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn McCarty (1944) étaient intéressés à explorer davantage ce principe de transformation. Ils ont isolé la souche S des souris mortes et isolé les protéines et les acides nucléiques (ARN et ADN) car ils étaient des candidats possibles pour la molécule de l'hérédité. Ils ont utilisé des enzymes qui dégradaient spécifiquement chaque composant, puis utilisaient chaque mélange séparément pour transformer la souche R. Ils ont découvert que lorsque l'ADN était dégradé, le mélange résultant n'était plus capable de transformer les bactéries, alors que toutes les autres combinaisons étaient capables de transformer les bactéries. Cela les a amenés à conclure que l'ADN était le principe de transformation.

Médecins légistes et analyse ADN

Des médecins légistes ont utilisé pour la première fois des preuves d'analyse ADN pour résoudre une affaire d'immigration. L'histoire a commencé avec un adolescent revenant du Ghana à Londres pour être avec sa mère. Les autorités de l'immigration à l'aéroport se méfiaient de lui, pensant qu'il voyageait avec un faux passeport. Après beaucoup de persuasion, il a été autorisé à aller vivre avec sa mère, mais les autorités de l'immigration n'ont pas abandonné les poursuites contre lui. Tous les types de preuves, y compris des photographies, ont été fournis aux autorités, mais une procédure d'expulsion a néanmoins été engagée. À peu près à la même époque, le Dr Alec Jeffreys de l'Université de Leicester au Royaume-Uni avait inventé une technique connue sous le nom d'empreintes génétiques . Les autorités de l'immigration ont demandé de l'aide au Dr Jeffreys. Il a prélevé des échantillons d'ADN de la mère et de trois de ses enfants, ainsi que d'une mère non apparentée, et a comparé les échantillons avec l'ADN du garçon. Comme le père biologique n'était pas sur la photo, l'ADN des trois enfants a été comparé à l'ADN du garçon. Il a trouvé une correspondance dans l'ADN du garçon pour la mère et ses trois frères et sœurs. Il a conclu que le garçon était bien le fils de la mère.

Les médecins légistes analysent de nombreux éléments, notamment des documents, des écritures manuscrites, des armes à feu et des échantillons biologiques. Ils analysent le contenu ADN des cheveux, du sperme, de la salive et du sang, et le comparent à une base de données de profils ADN de criminels connus. L'analyse comprend l'isolement de l'ADN, le séquençage et l'analyse des séquences. Les médecins légistes devraient comparaître aux audiences du tribunal pour présenter leurs conclusions. Ils sont généralement employés dans les laboratoires criminels des agences gouvernementales de la ville et de l'État. Les généticiens qui expérimentent des techniques d'ADN travaillent également pour des organisations scientifiques et de recherche, des industries pharmaceutiques et des laboratoires collégiaux et universitaires. Les étudiants souhaitant poursuivre une carrière en tant que médecin légiste doivent avoir au moins un baccalauréat en chimie, biologie ou physique, et de préférence une certaine expérience de travail dans un laboratoire.

Bien que les expériences d'Avery, McCarty et McLeod aient démontré que l'ADN était le composant informationnel transféré au cours de la transformation, l'ADN était toujours considéré comme une molécule trop simple pour transporter des informations biologiques. Les protéines, avec leurs 20 acides aminés différents, ont été considérées comme des candidats plus probables. L'expérience décisive, menée par Martha Chase et Alfred Hershey en 1952, a fourni la preuve confirmative que l'ADN était bien le matériel génétique et non les protéines. Chase et Hershey étudiaient un bactériophage, un virus qui infecte les bactéries. Les virus ont généralement une structure simple : une enveloppe protéique, appelée capside, et un noyau d'acide nucléique qui contient le matériel génétique (ADN ou ARN). Le bactériophage infecte la cellule bactérienne hôte en se fixant à sa surface, puis il injecte ses acides nucléiques à l'intérieur de la cellule. L'ADN du phage fait de multiples copies de lui-même en utilisant la machinerie hôte, et finalement la cellule hôte éclate, libérant un grand nombre de bactériophages. Hershey et Chase ont sélectionné des éléments radioactifs qui distingueraient spécifiquement la protéine de l'ADN dans les cellules infectées. Ils ont marqué un lot de phages avec du soufre radioactif, 35 S, pour marquer l'enveloppe protéique. Un autre lot de phages a été marqué avec du phosphore radioactif, 32 P. Comme le phosphore se trouve dans l'ADN, mais pas dans les protéines, l'ADN et non la protéine serait marqué avec du phosphore radioactif. De même, le soufre est absent de l'ADN, mais présent dans plusieurs acides aminés tels que la méthionine et la cystéine.

