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Où est la faille dans mon traitement antituberculeux proposé ?


Il y a dix ans, j'ai envoyé un e-mail à un éminent spécialiste des poumons avec ma suggestion de traitement contre la tuberculose. Son absence de réponse m'a amené à croire que l'idée n'avait aucun mérite - mais je n'avais aucune idée de ce que pourraient être les échecs. Je ne le fais toujours pas et j'espère que quelqu'un m'éclairera sur les raisons pour lesquelles cela ne vaut pas la peine d'être exploré.

L'idée est basée sur le fait que Mycobacterium Tuberculosis est aérobie - en fait, Wikipedia déclare qu'il "exige des niveaux élevés d'oxygène". J'avais entendu dire que les « sanatoriums » de la tuberculose pratiquaient le traitement de la fracture des côtes d'un côté pour effondrer ce poumon et le « reposer ». Il m'a semblé que ce repos affamait en fait la bactérie d'oxygène et tuait l'infestation.

Ma suggestion est que nous profitions d'avoir deux poumons en insérant une paire de tubes respiratoires dans les voies respiratoires et dans la tête des deux bronches : il peut être nécessaire d'utiliser des ultrasons ou une autre imagerie pour positionner avec précision les tubes.

Nous introduisons de l'azote pur dans un tube et de l'oxygène/azote 40/60 dans l'autre - double concentration en oxygène. Le patient reçoit donc tous ses besoins en oxygène par un seul poumon. Après un certain temps, lorsque nous jugeons que les bactéries du poumon « affamé » sont toutes mortes, nous passons les fournitures aux 2 tubes et traitons l'autre poumon.

Quelqu'un peut-il voir pourquoi cette idée est si imparfaite?


  • Une concentration élevée en oxygène peut être délétère ; il peut induire des dommages oxydatifs.
  • La circulation sanguine systémique fournirait de l'oxygène au poumon "privé d'oxygène".
  • De plus, Mycobactéries peut survivre dans des conditions anaérobies.

Et si les deux poumons sont infectés ? Il y a beaucoup de défauts dans la thérapie proposée.

Ajout de ce point dans l'un des commentaires ci-dessous :

Il existe plusieurs cas de tuberculose extrapulmonaire et dans ces cas, traiter uniquement le poumon n'aurait pas de sens.


La réponse acceptée est correcte mais je voudrais souligner un malentendu qui doit sous-tendre l'idée que cela fonctionnerait :

En réalité, les poumons ne sont pas une porte magique à sens unique pour les divers gaz. Les poumons n'extraient pas l'oxygène de l'air, ils permettent l'échange d'oxygène entre l'air et le sang. Étant donné que l'air a normalement un niveau d'oxygène plus élevé que le sang, le résultat est un transfert net d'oxygène vers le sang - quelque chose que nous considérons comme l'extraction de l'oxygène de l'air.

Cependant, dans un environnement anoxique, vous obtiendrez l'inverse - l'oxygène se déplacera du sang (certes, pas trop car c'est du sang qui a déjà traversé le corps) dans l'air.

C'est aussi pourquoi trop de dioxyde de carbone est mortel - les poumons n'ont pas non plus la capacité magique de l'expulser. Normalement, il passe de la concentration la plus élevée (le sang) à la concentration la plus faible (l'air dans les poumons). Trop et vous ne pouvez pas vous en débarrasser, ou dans les cas extrêmes même en obtenir plus.


Quelle belle question ! Je suis désolé d'ajouter un autre coup à votre théorie… mais… Même si l'épuisement de l'oxygène serait efficace, traiter les poumons seuls n'est pas suffisant. Assez vrai, Mycobacterium tuberculosis les bactéries attaquent généralement les poumons, mais les bactéries tuberculeuses peuvent également attaquer d'autres parties du corps telles que les reins, la colonne vertébrale et le cerveau (Fig. 1). Si elle n'est pas traitée correctement, la tuberculose peut être mortelle. Parce que la bactérie de la tuberculose a le potentiel d'infecter diverses parties du corps, un traitement systémique est nécessaire et les antibiotiques à long terme sont donc le traitement de première intention (Source : Center for Disease Control and Prevention).

En fait, il y a la tuberculose du poumons, méningite tuberculeuse (infection du cerveau membranes), squelettique tuberculose, génito-urinaire tuberculose et gastro-intestinal TB (Source : Medscape).


Fig. 1. Signes et symptômes de l'infection tuberculeuse dans diverses parties du corps. Source : Paysages d'infection.


Le problème le plus évident que je vois pour ce traitement contre la tuberculose est que les mycobactéries peuvent survivre sans oxygène. La tuberculose latente (une personne est infectée mais n'a pas de tuberculose active) est l'un des problèmes majeurs dans le traitement de la tuberculose et un tiers de la population mondiale souffre de tuberculose latente ! (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/). Un nouveau traitement antituberculeux ne peut être efficace que s'il cible à la fois les bactéries actives et dormantes.

Bien sûr, d'autres aspects doivent être pris en compte. Plus de 95 % des décès dus à la tuberculose surviennent dans les pays à revenu faible ou intermédiaire où l'accès aux médicaments et aux hôpitaux est réduit. Un nouveau traitement doit avoir un prix abordable, être simple et rapide (http://aac.asm.org/content/53/3/849.full). Ce sont d'autres limitations du traitement suggéré.


Proposer un nouveau médicament pour traiter la tuberculose en utilisant des simulations informatiques de pointe

Crédit : COPYRIGHT (C) UNIVERSITÉ DE TECHNOLOGIE TOYOHASHI. TOUS LES DROITS SONT RÉSERVÉS.

L'équipe de recherche du Département d'informatique et d'ingénierie de l'Université de technologie de Toyohashi et de l'Institut de biotechnologie alimentaire et de génomique de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine ont proposé un nouveau médicament pour traiter la tuberculose (TB), en utilisant l'état de -des simulations moléculaires de pointe. Ce médicament peut inhiber la division cellulaire de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculose) et supprimer sa croissance. De plus, parce que ce médicament agit sur les enzymes sécrétées par M. tuberculose au lieu d'agir sur M. tuberculose lui-même, M. tuberculose a très peu de chance de mutation et ne développe aucune résistance aux médicaments. Par conséquent, on s'attend à ce que ce médicament conduise à un nouveau médicament qui conservera son efficacité pendant longtemps.

Actuellement, la propagation mondiale du COVID-19 causée par le nouveau coronavirus est devenue un problème social majeur. De même, la tuberculose causée par M. tuberculose est également l'une des maladies infectieuses les plus dangereuses au monde à ce jour, et divers médicaments utilisés pour traiter la tuberculose ont été développés. Cependant, comme le M. tuberculose mute facilement, ses nouveaux mutants ont la possibilité de conserver une résistance contre les médicaments existants, ce qui les rend inefficaces. Ce fait est un goulot d'étranglement majeur pour la poursuite du développement des médicaments antituberculeux.

Par conséquent, pour prévenir l'apparition de cette résistance aux médicaments, les médicaments qui agissent sur les enzymes sécrétées par M. tuberculose à la place de M. tuberculose lui-même sont en cours de développement. Dans cette recherche, nous avons ciblé la protéine cytosquelettique FtsZ, qui est essentielle pour M. tuberculose pour effectuer la division cellulaire, et en inhibant cette fonction, nous avons cherché à développer un nouveau médicament qui inhibe la division cellulaire de M. tuberculose et supprime sa croissance. À cette fin, nous avons utilisé la méthode de simulation moléculaire de pointe et de haute précision développée par notre groupe de recherche pour analyser les propriétés de liaison entre FtsZ et les différents composés candidats-médicaments. Sur la base des résultats simulés, nous avons proposé le composé qui se lie plus fortement à FtsZ en tant que nouveau médicament pour traiter la tuberculose.

