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9.2B : Méthodes de signalisation intracellulaire - Biologie


L'induction de la voie de signalisation active une séquence de modifications enzymatiques qui sont à leur tour reconnues par le composant suivant en aval.

Objectifs d'apprentissage

  • Expliquer comment la liaison d'un ligand initie la transduction du signal dans une cellule

Points clés

  • La phosphorylation, l'ajout d'un groupe phosphate à une molécule telle qu'une protéine, est l'une des modifications chimiques les plus courantes qui se produisent dans les voies de signalisation.
  • L'activation de seconds messagers, de petites molécules qui propagent un signal, est un événement courant après l'induction d'une voie de signalisation.
  • L'ion calcium, l'AMP cyclique et les phospholipides d'inositol sont des exemples de seconds messagers largement utilisés.

Mots clés

  • deuxième messager: toute substance utilisée pour transmettre un signal à l'intérieur d'une cellule, en particulier celle qui déclenche une cascade d'événements en activant des composants cellulaires
  • phosphorylation: l'addition d'un groupe phosphate à un composé ; souvent catalysé par des enzymes

L'induction d'une voie de signalisation dépend de la modification d'un composant cellulaire par une enzyme. Il existe de nombreuses modifications enzymatiques qui peuvent se produire et qui sont à leur tour reconnues par le composant suivant en aval.

L'une des modifications chimiques les plus courantes qui se produisent dans les voies de signalisation est l'ajout d'un groupe phosphate (PO4–3) à une molécule telle qu'une protéine dans un processus appelé phosphorylation. Le phosphate peut être ajouté à un nucléotide tel que GMP pour former GDP ou GTP. Les phosphates sont également souvent ajoutés aux résidus sérine, thréonine et tyrosine des protéines où ils remplacent le groupe hydroxyle de l'acide aminé. Le transfert du phosphate est catalysé par une enzyme appelée kinase. Diverses kinases portent le nom du substrat qu'elles phosphorylent. La phosphorylation des résidus sérine et thréonine active souvent les enzymes. La phosphorylation des résidus tyrosine peut affecter l'activité d'une enzyme ou créer un site de liaison qui interagit avec les composants en aval de la cascade de signalisation. La phosphorylation peut activer ou inactiver des enzymes ; l'inversion de la phosphorylation, la déphosphorylation par une phosphatase, inversera l'effet.

L'activation de seconds messagers est également un événement courant après l'induction d'une voie de signalisation. Ce sont de petites molécules qui propagent un signal après qu'il a été initié par la liaison de la molécule de signalisation au récepteur. Ces molécules aident à diffuser un signal à travers le cytoplasme en modifiant le comportement de certaines protéines cellulaires.

L'ion calcium est un second messager largement utilisé. La concentration libre d'ions calcium (Ca2+) dans une cellule est très faible car les pompes à ions dans la membrane plasmique utilisent en continu l'adénosine-5′-triphosphate ( ATP ) pour l'éliminer. À des fins de signalisation, Ca2+ est stocké dans des vésicules cytoplasmiques, telles que le réticulum endoplasmique, ou accessible depuis l'extérieur de la cellule. Lorsque la signalisation se produit, les canaux ioniques calciques ligand-dépendants permettent les niveaux plus élevés de Ca2+ qui sont présents à l'extérieur de la cellule (ou dans des compartiments de stockage intracellulaire) pour s'écouler dans le cytoplasme, ce qui augmente la concentration de Ca cytoplasmique2+. La réponse à l'augmentation de Ca2+ varie en fonction du type de cellule impliqué. Par exemple, dans les cellules du pancréas, Ca2+ la signalisation conduit à la libération d'insuline, alors que dans les cellules musculaires, une augmentation de Ca2+ entraîne des contractions musculaires.

Un autre second messager utilisé dans de nombreux types cellulaires différents est l'AMP cyclique (AMPc). L'AMP cyclique est synthétisé par l'enzyme adénylyl cyclase à partir de l'ATP. Le rôle principal de l'AMPc dans les cellules est de se lier à et d'activer une enzyme appelée kinase dépendante de l'AMPc (A-kinase). L'A-kinase régule de nombreuses voies métaboliques vitales. Il phosphoryle les résidus sérine et thréonine de ses protéines cibles, les activant dans le processus. L'A-kinase se trouve dans de nombreux types de cellules différents; les protéines cibles dans chaque type de cellule sont différentes. Les différences donnent lieu à la variation des réponses à l'AMPc dans différentes cellules.