Chaque lot de phages a été autorisé à infecter les cellules séparément. Après l'infection, la suspension bactérienne de phage a été placée dans un mélangeur, ce qui a provoqué le détachement de la couche de phage de la cellule hôte. Les cellules exposées suffisamment longtemps pour que l'infection se produise ont ensuite été examinées pour voir laquelle des deux molécules radioactives était entrée dans la cellule. La suspension de phages et de bactéries a été centrifugée dans une centrifugeuse. Les cellules bactériennes les plus lourdes se sont déposées et ont formé un culot, tandis que les particules de phage plus légères sont restées dans le surnageant. Dans le tube qui contenait le phage marqué au 35S, le surnageant contenait le phage marqué radioactivement, alors qu'aucune radioactivité n'a été détectée dans le culot. Dans le tube qui contenait le phage marqué au 32P, la radioactivité a été détectée dans le culot qui contenait les cellules bactériennes les plus lourdes, et aucune radioactivité n'a été détectée dans le surnageant. Hershey et Chase ont conclu que c'était l'ADN du phage qui avait été injecté dans la cellule et portait des informations pour produire plus de particules de phage, fournissant ainsi la preuve que l'ADN était le matériel génétique et non les protéines (Figure 3).

Figure 3. Dans les expériences de Hershey et Chase, des bactéries ont été infectées par un phage radiomarqué soit avec 35S, qui marque la protéine, soit au 32P, qui marque l'ADN. Seul le 32P est entré dans les cellules bactériennes, indiquant que l'ADN est le matériel génétique.

À peu près à la même époque, le biochimiste autrichien Erwin Chargaff a examiné le contenu de l'ADN dans différentes espèces et a constaté que les quantités d'adénine, de thymine, de guanine et de cytosine n'étaient pas trouvées en quantités égales et que les concentrations relatives des quatre bases nucléotidiques variaient d'une espèce à l'autre. à l'espèce, mais pas à l'intérieur des tissus d'un même individu ou entre individus d'une même espèce. Il a également découvert quelque chose d'inattendu : que la quantité d'adénine était égale à la quantité de thymine et que la quantité de cytosine était égale à la quantité de guanine (c'est-à-dire A = T et G = C). Différentes espèces avaient des quantités égales de purines (A+G) et pyrimidines (T + C), mais des rapports différents de A+T à G+C. Ces observations sont devenues connues sous le nom de Les règles de Chargaff . Les découvertes de Chargaff se sont avérées extrêmement utiles lorsque Watson et Crick se préparaient à proposer leur modèle de double hélice d'ADN ! Vous pouvez voir après avoir lu les dernières pages comment la science s'appuie sur des découvertes antérieures, parfois dans un processus lent et laborieux.