L'étudiant à la maîtrise et auteur principal de cet article, Shohei Yamamoto, réfléchit à cette époque ci-dessous. « Parce que la protéine FtsZ ciblée dans cette recherche a de nombreuses positions où les composés peuvent s'y lier, nous avons eu des difficultés à identifier les positions de la protéine FtsZ dans lesquelles les composés considérés comme des candidats médicaments se lieraient le plus fortement dans la simulation moléculaire. Je pense qu'étant capable de résoudre ce problème a conduit à la proposition d'un médicament thérapeutique contre la tuberculose. »

En outre, le chef de l'équipe de recherche, le professeur agrégé Noriyuki Kurita, raconte ci-dessous comment la recherche a commencé. "Cette recherche est une collaboration avec mes vieux amis de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine. Je me souviens il y a environ cinq ans, lorsque j'ai visité un laboratoire à Kiev, en Ukraine et que j'ai découvert pour la première fois une protéine appelée FtsZ, j'ai répondu que sa structure était trop complexe et qu'il serait difficile d'étudier ses propriétés de liaison avec des composés de type médicament dans nos simulations moléculaires. Cependant, mes amis m'ont demandé à plusieurs reprises de commencer les calculs, et finalement notre étude de collaboration intime a commencé. Je pense que l'Europe de l'Est les chercheurs ont tendance à approfondir des thèmes de recherche difficiles même si cela prend beaucoup de temps, et qu'il y a beaucoup de choses que nous pourrions apprendre de la façon dont ils procèdent dans leurs recherches. »

Actuellement, nous demandons que le composé proposé dans cet article soit synthétisé dans un laboratoire ukrainien et que ses effets soient étudiés par des expériences cellulaires, mais en raison de la situation économique de l'autre partie, il semble que cela prendra du temps à réaliser. De plus, la méthode de simulation moléculaire utilisée dans cette recherche peut être appliquée à d'autres protéines, et nous menons actuellement des calculs dans le but de proposer de nouveaux inhibiteurs pour les protéines du nouveau coronavirus.

Cette recherche a été menée dans le cadre d'un programme de stage international soutenu par l'Organisation japonaise des services aux étudiants (JASSO), des programmes d'échange d'étudiants et d'échange de recherche entre l'Université de technologie de Toyohashi et l'Institut de biotechnologie alimentaire et de génomique de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine. Nous tenons à remercier le professeur Yaroslav Blume, le professeur Sergey Shulga et le docteur Karpov Pavel de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine pour avoir fourni des informations précieuses pour faire avancer cette recherche conjointe.

"Conception d'inhibiteurs puissants contre la protéine de division cellulaire bactérienne FtsZ: amarrage moléculaire et calculs orbitales moléculaires ab initio", Yamamoto, S. Saito, R. Nakamura, S. Sogawa, H. Karpov, P. Shulga, S. Blume, Y Kurita, N., Antibiotiques, 2020, 9, 846 doi:10.3390/antibiotiques9120846.

"Sites de liaison des inhibiteurs de Zantrin à la protéine de division cellulaire bactérienne FtsZ: amarrage moléculaire et calculs orbitales moléculaires ab initio", Sogawa, H. Sato, R. Suzuki, K. Tomioka, S. Shinzato, T. Karpov, P. Shulga, S. Blume, Y. Kurita, N., Physique chimie, 2020, 530, 110603.

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Fond

La tuberculose causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est une maladie infectieuse chronique répandue et mortelle. De manière générale, le VTT affecte généralement les poumons. La maladie est transmise par des gouttelettes provenant de la gorge et des poumons des personnes atteintes d'une infection aiguë, et environ un tiers de la population mondiale est aujourd'hui infecté par le Mtb [1]. Les porteurs de VTT peuvent devenir des individus infectieux toute leur vie. La probabilité de passer de l'état latent à l'état actif n'est que d'environ 1/10 à 1/5. Cependant, dans les statistiques de 2017 [2], environ 10,0 millions de personnes contractent la tuberculose, dont 59 % sont de nouveaux cas. La tuberculose est toujours l'une des 10 principales causes de décès. La prévention, le diagnostic et le traitement de la tuberculose nécessitent un financement adéquat. La tuberculose étant une maladie chronique, le soutien matériel doit être maintenu pendant longtemps. Au cours de la dernière décennie, le soutien financier à la prévention de la tuberculose a augmenté, mais des déficits de financement existent toujours. L'éradication de la tuberculose est un défi à l'échelle mondiale, en particulier en Asie du Sud-Est et en Afrique. La chimiothérapie et les antibiotiques sont devenus des mesures puissantes pour l'élimination de la maladie depuis le 20e siècle. La plupart des décès dus à la tuberculose peuvent être évités grâce à un diagnostic précoce et à un traitement efficace qui a sauvé environ 54 millions de personnes entre 2000 et 2017 [2]. La stratégie DOTS est une mesure de contrôle formulée et mise en œuvre par l'OMS pour mettre fin à la transmission de la tuberculose. Une proportion plus faible de transmissions récentes est observée dans le comté avec une mise en œuvre DOTS à long terme [3] et la stratégie DOTS est maintenant considérée comme la mesure de contrôle la plus appropriée pour le principe de rentabilité. La Chine est l'un des pays les plus touchés par la tuberculose au monde, plus de 80 % d'infections se trouvent dans les régions du centre-ouest de la Chine et le problème de la résistance aux médicaments est très grave. Pour la prévention et le contrôle de la tuberculose, le gouvernement chinois a pris une série de mesures, notamment la couverture universelle de la stratégie DOTS. La mise en œuvre de cette stratégie a permis d'améliorer considérablement le diagnostic et le traitement de la tuberculose.

Au cours des dernières décennies, le modèle mathématique a joué un rôle important dans le contrôle des maladies. Le système dynamique peut décrire le processus de transmission de la tuberculose. Les modèles d'équation différentielle sont largement utilisés dans l'étude de la tuberculose, en particulier, des modèles de réseau complexes sont appliqués pour décrire la complexité en raison de la caractérisation topologique. Cinq modèles de réseaux complexes différents sont établis pour étudier la transmission de la tuberculose et aider à éradiquer la maladie [4]. L'ajustement des données offre une combinaison appropriée d'analyse théorique et de situation pratique. Des données démographiques et épidémiologiques ont été utilisées pour explorer les effets de la croissance démographique, du caractère aléatoire, du regroupement des contacts et de la structure par âge sur la dynamique de la TB dans [5]. Il existe maintenant plusieurs travaux axés sur la tuberculose, qui ont été étudiés à travers de nombreux facteurs, tels que la progression rapide et lente [6], les souches résistantes aux médicaments [7], la réinfection [8, 9], la co-infection [10], la migration et la saisonnalité [11, 12]. Pour la prévention de la TB, le modèle formulé avec l'isolement [13], le traitement [14], la vaccination [15] ou une combinaison de différentes stratégies de contrôle [16–18] sont discutés. D'un autre côté, si les gens prennent l'initiative de prendre conscience de la prévention et du contrôle, l'effet sera meilleur. Das et al. [19] étudient l'influence de la sensibilisation sociale diffusée par les médias dans la dynamique de transmission de la TB et la stratégie de contrôle optimale correspondante avec un coût minimum est également donnée. Pour faire un meilleur contrôle, la théorie du contrôle optimal est appliquée dans de nombreux domaines, tels que la conception de la thérapie [20], le contrôle optimal de la maladie chez les animaux [21] et la meilleure stratégie de prévention de la TB [22, 23]. De nos jours, l'impact de la stratégie DOTS sur le contrôle de la tuberculose en Chine est rare, de plus, l'étude de l'ensemble de la situation de la tuberculose en Chine est encore absente puisque les données rapportées sont disponibles.

Les nouveaux cas de tuberculose signalés en Chine augmentent fortement vers l'année 2004, de sorte que l'étude est divisée en deux étapes. Dans cet article, nous étudions les tendances de la tuberculose en nous concentrant principalement sur la couverture complète de la stratégie DOTS en Chine au cours des deux dernières décennies. L'analyse théorique du système dynamique et l'estimation du nombre de reproduction de base avant et après la couverture à 100 % de la stratégie DOTS qui est basée sur les cas de tuberculose signalés en Chine sont présentées. Nous étudions les efforts de la stratégie DOTS à travers le nombre de reproduction de base des deux étapes. La couverture complète de la stratégie DOTS a évidemment réduit le niveau de TB, mais la maladie existe toujours ( (mathcal _<0>>1) ). Ensuite, divers autres contrôles de la tuberculose sont analysés et simulés. Nos résultats théoriques et nos simulations numériques sont d'une grande aide pour concevoir une stratégie de contrôle optimale dans la pratique.