Présents en faibles concentrations dans la membrane plasmique, les phospholipides d'inositol sont des lipides qui peuvent également être convertis en seconds messagers. Étant donné que ces molécules sont des composants membranaires, elles sont situées à proximité des récepteurs liés à la membrane et peuvent facilement interagir avec eux. Le phosphatidylinositol (PI) est le principal phospholipide qui joue un rôle dans la signalisation cellulaire. Des enzymes connues sous le nom de kinases phosphorylent le PI pour former du PI-phosphate (PIP) et du PI-bisphosphate (PIP2).


Signalisation cellulaire médiée par la phosphatidylsérine

La phosphatidylsérine (PS), un phospholipide avec un groupe de tête chargé négativement, est un constituant important des membranes eucaryotes. Plutôt que d'être un composant passif des membranes cellulaires, le PS joue un rôle important dans un certain nombre de voies de signalisation. La signalisation est médiée par des protéines recrutées et/ou activées par le PS de l'une des deux manières suivantes : via des domaines qui reconnaissent de manière stéréospécifique le groupe de tête, ou par des interactions électrostatiques avec des membranes riches en PS et présentant donc une charge de surface négative. De telles interactions sont la clé des cascades de signalisation intracellulaires et extracellulaires. Le PS, exposé de manière extracellulaire, joue un rôle déterminant dans le déclenchement de la coagulation du sang et sert également de signal "mange-moi" pour la clairance des cellules apoptotiques. À l'intérieur de la cellule, un certain nombre de voies dépendent de la PS, notamment les kinases, les petites GTPases et les protéines fusogènes. Cette revue discutera de la génération et de la distribution du PS, des méthodes actuelles de visualisation des phospholipides dans les cellules vivantes, ainsi que de la compréhension actuelle du rôle du PS dans les événements de signalisation extracellulaires et intracellulaires.


Qu'est-ce que la signalisation intracellulaire ?

La signalisation intracellulaire fait référence à la communication cellulaire qui se produit à l'intérieur de la cellule. Les récepteurs situés sur la membrane cellulaire reçoivent un signal et se transforment en un signal intracellulaire. Ensuite, les récepteurs intracellulaires continuent la transmission du signal vers la cible à l'intérieur de la cellule.

Figure 01 : Signalisation intracellulaire

La cascade de signalisation intracellulaire implique de nombreux composants et leurs modifications se produisent par des enzymes. La phosphorylation est la modification chimique la plus courante qui a lieu pendant la signalisation intracellulaire, elle active les enzymes essentielles au processus en aval. De plus, la phosphorylation provoque des changements dans leurs formes. Dans la phosphorylation, l'enzyme kinase catalyse l'addition du groupe phosphate dans les molécules. De plus, la signalisation intracellulaire utilise des messagers secondaires tels que l'ion calcium, le diacylglycérol, l'inositol triphosphate et l'AMP cyclique, etc.


Signalisation intracellulaire du plaste au noyau

La signalisation intracellulaire des plastes au noyau, appelée signalisation rétrograde, coordonne l'expression des gènes nucléaires et des plastes et est essentielle à la biogenèse des plastes et au maintien de la fonction des plastes à des niveaux optimaux. L'identification récente de plusieurs composants impliqués dans la génération rétrograde des plastes, la transmission et le contrôle de l'expression des gènes nucléaires a fourni des informations importantes sur le réseau de régulation de la signalisation rétrograde des plastes. Ici, nous passons en revue les connaissances actuelles sur les multiples voies de signalisation rétrogrades des plastes, qui sont dérivées de sources distinctes, et sur les molécules de signalisation possibles des plastes. Nous décrivons la régulation rétrograde dépendante de la signalisation de l'expression des gènes nucléaires, qui implique un contrôle transcriptionnel multicouche, ainsi que les facteurs de transcription impliqués. Nous résumons également les avancées récentes dans l'identification des composants clés de la transduction du signal des plastes vers le noyau.


Disséquer la signalisation NF-κB induite par des agents génotoxiques via la complémentation génétique de cellules 1.3E2 déficientes en NEMO

Le facteur de transcription NF-κB régule l'expression d'un ensemble diversifié de gènes pour moduler de multiples processus biologiques et pathologiques. Parmi ceux-ci, l'activation de NF-κB en réponse à des agents génotoxiques a reçu une attention considérable en raison de son rôle dans la régulation de la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie et à la radiothérapie. De plus, l'induction de cette voie par des dommages endogènes est davantage impliquée dans les processus de développement normaux, tels que le développement des cellules B et le vieillissement prématuré, entre autres. Cette voie sert également de modèle de signalisation dans lequel des signaux d'initiation nucléaire (dommages à l'ADN) sont communiqués à une cible cytoplasmique (IκB kinase et NF-κB). Plusieurs des événements moléculaires critiques de cette cascade de signalisation nucléaire à cytoplasmique NF-κB ont été découverts, en partie, par des analyses de complémentation génétique de la lignée cellulaire pré-B de souris 1.3E2 déficiente en NEMO. Ce chapitre décrit les méthodes utilisées pour générer et analyser de tels systèmes cellulaires de reconstitution et certaines mises en garde qui sont essentielles pour une interprétation correcte des défauts des mutants NEMO.