Question de pratique

Les expériences de Hershey et Chase ont permis de confirmer que l'ADN était le matériel héréditaire sur la base de la découverte que :

  1. des phages radioactifs ont été trouvés dans le culot
  2. des cellules radioactives ont été trouvées dans le surnageant
  3. du soufre radioactif a été trouvé à l'intérieur de la cellule
  4. du phosphore radioactif a été trouvé dans la cellule

En résumé : L'histoire de l'ADN

L'ADN a été isolé pour la première fois des globules blancs par Friedrich Miescher, qui l'a appelé nucléine parce qu'il a été isolé des noyaux. Les expériences de Frederick Griffith avec des souches de Streptococcus pneumoniae a fourni le premier indice que l'ADN peut être le principe de transformation. Avery, MacLeod et McCarty ont prouvé que l'ADN est nécessaire à la transformation des bactéries. Des expériences ultérieures de Hershey et Chase utilisant le bactériophage T2 ont prouvé que l'ADN est le matériel génétique. Chargaff a constaté que le rapport de A = T et C = G, et que le pourcentage de teneur en A, T, G et C est différent pour différentes espèces.


Quand un devient deux : Séparation de l'ADN pour une analyse plus précise des nanopores

Un nouvel outil logiciel développé par les chercheurs de l'Earlham Institute aidera les bioinformaticiens à améliorer la qualité et la précision de leurs données biologiques et à éviter les erreurs d'assemblage. L'outil rapide, léger et convivial visualise les assemblages de génomes et les alignements de gènes à partir des dernières technologies de séquençage de nouvelle génération.

Appelé Alvis, le nouvel outil de visualisation examine les correspondances entre les données de séquences d'ADN et les bases de données génomiques de référence. Cela permet aux bioinformaticiens d'analyser plus facilement leurs données générées à partir de tâches et de formats génomiques courants en produisant des images vectorielles efficaces et prêtes à l'emploi.

Le premier auteur et chercheur post-doctoral de l'Earlham Institute, le Dr Samuel Martin du groupe Leggett, a déclaré : « En règle générale, les outils d'alignement génèrent des fichiers en texte brut contenant des listes de données d'alignement. C'est idéal pour l'analyse informatique et pour être incorporé dans un pipeline, mais il peut être difficile à interpréter par les humains.

« La visualisation des données d'alignement peut nous aider à comprendre le problème posé. En tant que nouvelle technologie, plusieurs nouveaux formats d'alignement ont été mis en œuvre par de nouveaux outils spécifiques à la technologie de séquençage des nanopores.

« Nous avons constaté que les outils de visualisation existants n'étaient pas en mesure d'interpréter ces formats. Alvis peut être utilisé avec tous les formats d'alignement courants et est facilement extensible pour les futurs. »

Une caractéristique clé du nouvel outil de ligne de commande est sa capacité unique à mettre en évidence automatiquement des séquences chimériques - des maillons faibles dans la chaîne d'ADN. C'est là que deux séquences - provenant de différentes parties d'un génome ou d'espèces différentes - sont liées par erreur pour en faire une, affectant l'exactitude des données.

Les séquences de chimères peuvent être problématiques pour les bioinformaticiens lors de l'identification d'un ADN spécifique. La formation de chimères peut se produire physiquement aux molécules d'ADN lors de la préparation de la bibliothèque de séquençage, pendant le processus de séquençage sur certaines plates-formes et par des outils d'assemblage lors de la tentative de reconstituer un génome.

Au cours du développement de l'outil, l'équipe a comparé les assemblages de génomes avec et sans détection de chimère d'Alvis. L'image vectorielle produite montre un exemple de sortie, où l'outil intuitif suit toutes les lectures qu'il reconnaît comme des chimères.

"Bien que les séquences chimériques ne constituent pas une grande proportion des échantillons, elles peuvent avoir un effet significatif, nous devons donc veiller à les identifier lors de l'analyse", a déclaré le Dr Martin.

"Dans l'exemple de diagramme d'Alvis des données de chimères, chaque rectangle sur la page représente une lecture et les blocs colorés à l'intérieur représentent des alignements. La plupart des chimères sont faciles à voir car leurs alignements sont de couleurs différentes, ce qui signifie qu'elles correspondent à des génomes différents. D'autres sont plus subtile parce que les deux alignements concernent le même génome, mais des régions différentes."