Méthodes

Collection d'ensembles de gènes de signature TB publiés

Notre objectif était de compiler un ensemble complet de listes de gènes de signature multigénique et de les rendre disponibles via notre plateforme TBSignatureProfiler. Le seul critère d'inclusion dans cette étude était que l'ensemble de gènes de signature se composait d'au moins deux gènes et était utilisé et présenté comme un biomarqueur d'un résultat de la TB (maladie, risque, traitement, etc.) dans une publication évaluée par des pairs. Nous avons collecté un ensemble de 45 ensembles de gènes précédemment publiés au total (tableau 1). Les références de ces ensembles de gènes sont disponibles dans les documents supplémentaires et dans la documentation du logiciel TBSignatureProfiler. Ces ensembles de gènes ont été dérivés de plusieurs études, utilisant plusieurs plates-formes de profilage transcriptionnel et utilisant des méthodes et des algorithmes prédictifs disparates. En tant que tel, nous avons défini le terme « ensembles de gènes » ou « signature » ​​comme la collection de gènes qui ont été utilisés dans le modèle prédictif dans son étude originale. Nous définissons ensuite le « ensemble de gènes/force de signature » ​​ou « ensemble de gènes/score de signature » ​​par le score d'enrichissement de l'ensemble de gènes d'un seul échantillon pour cet ensemble. Pour la présentation, les signatures génétiques sont étiquetées en utilisant le nom de famille du premier auteur et le nombre de gènes dans la signature (par exemple, Berry_393). Les ensembles de gènes qui se concentrent sur la présence d'une comorbidité avec la tuberculose et une autre maladie ont des étiquettes supplémentaires. Les détails de ces conventions de nommage sont disponibles dans les méthodes supplémentaires. Nous avons également inclus deux biomarqueurs monogéniques précédemment proposés, NPC2 [33] et BATF2 [34, 35], en utilisant leurs comptes d'expression génique dans notre comparaison.

Plateforme TBSignatureProfiler

Les 45 ensembles de gènes de résultats de la tuberculose publiés précédemment sont inclus dans notre TBSignatureProfiler, un nouveau package R qui permet aux utilisateurs d'effectuer rapidement et facilement une analyse d'enrichissement de la voie d'un échantillon unique à l'aide de notre ensemble d'ensembles de gènes de signature de la tuberculose et de plusieurs méthodes de notation, notamment ssGSEA, GSVA, PLAGE, combinant Z-scores, ASSIGN et singscore [36,37,38,39,40,41] (ces méthodes sont détaillées dans les Méthodes supplémentaires). Ce flux de travail peut ensuite être utilisé pour profiler et visualiser ces ensembles de gènes/voies et fonctions de traçage dans notre package TBSignatureProfiler R. Le package R est disponible sur GitHub (https://github.com/compbiomed/TBSignatureProfiler) et via Bioconductor (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/TBSignatureProfiler.html). Des détails supplémentaires pour la visualisation des scores et les fonctions de comparaison sont détaillés dans les méthodes supplémentaires et dans la vignette du progiciel.

Individus sous-alimentés de RePORT-India

Nos échantillons de malnutrition provenaient de la cohorte Regional Prospective Observational Research in TB (RePORT)-Inde basée au Jawaharlal Institute of Postgraduate Medical Education and Research (JIPMER). L'étude est menée en collaboration avec le Boston Medical Center et la Rutgers-New Jersey Medical School. L'approbation éthique a été obtenue par les comités JSAC et IEC de JIPMER et les comités d'examen institutionnel du Boston Medical Center et de l'Université Rutgers. Cette étude sur les contacts familiaux inclut des cas de tuberculose pulmonaire à frottis positif et confirmés par culture récemment diagnostiqués dans les cliniques du Programme national révisé de lutte contre la tuberculose ainsi que leurs contacts familiaux. Des détails supplémentaires sur l'étude ont déjà été rapportés [19, 42, 43, 44]. En bref, les cas index sont visités à l'inscription, à 1, 2, 6 et 12 mois et les contacts familiaux à l'inscription, à 12 et 24 mois. Le sang est collecté dans des tubes de séquençage d'ARN PaxGene à chaque instant. Les contacts familiaux subissent un test cutané à la tuberculine (TST) pour l'ITL et sont surveillés pour détecter les symptômes d'une TB active. Des tests d'expectoration sont effectués sur des individus symptomatiques.

En plus des caractéristiques démographiques, les questionnaires abordent les comorbidités pertinentes qui affectent la réponse de l'hôte et le risque de tuberculose, notamment le VIH, le diabète, l'insuffisance rénale, d'autres affections immunosuppressives, la consommation d'alcool (et la consommation d'alcool à risque sur la base du test d'identification des troubles de la consommation d'alcool [45], le tabagisme et d'autres paramètres. Ces valeurs sont résumées dans le tableau 2. L'IMC des participants est mesuré au départ et classé en malnutrition sévère (IMC < 16 kg/m2), malnutrition (16-18,4) et normal/surpoids (> 18,4) Chez les individus de moins de 18 ans, l'IMC a été classé en fonction des écarts-types par rapport à la médiane de l'Organisation mondiale de la santé : les enfants dont l'IMC était à plus de deux écarts-types de la médiane de leur âge ont été classés comme dénutri [46] Dans les cas index, des échantillons de sang sont prélevés pour diagnostiquer le diabète sucré (glycémie aléatoire > 200 mg/dL) et le VIH.

Génération et traitement des données de séquençage d'ARN

Nous avons analysé les données RNA-seq des tubes PaxGene d'enrôlement d'un sous-ensemble de 23 personnes gravement malnutries atteintes de tuberculose et de 15 contacts familiaux positifs au test cutané à la tuberculine sévèrement malnutri (TST ≥5 mm) comme décrit précédemment [19]. Les données ont été corrigées par lots à l'aide de ComBat-Seq [47, 48] (Figure supplémentaire 1). L'expression différentielle entre les échantillons de TB et de LTBI a produit 6706 caractéristiques exprimées de manière différentielle en utilisant un p-valeur (FDR) seuil de 0,01, y compris 4913 gènes codant pour des protéines, 1052 lncRNAs, 135 éléments récepteurs des cellules T, 19 gènes d'immunoglobulines et 13 miRNAs. La liste des gènes codant pour les protéines a été utilisée pour développer une liste de gènes et de voies différentiellement exprimés de la TB par rapport à la LTBI. Des méthodes détaillées pour le traitement des tubes PaxGene, le séquençage de l'ARN et l'analyse des données sont disponibles dans les méthodes supplémentaires.


Notes de bas de page

Explication de la série : Les revues sur l'état de l'art sont commandées sur la base de leur pertinence pour les universitaires et les spécialistes aux États-Unis et à l'étranger. Pour cette raison, ils sont écrits principalement par des auteurs américains

Remerciements : Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases des États-Unis.

Contribution : YLX, CEB et RYC ont développé l'idée de cette revue. AL, YLX et RYC ont effectué la recherche documentaire. AL, YLX, CEB et RYC ont rédigé la critique. RYC est le garant. L'auteur correspondant atteste que tous les auteurs répertoriés répondent aux critères de paternité et qu'aucun autre répondant aux critères n'a été omis.

Intérêts concurrents : Le BMJ a jugé qu'il n'y a pas de liens financiers disqualifiants avec des sociétés commerciales. L'auteur déclare les autres intérêts suivants : aucun.


Analyse de contrôle optimal de la tuberculose (TB) avec vaccination et traitement

La tuberculose reste un défi sanitaire majeur pour les humains du monde entier, notamment dans les pays en développement dont le Pakistan. Bien qu'il s'agisse d'une maladie évitable et curable, la tuberculose est toujours la principale cause de mortalité infectieuse au monde et l'une des principales maladies causant morbidité et mortalité. Dans cet article, nous formulons un modèle déterministe pour étudier la dynamique et le contrôle possible de la maladie tuberculeuse. Dans un premier temps, nous développons le modèle sans variables de contrôle et présentons l'analyse mathématique de base du modèle. Les résultats de stabilité du modèle chez le cas sans maladie sont présentés lorsque (mathcal _<0><1,) et en outre, il est prouvé que l'infection persistera uniformément lorsque (mathcal _<0>>1) . Les paramètres biologiques du modèle sont estimés à l'aide des cas confirmés d'infection tuberculeuse signalés à Khyber Pakhtunkhwa, au Pakistan, de 2002 à 2017. Sur la base des paramètres estimés et ajustés, nous avons obtenu que (mathcal _<0>environ 1,2928) . La stabilité du modèle est étudiée graphiquement lorsque (mathcal _<0>) est supérieur ou inférieur à un. En outre, l'analyse de sensibilité du paramètre de seuil est effectuée afin de formuler une stratégie optimale appropriée pour réduire l'infection tuberculeuse. De plus, nous développons le modèle de contrôle en utilisant trois variables de contrôle. L'existence du problème de contrôle optimal et les résultats mathématiques nécessaires pour les caractérisations de contrôle sont obtenus. Enfin, les simulations sont présentées pour souligner l'importance et l'impact des interventions de contrôle suggérées sur la dynamique de la maladie. L'ensemble de contrôles proposé peut être utilisé pour l'élimination de l'infection tuberculeuse dans une communauté.