L'outil Alvis peut localiser la visualisation des séquences chimériques uniquement pour une inspection plus approfondie et générer des données numériques décrivant les chimères. Cela démontre qu'en appliquant l'outil puis en divisant bio-informatiquement les chimères, la qualité des assemblages est considérablement améliorée.

Accédé plus de 600 fois depuis sa mise à disposition début mars de cette année, le Dr Martin ajoute : « Nous espérons qu'Alvis continuera d'être utile à d'autres chercheurs travaillant, par exemple, sur le séquençage des nanopores, améliorant leur compréhension de leurs données en visualisant les alignements. ,''.

« Les alignements sont si fondamentaux en bioinformatique qu'ils pourraient être utiles à toute personne travaillant avec des données de séquençage à lecture longue, ainsi que des alignements générés par des données de séquençage à partir de plates-formes à lecture courte. Les diagrammes générés par Alvis peuvent être facilement exportés pour être directement utilisés dans des publications. , démontré dans notre étude déjà."


A quoi sert la PCR ?

Une fois amplifié, l'ADN produit par PCR peut être utilisé dans de nombreuses procédures de laboratoire différentes. Par exemple, la plupart des techniques de cartographie du Human Genome Project (HGP) reposaient sur la PCR.

La PCR est également utile dans un certain nombre de techniques de laboratoire et cliniques, y compris les empreintes génétiques, la détection de bactéries ou de virus (en particulier le SIDA) et le diagnostic de troubles génétiques.

Une fois amplifié, l'ADN produit par PCR peut être utilisé dans de nombreuses procédures de laboratoire différentes. Par exemple, la plupart des techniques de cartographie du Human Genome Project (HGP) reposaient sur la PCR.

La PCR est également utile dans un certain nombre de techniques de laboratoire et cliniques, y compris les empreintes génétiques, la détection de bactéries ou de virus (en particulier le SIDA) et le diagnostic de troubles génétiques.


Qui a découvert la structure de l'ADN ?

La structure en double hélice de l'ADN a été découverte pour la première fois en 1953 par James Watson (un biologiste américain), Francis Crick (un physicien anglais) et Rosalind Franklin (une chimiste anglaise). Bien que seuls Watson et Crick aient été crédités de la découverte de la double hélice, on pense qu'ils ont fait leur découverte à l'aide des données de Franklin. Franklin était une experte dans une technique d'imagerie appelée cristallographie aux rayons X, qu'elle a utilisée pour produire la toute première image de la forme hélicoïdale de l'ADN.

Watson et Crick ont ​​reçu le prix Nobel pour leurs travaux en 1962. Malgré sa contribution à la découverte, Franklin n'a pas reçu le prix, étant décédé d'un cancer quatre ans plus tôt.


Questions préliminaires

Discutez de ce qui suit entre vous. Soyez prêt à partager vos réflexions avec le reste de la classe.

  1. L'ampicilline est un dérivé de l'antibiotique pénicilline. Il perturbe la formation de la paroi cellulaire dans les cellules bactériennes, ce qui tue les cellules. Cependant, notre plasmide recombinant contient un gène qui fournit une résistance aux antibiotiques en produisant une protéine qui décompose l'ampicilline. Pourquoi incluons-nous l'ampicilline dans le milieu de test ?
  2. Que se passera-t-il si les cellules transformées ne se développent pas en présence de l'inducteur chimique ?
  3. Dans l'expérience, vous ajouterez les groupes de cellules témoins et expérimentaux sur différentes combinaisons de supports. Que prédisez-vous pour chaque condition ? Remplir Tableau 1 en indiquant si vous prévoyez une croissance ou pas de croissance, et si croissance, y aura-t-il une croissance minimale ou beaucoup de croissance.

Lisez les procédures ci-dessous et décrivez les étapes, en utilisant des mots et un organigramme dans votre cahier de laboratoire.


Comment l'ADN est arrangé dans la cellule

L'ADN est une molécule fonctionnelle, il doit être répliqué lorsqu'une cellule est prête à se diviser, et il doit être « lu » pour produire les molécules, telles que les protéines, afin de remplir les fonctions de la cellule. Pour cette raison, l'ADN est protégé et conditionné de manière très spécifique. De plus, les molécules d'ADN peuvent être très longues. Étirées de bout en bout, les molécules d'ADN d'une seule cellule humaine viendraient à un longueur d'environ 2 mètres. Ainsi, l'ADN d'une cellule doit être conditionné de manière très ordonnée pour s'adapter et fonctionner au sein d'une structure (la cellule) qui n'est pas visible à l'œil nu. Les chromosomes des procaryotes sont beaucoup plus simples que ceux des eucaryotes dans plusieurs de leurs caractéristiques (Figure 9.6). La plupart des procaryotes contiennent un seul chromosome circulaire qui se trouve dans une zone du cytoplasme appelée nucléoïde.

Figure 9.6 Un eucaryote contient un noyau bien défini, alors que chez les procaryotes, le chromosome se trouve dans le cytoplasme dans une zone appelée nucléoïde.

La taille du génome chez l'un des procaryotes les mieux étudiés, Escherichia coli, est de 4,6 millions de paires de bases, ce qui s'étendrait sur une distance d'environ 1,6 mm si étiré. Alors, comment cela s'intègre-t-il dans une petite cellule bactérienne? L'ADN est tordu au-delà de la double hélice dans ce qu'on appelle le superenroulement. Certaines protéines sont connues pour être impliquées dans le superenroulement, d'autres protéines et enzymes aident à maintenir la structure superenroulée.

Les eucaryotes, dont les chromosomes sont chacun constitués d'une molécule d'ADN linéaire, utilisent un type différent de stratégie d'emballage pour adapter leur ADN à l'intérieur du noyau. Au niveau le plus élémentaire, l'ADN est enroulé autour de protéines appelées histones pour former des structures appelées nucléosomes. L'ADN est enroulé étroitement autour du noyau d'histone. Ce nucléosome est lié au suivant par un court brin d'ADN exempt d'histones. Ceci est également connu sous le nom de structure « perles sur une chaîne », les nucléosomes sont les « perles » et les courtes longueurs d'ADN entre elles sont la « chaîne ». Les nucléosomes, avec leur ADN enroulé autour d'eux, s'empilent de manière compacte les uns sur les autres pour former une fibre de 30 nm de large. Cette fibre est ensuite enroulée en une structure plus épaisse et plus compacte. Au stade métaphasique de la mitose, lorsque les chromosomes sont alignés au centre de la cellule, les chromosomes sont les plus compactés. Ils ont une largeur d'environ 700 nm et se trouvent en association avec des protéines d'échafaudage.

En interphase, phase du cycle cellulaire entre les mitoses au cours de laquelle les chromosomes sont décondensés, les chromosomes eucaryotes possèdent deux régions distinctes que l'on peut distinguer par coloration. Il y a une région étroitement emballée qui tache sombrement et une région moins dense. Les régions de coloration sombre contiennent généralement des gènes qui ne sont pas actifs et se trouvent dans les régions du centromère et des télomères. Les régions légèrement colorées contiennent généralement des gènes actifs, avec de l'ADN emballé autour des nucléosomes mais pas davantage compacté.

Figure 9.7 Ces figures illustrent la compaction du chromosome eucaryote.


Génie génétique chez les plantes

En raison de leur importance économique, les plantes font depuis longtemps l'objet d'analyses génétiques visant à développer des variétés améliorées. La technologie de l'ADN recombinant a introduit une nouvelle dimension à cet effort car les modifications du génome rendues possibles par cette technologie sont presque illimitées. La sélection ne se limite plus à sélectionner des variantes au sein d'une espèce donnée. L'ADN peut maintenant être introduit à partir d'autres espèces de plantes, d'animaux ou même de bactéries.

Plasmide Ti.  