En 1951, lors d'une étonnante coïncidence, trois sociétés pharmaceutiques Bayer Chemical en Allemagne et Squibb et Hoffmann-LaRoche aux États-Unis ont presque simultanément découvert ce qui allait être le prochain médicament majeur pour le traitement de la tuberculose, l'hydrazide isonicotinique, qui sera bientôt rebaptisé isoniazide. Il était dix fois plus puissant que n'importe quel médicament précédemment testé et il semblait être non toxique. De plus, il avait été décrit dans un rapport publié par des chimistes de nombreuses années auparavant. Cela signifiait que l'isoniazide ne pouvait pas être breveté. Donc n'importe qui pouvait le fabriquer et le vendre, et ce n'était ni difficile ni coûteux à produire. 12 Daniel, Thomas M, « Captain of Death : The Story of Tuberculosis », University of Rochester Press, 1997

Au moment où l'isoniazide est devenu disponible, l'attention s'était tournée vers la manière dont les médicaments devaient être utilisés en association afin d'éviter le développement d'une résistance. La trithérapie à base d'isoniazide, de streptomycine et de PAS est devenue la trithérapie standard pendant les 15 années suivantes jusqu'à la disponibilité de la rifampicine dans les années 1960. 13 'Fox, W « Etudes sur le traitement de la tuberculose entreprises par les unités de tuberculose du British Medical Research Council, 1946-1986, avec les publications ultérieures pertinentes », Int J Tuberc Lung Dis 19993 (Suppl 2) : S231-S279 www.ingentaconnect. com


Ce que les parents ne savent pas : une étude sur les jeunes trans révèle une faille fatale au cœur du pseudo-diagnostic de la « dysphorie de genre à apparition rapide » (ROGD) (1 sur 3)

La dysphorie de genre à apparition rapide (ROGD) est un nouveau phénomène social présumé de dysphorie de genre inauthentique apparaissant soudainement chez les adolescents cisgenres en nombre croissant et dans des groupes sociaux, contrairement à d'autres formes actuellement connues de dysphorie de genre déjà observées chez les personnes trans. Ce syndrome revendiqué a été nommé pour la première fois par le Dr Lisa Littman de l'Université Brown dans un résumé (Littman, 2017) et une étude ultérieure (Littman, 2018) basée sur un échantillon de lecteurs de trois communautés anti-trans de premier plan qui ont présenté des allégations tout au long de 2016 d'une tendance croissante de « d'apparition soudaine » de cette fausse dysphorie de genre chez les adolescents cis.

La condition proposée de ROGD suggère donc que, comme les adolescents transsexuels apparents peuvent en fait être mal diagnostiqués comme des jeunes cis, le traitement efficace d'affirmation du genre donné comme norme de soins pour les jeunes trans serait inapproprié ou nocif pour ce groupe de jeunes, et donc ce genre -le traitement affirmatif devrait leur être refusé.

À la suite de l'étude de Littman en 2018, cette condition revendiquée a été largement promue dans le discours public par des groupes de défense des droits des personnes trans, des groupes juridiques de droite, des législateurs conservateurs, des commentateurs du « web sombre intellectuel » et de tous les horizons dont la politique inclut l'invalidation de les jeunes trans. Le spectre de cette contagion de l'erreur de genre qui sévit chez les jeunes a récemment fait l'objet d'inquiétudes parmi les législateurs républicains, comme toujours sous le signe de la « protection des enfants », œuvrant pour interdire l'accès à la transition médicale aux adolescents trans – et dans au moins un état succédant.

L'étude de Littman a un défaut fondamental dans sa méthodologie qui sape largement ses conclusions rapportées. Selon Littman, une caractéristique clé qui distingue le ROGD de la dysphorie de genre classique est que le ROGD apparaît très rapidement chez un enfant qui était jusque-là apparemment cisgenre sans aucun signe d'incongruité de genre. Les observations de cette rapidité consistaient entièrement en des rapports de parents anonymes sur leur propre perception de l'identité de genre et du développement de leur enfant, exprimant presque universellement leur surprise devant la nature soudaine de la déclaration d'identité transgenre de leur enfant. Les jeunes eux-mêmes n'ont pas été interrogés sur leurs propres expériences d'incongruité de genre tout au long de leur enfance, combien de temps ils ont vécu l'incongruité de genre ou se considéraient comme transgenres, ou combien de temps ils avaient attendu pour rendre leur identité trans visible à ces parents pour la première fois.

Ces observations parentales de seconde main sont la seule preuve offerte par Littman de la nature «rapide» distincte de la progression du ROGD, contrairement à la dysphorie de genre classique, dont nous pouvons déduire que Littman considère avoir un développement et une considération plus complexes ou prolongés. Il y a un problème : dans ce domaine, les rapports des parents sur le développement du genre de leur enfant ne sont pas suffisants pour prouver que leur enfant a réellement connu un « début rapide ». Une abondante littérature existante depuis des décennies a déjà montré que de nombreux parents sont surpris de voir un enfant trans sortir en même temps, leur enfant a beaucoup réfléchi à son genre et à son identité pendant de nombreuses années auparavant. L'inverse de la surprise des parents est la constatation constante, lorsque les jeunes et les adultes trans sont interrogés, que plusieurs années peuvent s'écouler alors que nous contemplons notre genre dans notre enfance et prenons notre temps avant de décider quand nous sortons en tant que trans.

Ces deux séries d'observations se produisent parce que les personnes trans ont accès à nos propres expériences internes et perceptions du genre alors que nos parents ne peuvent accéder qu'à ce que nous exprimons volontairement à l'extérieur. L'erreur de Littman dans la formulation du ROGD est de traiter ce dernier comme s'il définissait le premier, le développement réel du genre d'un enfant étant réduit à la propre perception d'un parent., on se réduisait forcément à la première fois que nous choisissions d'être visibles. Traiter les observations parentales comme synonymes de processus réels de développement du genre de l'enfant n'est pas étayé et contredit par presque toutes les autres études publiées dans ce domaine.

Une étude notable a récemment obtenu les informations qui manquaient manifestement à l'étude de Littman, en interrogeant à la fois les jeunes trans et leurs parents ou tuteurs sur leurs rapports sur leurs propres jalons d'auto-reconnaissance et de divulgation de genre par rapport à la perception de leurs tuteurs quant au moment et au rythme de leurs jalons de développement de genre. L'écart entre les perceptions des parents et le développement identitaire des jeunes trans a été quantifié et il s'agit d'une différence significative.

Erreur méthodologique du ROGD : utiliser les perceptions des parents pour équivoquer la reconnaissance de soi et la divulgation des jeunes trans

En juillet 2017, j'avais déjà souligné l'insuffisance de la confiance de Littman dans les rapports des parents comme indicateur du développement de l'identité de genre des jeunes, et en février 2018, j'expliquais pourquoi cette méthodologie risquait de produire des résultats très biaisés :

Il s'agit d'une lacune cruciale : ces enfants n'ont reçu aucun instrument d'enquête validé sur la dysphorie de genre, la santé mentale, le fonctionnement social, ou quoi que ce soit qui servirait à distinguer cette « nouvelle » condition de la forme traditionnelle de dysphorie de genre actuellement observée chez les jeunes. Les rapports des parents faisant état d'une apparition « rapide » de la dysphorie sont particulièrement discutables : de nombreux jeunes trans cachent naturellement leur identité pendant des années, sachant que les conséquences d'un dévoilement à des parents potentiellement réticents pourraient être désastreuses. Ce qui semble à un parent être un début « rapide » peut ne pas avoir été du tout rapide pour son enfant, et il est courant dans les forums de soutien trans d'entendre des jeunes (et des adultes) dont les parents protestent qu'ils « n'ont jamais montré de signes » .