Les seuls vecteurs couramment utilisés pour produire des plantes transgéniques sont dérivés d'une bactérie du sol appelée Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie provoque ce qu'on appelle maladie de la galle du collet, dans laquelle la plante infectée produit des excroissances incontrôlées (tumeurs ou galles), normalement à la base (couronne) de la plante. La clé de la production tumorale est un grand plasmide à ADN circulaire (200 kb), le plasmide Ti (inducteur de tumeur). Lorsque la bactérie infecte une cellule végétale, une partie du plasmide Ti — une région appelée ADN-T — est transférée et insérée, apparemment plus ou moins au hasard, dans le génome de la plante hôte (Figure 13-14 ). Les fonctions nécessaires à ce transfert sont en dehors de l'ADN-T sur le plasmide Ti. L'ADN-T lui-même exerce plusieurs fonctions intéressantes, notamment la production de la tumeur et la synthèse de composés appelés opines. Les opines sont en fait synthétisées dans la plante hôte sous la direction de l'ADN-T. La bactérie utilise ensuite les opines à ses propres fins, en faisant appel à des gènes utilisateurs d'opines sur le plasmide Ti. Deux opines importantes sont la nopaline et l'octopine, deux plasmides Ti distincts les produisent. La structure de Ti est illustrée à la figure 13-15.

13-14

En train de provoquer la maladie de la galle du collet, la bactérie A. tumefaciens insère une partie de son plasmide Ti — une région appelée ADN-T — dans un chromosome de la plante hôte.

13-15

Représentation simplifiée des régions majeures du plasmide Ti de A. tumefaciens. L'ADN-T, lorsqu'il est inséré dans l'ADN chromosomique de la plante hôte, dirige la synthèse de la nopaline, qui est ensuite utilisée par la bactérie à ses propres fins. ADN-T (plus. )

Le comportement naturel du plasmide Ti le rend bien adapté au rôle de vecteur végétal. Si l'ADN d'intérêt pouvait être épissé dans l'ADN-T, alors le paquet entier serait inséré dans un état stable dans un chromosome de plante. Ce système a en effet été fait pour fonctionner essentiellement de cette manière, mais avec quelques modifications nécessaires. Examinons un protocole.

Les plasmides Ti sont trop gros pour être facilement manipulés et ne peuvent pas être facilement rendus plus petits, car ils contiennent peu de sites de restriction uniques. Par conséquent, un vecteur intermédiaire plus petit reçoit initialement l'insert d'intérêt et les divers autres gènes et segments nécessaires à la recombinaison, la réplication et la résistance aux antibiotiques. Lorsqu'il est conçu avec les éléments génétiques souhaités, ce vecteur intermédiaire peut ensuite être inséré dans le plasmide Ti, formant un plasmide cointégré qui peut être introduit dans une cellule végétale par transformation. La figure 13-16a montre une méthode de création de la cointégration. Le plasmide Ti qui recevra le vecteur intermédiaire est d'abord atténué, c'est-à-dire que toute la région droite de son ADN-T, y compris les gènes tumoraux et les gènes de synthèse de la nopaline, est supprimée, ce qui le rend incapable de former une tumeur. Aspect “nuisance” de la fonction ADN-T. Il conserve la bordure gauche de son ADN-T, qui servira de site de croisement pour l'incorporation du vecteur intermédiaire. Le vecteur intermédiaire a eu un segment de clonage pratique épissé, contenant une variété de sites de restriction uniques. Le gène d'intérêt a été inséré à ce site sur la figure 13-16. Un gène bactérien sélectionnable est également épissé dans le vecteur (CPS R ) pour la résistance à la spectinomycine un gène bactérien de résistance à la kanamycine (kan R ), conçu pour l'expression dans les plantes et deux segments d'ADN-T. Un segment porte le gène de synthèse de la nopaline (non) plus la séquence de bordure d'ADN-T de droite. Le deuxième segment d'ADN-T vient de près de la bordure gauche et fournit une section pour la recombinaison avec une partie homologue de la région gauche, qui a été retenue dans le plasmide Ti désarmé. Après avoir introduit les vecteurs intermédiaires dans Agrobactérie cellules contenant les plasmides Ti désarmés (par conjugaison avec E. coli), les plasmides recombinants (cointégrés) peuvent être sélectionnés par étalement sur spectinomycine. Les colonies bactériennes sélectionnées ne contiendront que le plasmide Ti, car le vecteur intermédiaire est incapable de se répliquer dans Agrobactérie.