Le Dr Joshua Safer de l’Endocrine Society et du Mount Sinai’s Center for Transgender Medicine a également expliqué que l’étude de Littman sur ce qu’elle appelle ROGD ne consiste en réalité qu’en une enquête sur les perceptions et les attitudes des parents :

Je ne sais pas s'il existe une chose telle que ROGD - une phrase qui s'applique au parent peut être légitime, mais le terme ROGD est un dépassement complet et il est injuste pour le domaine. Nous devons limiter cela à ce que les données nous montrent uniquement. . . . Littman a en fait écrit un article sur l'anxiété des parents qui remettent en question une approche ouverte de la prise en charge des transgenres et des sites fréquents qui jettent le doute sur les approches de gestion actuelles. Aucun enfant n'était impliqué.

Même le DSM-5 (American Psychiatric Association, 2013) note dans sa description de la dysphorie de genre que La surprise des parents face aux adolescents trans est courante :

La dysphorie de genre tardive survient autour de la puberté ou beaucoup plus tard dans la vie. Certaines de ces personnes déclarent avoir eu un désir d'être de l'autre sexe dans l'enfance qui n'a pas été exprimé verbalement aux autres. D'autres ne se souviennent d'aucun signe de dysphorie de genre chez l'enfant. Pour les adolescents de sexe masculin atteints de dysphorie de genre tardive, les parents rapportent souvent une surprise parce qu'ils n'ont pas vu de signes de dysphorie de genre pendant l'enfance. . . . Parents of natal adolescent females with the late-onset form also report surprise, as no signs of childhood gender dysphoria were evident.

Meanwhile, Littman’s study plays fast and loose with the very meaning of “rapid”, describing anything from one day to one year and effectively using the label of “rapid” merely to function as an invalidation (Pitts-Taylor, 2020):

Is a half-year wait for an appointment with a specialist far too quick? Or is it far too slow? The answer may hinge on whether the parent welcomes any gender affirmative treatment at all, or believes it is warranted in the first place. . . . These different durations are all deemed pathological, although the normative or “healthy” timeframe against which they are measured is not explicitly delineated. The study does not provide a stable referent for what constitutes pathological untimeliness. Rather, it treats a set of variegated durations as homogenously “rapid,” while applying the term to multiple objects, from subjects’ gender identifications to clinicians’ responses. Understood in semiotic terms, “rapid” is a floating signifier – it has a “semantic function whose role is to allow symbolic thought to operate despite the contradiction inherent in it” (Levi-Strauss, cited in Mehlman, 1972). The logic of ROGD uses (varied) patterns in the timing of (multiple) events to propose a singular etiological difference, social contagion, and to hypothesize the anomalous development of gender nonconforming youth.

We see what parents’ reports can tell us about their perception of their children’s gender identity development – and it really is only about their secondhand perceptions.

We can also choose to look at what Littman did not: the body of literature on the developmental course of transgender identity, gender dysphoria, and other gender-variant experiences among trans youth. As it turns out, trans people’s self-reports consistently and significantly differ from their parents in the description of their life course and gender development milestones. In several studies across decades, trans youth describe lengthy developmental timelines including landmarks of the first self-awareness of one’s gender variance, first identifying as transgender privately, first disclosing to someone else, first living as one’s gender part-time or full-time, and first pursuing medical transition. These events span years, not weeks.

Littman largely failed to engage with this literature:

    found among 55 trans people aged 15-21, trans girls felt “different from others” at a mean of 7.6 years old, considered themselves transgender at 13.4 years, and first came out to anyone else at 14.2 years. Trans boys on average felt different at 7.5 years, identified as trans at 15.2, and first told someone at 17. For trans youth and young adults, this was a course of awareness and identity development lasting several years. found in 298 trans women aged 16-29, their average age of “initial self-awareness of transfeminine identity” was 9.9 years old, followed by “transfeminine expression in private” at an average of 12.9 years. They also first disclosed their trans identity to someone else at 15.8, presented as feminine in public at 17.4, and began taking feminizing hormone therapy at an average of 20.4 years old. De nouveau, this process of identity development was not brief or passing, but lasted for a majority of their childhood. found that in 224 trans youth aged 6-17, trans girls first self-identified as their gender at an average of 9.9 years old and first disclosed to their immediate family at 12.2 years. Trans boys similarly self-identified at 10.7 years old and disclosed to family at an age of 13.1 on average. studied 415 Millennial trans people (born 1981-1996) and 196 Generation Z trans people (born 1997-2012). Millennials reported their gender first felt “different” at a mean age of 11.6 years, recognized themselves as having a transgender identity at 19, started living part-time as their gender at 20.8, lived full-time at 22.2, and accessed their first medical transition treatment at an average of 23.1 years old. Gen Z likewise experienced years of developmental milestones: feeling different at 11.5, identifying as trans at 15.2, living part-time at 16.1, full-time at 17 and medically transitioning at 17.6 years old on average.

Littman’s report of parental perceptions does not actually make any predictions as a hypothesis about a new and distinct syndrome, and it does not succeed in usefully paring down the space of possible observations of reality. These parental reports are fully compatible with a state of the world where trans youth’s gender dysphoria is not “rapid” in its onset at all.

The claims of ROGD are in danger of being unfalsifiable: Because trans youth consistently show this pattern of development and yet Littman’s methodology would never detect that pattern in favor of only reporting their parents’ subjective surprise, the supposed condition of ROGD can toujours serve as a possible reason to cast doubt on the authenticity of any trans person’s identity or experience of gender dysphoria. The youth who are clearly trans-identified and have been for many years could still be incorrectly classified as “rapid onset” by looking only at parental perspectives.

Based only on parental reports, are their children experiencing an inauthentic “rapid onset” gender dysphoria, or are they genuinely experiencing classic gender dysphoria as a trans person? How could you possibly tell the difference when working only from this limited evidence and misleading methodology?

This is a recipe for false negatives – a person with a trait is incorrectly identified as not having that trait. Wrongly declaring gender-dysphoric trans youth to be mistaken, non-dysphoric cis youth can then mean depriving them of the necessary affirming treatment for them to thrive in their authentic gender.

Parent reports of youth gender milestones are clearly not sufficiently accurate. And when we include both the parents’ perspectives and the reports of their trans youth on their gender identity development, that complete picture shows why this partial picture is so inaccurate. In June 2020 I made the following prediction about Littman’s study and the likely results of more comprehensive parent-child surveys:

Her results are nothing new, surprising, or inconsistent with previous findings if she were to survey the trans children of her cis parent respondents, there is every reason to expect they would report the same lengthy trajectory of private identity development with discrete milestones occurring over many years.