13-16

(a) Pour produire des plantes transgéniques, un vecteur intermédiaire de taille gérable est utilisé pour cloner le segment d'intérêt. Dans la méthode présentée ici, le vecteur intermédiaire est ensuite recombiné avec un plasmide Ti atténué (𠇍isarmed”) pour générer (plus.)

Comme le montre la figure 13-16b, après sélection à la spectinomycine pour les cointégrés, des bactéries contenant le plasmide double ou cointégrant recombinant sont ensuite utilisées pour infecter des segments coupés de tissu végétal, tels que des disques de feuilles perforés. Si une infection bactérienne des cellules végétales a lieu, tout matériel génétique entre les séquences de bordure gauche et droite de l'ADN-T peut être inséré dans les chromosomes de la plante. Si les disques foliaires sont placés sur un milieu contenant de la kanamycine, les seules cellules végétales qui subiront une division cellulaire sont celles qui ont acquis la kan Gène R issu du transfert d'ADN-T. La croissance de ces cellules entraîne la formation d'un amas, ou cal, ce qui indique que la transformation a eu lieu. Ces cals peuvent être amenés à former des pousses et des racines, moment auquel ils sont transférés dans le sol où ils se développent en plantes transgéniques (Figure 13-16b). Souvent, un seul insert d'ADN-T est détectable dans ces plantes, où il se sépare à la méiose comme un allèle mendélien régulier (Figure 13-17). L'insert peut être détecté par une sonde d'ADN-T dans une hybridation Southern ou peut être vérifié par la détection de la nopaline chimique dans le tissu transgénique.

13-17

L'ADN-T et tout ADN qu'il contient sont insérés dans un chromosome végétal de la plante transgénique, puis transmis selon un modèle d'hérédité mendélienne.

Expression de l'ADN cloné

L'ADN cloné dans l'ADN-T peut être n'importe quel ADN que l'investigateur souhaite insérer dans la plante en question. Un ADN étranger particulièrement frappant qui a été inséré à l'aide de l'ADN-T est le gène de l'enzyme luciférase, qui est isolé des lucioles. L'enzyme catalyse la réaction d'un produit chimique appelé luciférine avec l'ATP dans ce processus, de la lumière est émise, ce qui explique pourquoi les lucioles brillent dans le noir. Un plant de tabac transgénique exprimant le gène de la luciférase brillera également dans le noir lorsqu'il est arrosé avec une solution de luciférine (voir la photographie au début de ce chapitre). Une telle manipulation peut sembler être une tentative de développer une technologie pour fabriquer des arbres de Noël qui n'ont pas besoin de lumière, mais en fait, le gène de la luciférase est utile en tant que rapporteur pour surveiller la fonction de n'importe quel gène au cours du développement. En d'autres termes, les séquences promotrices en amont de tout gène d'intérêt peuvent être fusionnées au gène de la luciférase et introduites dans une plante par l'ADN-T. Ensuite, le gène de la luciférase suivra le même schéma de développement que celui du gène normalement régulé, mais le gène de la luciférase annoncera son activité en évidence en brillant à divers moments ou dans divers tissus, selon la séquence régulatrice.

D'autres gènes utilisés comme reporters chez les plantes sont les gènes bactériens. GUS (β-glucuronidase), qui transforme le composé X-Gluc en bleu, et le gène bactérien lac (β-galactosidase), qui vire au bleu X-Gal. Les cellules dans lesquelles ces reporters sont exprimés virent au bleu, et ce bleu est facilement visible à l'œil nu ou au microscope.