Part 2: The Troublesome Tubercle in Tuberculosis

00:00:07.21 My name is Lalita Ramakrishnan.
00:00:09.16 I'm a professor of Immunology and Infectious diseases at the University of Cambridge.
00:00:14.08 And, in this lecture, I'm going to continue to tell you a little bit more about tuberculosis,
00:00:20.16 focusing on a structure called the tubercle.
00:00:24.13 Now, just to recapitulate the lifestyle or the life cycle of Mycobacterium tuberculosis,
00:00:33.02 which is the causative agent of tuberculosis, the bacterium that causes it, the bacteria
00:00:39.01 are exhaled by. in coughs by people who are infected, get inhaled by individuals near
00:00:48.22 them, and then they enter cells that are called macrophages.
00:00:52.18 But what happens next is that they. they induce these macrophages to form structures
00:01:01.16 called granulomas, and these granulomas can become quite elaborate.
00:01:09.14 At first, they're comprised just of macrophages, but then many other immune cells come in and
00:01:15.13 they can form of a fairly complex structure.
00:01:19.21 And another thing to note is that the macrophages within this granuloma undergo a specialized
00:01:27.15 differentiation called epithelioid transformation, where they form these finger-like, interdigitated
00:01:34.03 projections between each other to form a very compact, organized structure.
00:01:42.23 Now, this structure. pathologists call these structures granulomas, and granulomas were.
00:01:51.22 are. are associated with many, many, many diseases, both infectious and non-infectious.
00:01:59.19 And they can often be quite pathological.
00:02:02.03 But granulomas. but. but the single biggest cause of granulomas is tuberculosis.
00:02:09.13 And, in fact, granulomas were first discovered in the context of tuberculosis in 1679, some
00:02:18.13 200 years before the bacterium Mycobacterium tuberculosis was. was discovered.
00:02:25.09 And, in fact, the microbe. les. the structure used to be called a tubercle, and obviously
00:02:31.23 that. both the bacterium and the disease are named for the granuloma.
00:02:35.16 So. but it turns out that granulomas are very primitive structures they've probably
00:02:43.03 evolved. là. they're present even in lower vertebrates in a. in a more primitive
00:02:47.11 form, and they probably evolved to wall off foreign bodies -- you could imagine a thorn
00:02:54.02 being. being circumscribed by that. by such a structure until it's.
00:02:59.03 it's sort of dissolved.
00:03:01.00 But these so-called foreign body. body granulomas have a very low turnover of macrophages the
00:03:07.14 macrophages just come and sit there and it's not a particularly inflammatory structure,
00:03:11.14 or so it's thought.
00:03:13.19 In contrast, the types of granulomas that form with tuberculosis, and pretty much any
00:03:18.02 medically significant granuloma, tend to be high turnover granulomas where there's a rapid
00:03:25.10 death of macrophages and a repopulation by new ones,
00:03:28.22 and they can be very inflammatory structures.
00:03:31.22 There are many traditional animal models that are used to study TB.
00:03:36.11 The oldest ones are the ones. the rabbit and the guinea pig, which were used by
00:03:42.19 Villemin and Koch, respectively, at the time that they discovered TB.
00:03:48.11 They used these animals to. to pass the bacterium from one animal to another to show
00:03:54.19 that it was associated with. with TB.
00:03:58.18 The most commonly used model now is the. is the mouse.
00:04:01.21 And this makes a lot of sense because mice have a wonderful array of
00:04:08.03 immunological and genetic tools.
00:04:10.06 One issue is that mice don't. that most mice. mouse strains don't develop the.
00:04:18.07 the nice, tight granulomas that are associated with human disease, but there are some recently
00:04:25.06 identified mouse strains that do, and so those could actually be quite good.
00:04:33.07 Another more recently used model is the non-human primate, and this is a good model because
00:04:40.04 it really recapitulates human disease.
00:04:43.03 But the problem is, of course, they're expensive, there are ethical considerations, and obviously
00:04:48.06 cannot be used widely.
00:04:50.19 So, in. on this backdrop, my story and my engagement with TB and the granuloma came
00:05:00.24 when, as a postdoctoral fellow at UCSF -- I was a clinical infectious disease fellow and
00:05:07.08 had to do a postdoctoral fellowship -- I approached Stanley Falkow at Stanford to. to go to
00:05:14.07 his lab and study TB, which he didn't study at the time,
00:05:17.14 but he studied many other bacterial pathogens.
00:05:20.22 And Stanley said to me, forget it, I don't have the specialized containment facilities
00:05:27.00 you need to study TB, which is a human aerosol pathogen and, besides, he said, TB grows so
00:05:33.05 slowly I'll be dead before you get your first result.
00:05:36.18 And that was in 1991, and I'm happy to say he's still alive, and. and.
00:05:42.17 and quite well.
00:05:45.13 And. donc. what he told me. he gave me an insight and he said, look, there are other
00:05:53.19 strains of mycobacteria, there are other species of mycobacteria that are pathogenic in other
00:05:59.01 animals, that are natural pathogens of other animals.
00:06:02.20 And he said, I.
00:06:03.20 I'm pretty sure there are these ones of. of marine life of fish, because I've seen
00:06:09.19 people get them who were fishermen.
00:06:13.19 He had worked at Brown and knew that Portuguese fishermen got these. this disease. mycobacterial
00:06:20.15 disease on their digits and on their soft tissues.
00:06:24.22 And so I went off to the UCSF library and looked at this very classic manual.
00:06:31.13 It's called Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, and I. and I found what he was talking about.
00:06:37.16 He was talking about. he was probably talking about a bacterium called Mycobacterium marinum
00:06:43.13 that was thought to be a close relative of human TB, of the human TB bacterium, and it
00:06:50.01 gave fish TB.
00:06:52.24 It turns out that it also infects humans, and this has been known since the 50s, and
00:07:00.02 I can personally attest to it.
00:07:02.18 And it gives humans disease on their extremities, as Stanley already knew, and. and many clinicians,
00:07:08.23 particularly dermatologists and infectious disease clinicians, already know this.
00:07:13.12 But if you look inside that lesion, you'll see a classic granuloma and actually in many
00:07:18.20 cases it can be indistinguishable from the granulomas caused by the human TB bacterium.
00:07:27.03 But, of course, we know that this bacterium also infects fish, and it was first identified
00:07:34.03 to do so in the Philadelphia Aquarium, where in 1926 fish were dying of some mysterious
00:07:42.20 wasting disease, very similar to human TB.
00:07:46.12 And when they tried to culture these fish to see what bacterium they had, why were they
00:07:52.23 dying?, they couldn't culture anything, but when they looked at the fish by histology
00:07:57.24 they could see these classic red snapper bacteria that looked very much like TB.
00:08:04.05 And then Aronson had the bright idea to culture the. to try to do the cultures at a low
00:08:09.21 temperature that was commensurate with. with the low body temperature of the fish,
00:08:14.02 and then he was able to cultivate, he was able to culture Mycobacterium marinum.
00:08:19.08 And, since then, we've had Mycobacterium marinum sequenced at the Sanger Center, and it turns
00:08:26.22 out to be the closest genetic relative of the human TB bacterium, so I guess we also
00:08:32.16 got quite lucky.
00:08:34.00 And it turns out that Mycobacterium marinum also infects zebrafish.
00:08:39.14 Zebrafish are a pet develop. a pet organism of developmental biologists and are a natural
00:08:46.09 host to Mycobacterium marinum.
00:08:48.20 So, I've got for you, here, down below in. in the bottom panel, the. a human TB granuloma
00:08:56.14 stained by hematoxylin and eosin, which will only stain the host cells but not the bacteria,
00:09:01.20 and what you can see is that you've got a nice organized structure, which is cellular,
00:09:07.23 as evidenced by blue nuclei on the edges, but in the center where that arrowhead is,
00:09:14.12 you'll see that the structures become acellular, because it's undergone necrosis, just as we
00:09:21.20 know that human TB granulomas do.
00:09:24.03 But here's, now. let's take a look, now, at the. at a zebrafish granuloma, and in
00:09:30.03 this granuloma you can see. which. which I've stained, here, with a stain that also
00:09:36.22 stains the bacteria, you can see that it looks very similar and it's a nice cellular organized
00:09:43.13 structure and you can see that there are a few bacteria within macrophages, but where
00:09:48.12 the macrophages have necrosed there are tons of bacteria,
00:09:51.12 which is exactly what you would expect.
00:09:55.11 But the great feature of the zebrafish that makes them so enticing to developmental biologists
00:10:01.11 is that they have a prolonged larval phase when they're transparent.
00:10:06.09 And so you can actually watch things happen and people watch developmental processes happen,
00:10:12.24 but. so we asked, well, can we put in bacteria and watch infection happen?
00:10:18.10 And so, they have a cavity that's called the hindbrain ventricle, which is the equivalent
00:10:22.24 of something in our brain, close to our brain called the fourth ventricle, and so we put
00:10:27.09 in some bacteria there -- I've shown it to you with an arrowhead, there -- and what we
00:10:32.03 saw very quickly was that macrophages came, and you'll see the macrophages sort of chasing
00:10:40.14 after the bacterium like a cat after a mouse, and eventually you'll see this mac. mac.
00:10:45.17 macrophage gets it.
00:10:47.12 And there you've got an infected macrophage.
00:10:51.20 You can now follow these infected macrophages out of the cavity -- this is a few days later
00:10:57.12 -- and you can see that it's just moseying along.
00:11:02.04 The bacteria have grown in the macrophage and -- because it's a permissive macrophage
00:11:08.19 for the. for the. for the bacterium -- and there it is.
00:11:13.20 But what was really exciting to us was that you could see, within a few days,
00:11:19.02 a granuloma form.
00:11:20.22 And here you can see that we've got a granuloma that's already formed and what you're going
00:11:25.08 to see, where that white. white arrow is, a new uninfected macrophage is going to come
00:11:32.00 and then it's going to enter the structure.
00:11:34.20 So, watch this.
00:11:37.13 See?
00:11:39.11 There it comes, and it's going to squeeze its way in between and get in there.
00:11:50.21 So, the granuloma is a highly chemotactic structure
00:11:54.21 that is recruiting new macrophages to come to it.
00:11:59.19 And then we could show all this by. by engineering fish that were transgenic, so that they had
00:12:07.06 green florescent macrophages and red fluorescent neutrophils, which is another cell type that
00:12:12.11 is somewhat involved in granulomas, but not as much as macrophages.
00:12:16.17 And what you can. and now we've infected the fish with blue fluorescent bacteria and
00:12:20.10 you can see that the. that we've got a nice tight bona fide epithelioid granuloma with
00:12:28.00 infected macrophages.
00:12:29.13 So, this was good.
00:12:31.10 As we were developing this model, my colleague and friend, David Sherman,
00:12:37.11 made a suggestion to us.
00:12:40.16 He. so, it's. people have been searching for virulence determinants in mycobacterium,
00:12:50.03 and one exciting discovery was that a specialized secretion system called the ESX-1 or RD1 locus,
00:12:58.18 which I've shown in white in that top panel, the white genes in the top panel,
00:13:03.24 were involved in virulence.
00:13:05.16 And this was very exciting because these. it turns out that this was the locus that
00:13:10.09 was missing in the attenuated vaccine strain, BCG, that was made by serial passage in.
00:13:17.14 in the 1920s, and now we finally knew the molecular basis of its attenuation.
00:13:24.19 So, Mycobacterium marinum, not surprisingly, has a locus that looks virtually identical.
00:13:31.19 And David kept telling me, look, make a mutation in this and let's see how it really works,
00:13:38.10 because everyone knows it's attenuated, but a lot of these animal models are black boxes
00:13:42.24 because you only get to see the end result, and he could see that we would be able to
00:13:47.01 get some insights about the actual sequence of what was got. what was different.
00:13:52.04 And, when I was a bit slow to do this, he actually had someone in his lab make the mutation.
00:13:59.04 the mutant for me, and he gave it to us and he said, take this.
00:14:02.02 So, at this point, we were sort of shamed into doing this quickly, and we was
00:14:07.03 Hannah Volkman, who had joined my lab at. as a graduate student, and Hannah showed very quickly
00:14:12.08 that, yes, if you put this mutant into zebrafish larva, it was attenuated.
00:14:17.16 The animals didn't die and if you looked at the bacterial counts you could see that the
00:14:23.03 bacteria didn't grow as well.
00:14:24.03 So, this was good because it showed us that it was behaving just like you would expect.
00:14:28.12 But, here came the surprise.
00:14:30.21 And, at this point. by this point, Hannah had recruited some of her colleagues -- Dana
00:14:36.12 Beery, on the left, who was a technician in the lab, and Hilary Clay, a graduate student
00:14:41.01 who was Hannah's very good friend -- and she got them to join in this. in this quest
00:14:46.01 to see what was going on.
00:14:48.15 And what they found was something quite interesting.
00:14:52.13 Because, if you look at the fish on top, they are infected with wild-type bacterium, and,
00:14:58.19 if you look at the close-up on the top right,
00:15:01.17 you can see that a nice big granuloma has formed.
00:15:04.22 But if you look at the mutant, what you can see is that, even if you inject many, many
00:15:09.22 more bacteria, just to compensate, so that you get more. as many bacteria as with the
00:15:16.10 wild-type, the macrophages pack up with the bacteria, as you see on that bottom-right
00:15:21.09 panel, but there's. they don't form granulomas.
00:15:25.13 Now, this seemed opposite of what you'd expect, because if. if granulomas are good for the
00:15:32.09 host, as what everyone in TB. in the field of TB thought. people have thought that
00:15:38.12 the granuloma is a critical host protective structure that walls off the bacteria and,
00:15:46.00 while it's not always successful in eradicating the bacteria, it sure as heck tries to do
00:15:51.14 so, and is. est. is pretty good at it.
00:15:54.12 Now, if that's the case, then we should see more granuloma formation with that mutant,
00:16:00.03 but we saw less.
00:16:02.05 So, Hannah took a close look at this and she was able to observe fish as the granuloma
00:16:08.24 formed by serial imaging, and what she showed was that, when the granuloma formed, the number
00:16:16.19 of infected macrophages went up dramatically, as did the number of bacteria.
00:16:21.19 So, the granuloma was actually promoting growth rather than restricting growth.
00:16:26.18 So, why might this be?
00:16:28.15 Because here we are saying that a. les. you know, this. this immunological structure
00:16:34.07 that really should be killing the bacteria is actually promoting growth.
00:16:40.24 And the answer to this came of. both from Hannah's work and from a new graduate student
00:16:49.20 who joined, an MD/PhD student, Muse Davis, and what we found was happening was that,
00:16:57.02 when there's an infected macrophage, when new macrophages come to it, for some reason,
00:17:04.13 if they have that ESX1 locus, the bacteria are spreading quickly from macrophage to macrophage.
00:17:12.16 You can see, within 48 hours, you've gone from one infected macrophage in that top-left
00:17:17.12 panel to many infected macrophages, whereas if you didn't have that locus, if the bacterium
00:17:23.24 didn't have that locus, then that one mac. macrophage just remains one great big macrophage.
00:17:29.09 And the bacteria are just growing in it, but obviously they're not doing as well as if
00:17:33.09 they can spread to new macrophages.
00:17:37.20 And so it turned out that the bacterium is
00:17:40.07 using this locus to spread from one macrophage to another.
00:17:44.16 Now, how does this happen?
00:17:46.13 What. what Muse found was that, if the initial macrophage was infected with bacteria that
00:17:54.03 contained this locus, then somehow that macrophage was able to exert a rapidly chemotactic effect
00:18:03.18 on. on macrophages around it, or. or even far away, so that they came.
00:18:10.18 And you can see that the macrophages in the top panel have these protrusions that reflect
00:18:16.15 that they're highly chemotactic and are responding to a chemotactic gradient, and our racing
00:18:22.13 into this structure.
00:18:24.07 In contrast, if that initial macrophage didn't have this locus, then the incoming macrophages
00:18:31.03 are coming in very, very slowly, and they clearly are not experiencing a chemotactic
00:18:36.15 gradient they don't have that big. great big protrusion.
00:18:40.18 And, even once they get into the granuloma, they behave very differently.
00:18:45.06 The wild-type macrophages move far and wide within the granuloma, and rapidly, whereas
00:18:50.13 the mutant macrophages, the few that do come, are just sort of sitting there
00:18:54.23 like bumps on a log.
00:18:58.20 And this is the kind of movie that gave us that insight that I just talked to you about,
00:19:04.10 that macrophages are used. exploited by the bacteria to spread from cell to cell.
00:19:11.01 So, what happens is that, when a given infected macrophage packs up with. packs up with
00:19:17.08 bacteria, because the bacteria can grow within it, it undergoes an apoptotic death, where
00:19:24.10 it's dead but it's preserved its membranes.
00:19:27.19 And now what happens is this dead cell is recognized by the incoming macrophages, that
00:19:34.22 come and eat it.
00:19:36.05 And I'm going to show you an example, here, of where one. one dead macrophage with the
00:19:42.07 white arrow is going to be engulfed by an incoming macrophage.
00:19:46.19 So, watch this happen.
00:19:48.02 It's. ce. you're going to watch it, it's going to come from below, it's kind of like
00:19:52.04 that movie Jaws, where the. you know, the shark comes from below.
00:19:56.06 And, look at it, it's eating it bite by bite.
00:19:59.22 And this is why macrophages might be called what they are -- macrophage for "big eater".
00:20:05.12 And now you've got. this macrophage has been eaten by a new macrophage.
00:20:12.12 But you're going to say, wait a minute, why would this spread the infection?
00:20:15.18 You've gone from one macrophage to another macrophage, so all you've done is conserved
00:20:19.12 the bacteria.
00:20:21.04 But it turns out, when Muse looked closely, that, on average, a given macrophage, given