Des plantes transgéniques portant l'un quelconque d'une variété de gènes étrangers sont actuellement utilisées, et bien d'autres sont en cours de développement. Non seulement les qualités des plantes elles-mêmes sont manipulées, mais, comme les micro-organismes, les plantes sont également utilisées comme des usines pratiques pour produire des protéines codées par des gènes étrangers.


APERÇU DE LA PRATIQUE

Première session pratique

Chaque groupe d'étudiants reçoit un échantillon d'un plasmide avec un seul site EcoRI et qui est d'environ 3 kpb. Nous avons utilisé pUC118 pour les données présentées ici. On leur dit la concentration approximative du plasmide et l'A260 pour l'ADN double brin. Après avoir calculé une dilution appropriée, ils préparent une aliquote de 1 ml, qui est utilisée pour obtenir A260 et un280 lectures. Ils calculent maintenant la concentration réelle d'ADN de leur échantillon et font une série de dilutions qui donneront des quantités connues d'ADN pour 10 l de tampon TE de 1 g à 1 ng. Des aliquotes de dix microlitres des dilutions sont mélangées avec 2 ul de colorant de charge, et les échantillons mélangés ont été chargés dans les puits d'un gel d'agarose. Après l'électrophorèse, les gels sont colorés au bromure d'éthidium, visualisés sous lumière UV, et l'image enregistrée pour retour aux étudiants pour leur interprétation.

Deuxième session pratique

Dans cette session, les étudiants reçoivent des échantillons du plasmide utilisé dans la première session et des échantillons d'ADN circulaire double brin (RFI) et circulaire simple brin (SS + ) du bactériophage M13.

Chaque groupe d'étudiants traite l'ADN circulaire fermé de manière covalente (ccc, RFI) et l'ADN circulaire simple brin (SS + ) du bactériophage M13 avec l'ADN Topoisomérase I et avec l'endonucléase de restriction EcoRI. L'ADN plasmidique (pUC118) est également traité par EcoRI et par l'ADN Topoisomérase I. Après digestion, les différentes formes d'ADN M13 et pUC118 sont séparées par électrophorèse sur gel d'agarose en l'absence de bromure d'éthidium. Les gels sont colorés après électrophorèse et visualisés et enregistrés comme pour la première séance.


L'avenir de l'analyse ADN

Les premières techniques d'analyse d'ADN nécessitaient de grandes quantités d'ADN d'assez bonne qualité. Cependant, les nouvelles procédures peuvent produire des résultats d'ADN avec des échantillons beaucoup plus petits et de moindre qualité, et dans un délai beaucoup plus court. Techniques have also been developed to extract usable DNA from difficult-to-access or contaminated sources.

DNA analysis is still not fool-proof and there are instances when it doesn’t live up to expectations. Usually, DNA analysis provides insights or evidence, but it doesn’t always provide definitive answers. The interpretation of DNA results is still largely dependent on experts, but home DNA testing means that the information contained in your DNA is becoming more accessible and affordable all the time.

Dmitri Synogatch
Joseph Kim

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How can I start a DNA test lab in India?

Please let me know the procedure to start a DNA testing lab, the equipments required and the licensing authority.

Sonja jurisic

I am enquiring re my cousin who did DNA test. He got a large procentage for Balkan and Greece. Prior to Slavic move to Balkan, there were Ilyrian tribes in the area and others. What period does Balkan and Greek refers to, prior to Slavic move or after? Merci
Sonja Jurisic

Mark Hicks

DNA has changed humanity to it’s extinction. It’s how they are thinning the heard.

Alexander abary

My basic knowledge of DNA analysis, after reading your monologue, is now comprehensive, understandably complete, that I can utilize in years to come. One crazy question: Can you tell a living creature to be half human and half animal belonging to the same species? Just my curiosity.