00:20:26.14 infected, dead macrophage, was eaten, on average, by 2.3 macrophages every 24 hours.
00:20:34.03 And so you can imagine. you can see how the bug is using the macrophage to expand
00:20:39.24 its numbers.
00:20:42.06 And not only that, but we showed that the bacterium also induces the death of the macrophages.
00:20:47.21 Here's a TUNEL stain on the left and this. this death. there are probably many bacterial
00:20:53.03 determinants that do this, but one of them is that self. same locus, ESX1, that also
00:20:58.11 induces the macrophages to come.
00:21:00.06 So, it's got a two-pronged effect.
00:21:02.05 It's inducing death of the infected macrophage and, separately, it's recruiting new macrophages
00:21:07.18 to come to it so that they can engulf the dead macrophage, and. and produce infection.
00:21:15.22 So, to summarize this, let's take a look at what happens in the mutant first.
00:21:23.19 Because, in the mutant, the granuloma might actually be functioning as a host-protective
00:21:29.14 structure, as it might be meant to be.
00:21:34.06 It's you've. you've got an infected macrophage, it dies at a slow rate, macro. new macrophages
00:21:42.23 are slowly recruited at a. at a respectable pace.
00:21:46.10 And, now, they can eat the new macrophage one by one on one, and there's some time for
00:21:53.07 the cells to also kill the dying cell, to also kill the bacteria before they're eaten,
00:21:59.10 so you could imagine there's an attrition of bacterial infection.
00:22:02.19 This might be why the BCG vaccine strain is attenuated.
00:22:06.11 But, paradoxically, instead of sort of thwarting these host-protective processes, as you might
00:22:14.19 imagine a pathogenic bacterium might do, the. the pathogen actually accelerates these processes,
00:22:21.05 so it converts them from being a host-protective to a host-detrimental process.
00:22:26.04 So, simply by speeding up the rate of cell death, and speeding up the recruitment of
00:22:30.19 new macrophages, it's. it's just using the macrophage niche to spread in from cell to
00:22:37.12 cell, and therefore expand itself in the granuloma.
00:22:40.20 And this is quite a nifty thing to do, I think.
00:22:45.04 So. okay.
00:22:46.13 But the question now is, how do. how do. how does this ESX1 locus induce the recruitment
00:22:53.04 of new macrophages?
00:22:54.21 And so, for this part, Hannah was joined by Tamara Pozos, who was a pediatric infectious
00:23:00.13 diseases fellow who joined the lab, and together they did a microarray where they looked at
00:23:05.10 fish that were infected with wild-type or mutant bacteria to identify host genes that
00:23:11.03 might be different between the two.
00:23:13.00 And the gene that stuck out was matrix metalloproteinase 9.
00:23:17.18 And this is an extracellular. an. an enzyme of that. that models.
00:23:23.06 remodels the extracellular matrix.
00:23:25.22 And they were even able to show, not only by transcriptional analyses but also by doing
00:23:31.06 a gelatinase assay on the fish for the actual activity of this enzyme, that MMP9 was induced
00:23:39.20 upon wild-type infection but not upon mutant infection.
00:23:44.16 Now, that's fine.
00:23:47.03 But if MMP9 is. induction of MMP9 is responsible for the ESX-mediated acceleration of macrophage
00:23:57.13 recruitment, then, if you make a MMP9 mutant, that mutant should be attenuated even with
00:24:03.05 wild-type infection.
00:24:04.08 And, sure enough, when they looked they saw that the MMP9 mutant, which is shown on the
00:24:09.17 bottom, there, that fish, was attenuated for infection, and it had very few granulomas.
00:24:17.15 So, it was behaving just like the bacterial mutant and therefore it was the partner.
00:24:24.09 So, so this was nice and then. but then we started to look into what MMP9 does and
00:24:30.03 then it turns out that MMP9 is involved in the pathogenesis of arthritis, and cancers,
00:24:37.14 and other inflammatory conditions, and often in those cases the mac. it's the mac.
00:24:43.07 it's a macrophage that is the bad actor, that is making MMP9 and. and causing trouble
00:24:49.06 in these lesions.
00:24:50.06 So, of course, we thought, well, okay a macrophage gets infected with the bacteria it now induces
00:24:56.17 MMP9 in the macrophage, and now that. that is secreted and calls in new macrophages.
00:25:03.11 But when we did in situ analyses there. to look at where the MMP9 was being made,
00:25:10.13 here is a granuloma, and the MMP9 is labeled green and the macrophage. macrophages are
00:25:17.14 labeled red, and what you can see is that the MMP9 is not in the. in the macrophages
00:25:22.15 of the granuloma.
00:25:23.17 But, rather, it's in the epithelial cells surrounding the granuloma.
00:25:29.13 And so what. what seems to be happening is that an infected macrophage secretes something
00:25:37.18 from that secretion system that goes and talks to the epithelial cell
00:25:43.02 and induces it to make MMP9.
00:25:45.14 And the MMP9 now calls in new macrophages, and this. cette. this strategy was called
00:25:52.09 "subversion from the sidelines" by my friend and colleague, Bill Bishai at Hopkins, and
00:25:57.20 I rather like how he put it.
00:26:00.11 So, why might that be?
00:26:03.05 You could imagine that the bacterium wants to tamp down immunity in the infect. dans
00:26:10.05 the actual. in the macrophage itself, because it has to survive in there.
00:26:13.21 So, it's doing that and, meanwhile, it's inducing an inflammatory program in a neighboring cell,
00:26:19.24 so that it can bring more macrophages, infect, and then subvert them.
00:26:25.03 Okay.
00:26:26.04 So, but. but. so this is so. so this is how the bacterium uses the innate immune
00:26:33.23 phase of the granuloma to promote its. its growth and expansion.
00:26:40.14 Of course, then the bac. the granuloma matures and other things happen and, as I told you,
00:26:47.01 one of the things that happens is epithelioid transformation, these tight interdigitated
00:26:52.09 projections, that too has been known for, oh, a hundred years or so, and that very reasonably
00:27:00.01 was thought to be a host-protective mechanism that would sort of wall off the bacteria and.
00:27:09.08 and perhaps be. somehow help the host, despite all these strategies of the bacterium.
00:27:14.06 Well, very recently, work from David Tobin's lab, also done in the zebrafish, that this
00:27:20.11 too turns out not to be the case.
00:27:24.10 Mark Cronin and David Tobin have shown that epithelioid transformation of the macrophage
00:27:31.09 is also something that the bacterium is benefiting from.
00:27:34.16 If they inhibit it, then they can. they get less infection than if it's there.
00:27:43.00 And, of course, they're working out the details of how this might be, but what it's telling
00:27:47.02 you is that practically every step that we might predict will help the host can be taken
00:27:52.21 advantage of by the bacterium.
00:27:56.04 So, in my first lecture, I told you that most people actually clear infection and they do
00:28:02.11 so after the adaptive phase of the. of the granuloma has kicked in.
00:28:06.22 So, it's very clear that. that at some point the granuloma can fight back and can. pouvez
00:28:14.21 eradicate or at least suppress infection.
00:28:17.14 And many, many people who specialize in the areas of adaptive immunity and TB are. sommes
00:28:24.17 working on this.
00:28:26.14 But I want to close by saying that, while the adaptive immunologists may not know as
00:28:32.11 much about this as they want to, and they're working hard to figure it out, the bacterium
00:28:37.01 seems to know quite a little. quite a bit about this. these immune mechanisms, because
00:28:42.11 what these people so. who worked on it so far can tell you is that it tries really hard
00:28:48.08 to delay and inhibit adaptive immunity, so that the adaptive immune elements that come
00:28:54.18 into the granuloma do so late.
00:28:58.10 And this gives time for the mechanisms that I've just been telling you about to help bacteria
00:29:04.20 expand in the innate context.
00:29:07.20 I'll close by thanking the many people whose research I've described to you -- they're
00:29:14.04 both students and from my lab, as well as colleagues and collaborators from outside
00:29:19.19 my lab, and, indeed, from across the world.
00:29:23.08 Thank you.


Advances in diagnosis of Tuberculosis: an update into molecular diagnosis of Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis (TB) is a major cause of deaths by a single infectious agent and has now been a global public health problem due to increasing numbers of drug-resistant cases. Early and effective treatment is crucial to prevent the emergence of drug-resistance strains. This demands the availability of fast and reliable point-of-care (POC) diagnostic methods for effective case management. Commonly used methods to screen and diagnose TB are clinical, immunological, microscopy, radiography, and bacterial culture. In addition, recent advances in molecular diagnostic methods including MTBDRplus, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), line probe assay (LPA), GeneXpert, and whole genome sequencing (WGS) have been employed to diagnose and characterize TB. These methods can simultaneously identify Mycobacterium tuberculosis (MTB) and mutation(s) associated with routinely used anti-TB drugs. Here, we review the use of currently available diagnostic methods and strategies including conventional to recently implemented next-generation sequencing (NGS) methods used to detect MTB in clinical perspective.