STRUCTURE PHYTOCHROME ET MÉCANISMES DE SIGNALISATION

RésuméLes phytochromes sont une famille répandue de photorécepteurs sensibles au rouge/rouge lointain découverts pour la première fois dans les plantes, où ils constituent l'une des trois principales classes de régulateurs de la photomorphogenèse. Tous les phytochromes utilisent des chromophores bilines liés de manière covalente qui permettent la photoconversion entre le rouge absorbant (Pr) et absorbant le rouge lointain (Pfr) formes. Les phytochromes sont donc des photocapteurs photocommutables. Les phytochromes canoniques ont un noyau photosensoriel N-terminal conservé et une région régulatrice C-terminale, qui comprend généralement un domaine lié à l'histidine-kinase. La découverte de nouveaux membres bactériens et cyanobactériens de la famille des phytochromes au cours de la dernière décennie a grandement facilité la caractérisation biochimique et structurelle de cette famille, la première structure cristalline d'un noyau photosensoriel bactériophytochrome apparaissant en 2005. Cette structure et d'autres études biochimiques récentes ont fourni de nouvelles perspectives passionnantes sur la structure du phytochrome, le processus de photoconversion qui est au cœur de la détection de la lumière et le mécanisme de transfert de signal par cette importante famille de photorécepteurs.


La gouttelette lipidique comme nœud de signalisation

Charles P. Najt , Douglas G. Mashek , dans Signalisation lipidique et métabolisme , 2020

Résumé

Les gouttelettes lipidiques sont largement reconnues comme le principal dépôt de stockage d'énergie dans la plupart des types de cellules. Cependant, à mesure que le domaine de la biologie des gouttelettes lipidiques s'est développé, les rôles de ces organites dynamiques se sont étendus au-delà du stockage des lipides. Ces études montrent que les gouttelettes lipidiques orchestrent de nombreuses cascades de signalisation comme moyen de régir la fonction cellulaire et le développement de la maladie. De plus, les gouttelettes lipidiques provoquent ces effets en modifiant la séquestration et la production de lipides de signalisation ainsi qu'en influençant les protéines qui recouvrent la surface des gouttelettes. Ce chapitre résumera les recherches évaluant la façon dont les gouttelettes lipidiques communiquent au sein des cellules et fournira un contexte sur la façon dont cette communication (ou mauvaise communication) peut conduire à un dysfonctionnement cellulaire.


Signalisation scientifique : informations pour les auteurs

Signalisation scientifique est une revue hebdomadaire qui publie des documents originaux relatifs au vaste domaine de la transduction du signal en physiologie et en maladie. Signalisation scientifique publie des articles de recherche originaux, des ressources de recherche, des focus et des critiques. Parmi ceux-ci, la plupart des Focus et Reviews sont généralement sollicités par les éditeurs.

Articles de recherche devraient présenter une avancée majeure en biologie réglementaire. L'étude peut être au niveau de la signalisation intracellulaire, de la signalisation intercellulaire, de la signalisation et de la régulation de l'organisme, ou de l'analyse au niveau des systèmes de la biologie régulatrice. Ils doivent inclure un résumé et être structurés comme suit : introduction, résultats, discussion et matériels et méthodes. Le matériel supplémentaire est autorisé mais doit être limité aux informations qui ne sont pas essentielles à la compréhension et à l'évaluation de la recherche présentée dans le document. Des détails sur la portée et le processus d'examen sont disponibles.

Ressources de recherche sont sélectionnés parmi les soumissions d'articles de recherche et décrivent des recherches non fondées sur des hypothèses, y compris la présentation de nouveaux outils ou techniques validés ou de bases de données ou d'ensembles de données validés pertinents pour la biologie régulatrice cellulaire ou des organismes. Consultez la page d'aide des ressources de recherche pour plus d'informations.

Points de vue souligner les opinions ou les points de vue de leurs auteurs. D'une portée plus limitée que les Reviews, ils peuvent se concentrer sur un ensemble d'articles récemment publiés ou sur des méthodes, des livres ou des questions de politique. Signalisation scientifique ne publie plus Perspectives.

UNE Se concentrer est un court article de commentaire généralement lié à un article publié dans le même numéro de Signalisation scientifique. Les focus sont toujours sollicités par les éditeurs.

Commentaires aborder des sujets d'actualité d'intérêt général et pertinents pour la transduction du signal ou la biologie réglementaire. Les critiques sont accompagnées de résumés de niveau manuel 'glosses' &mdash pour les lecteurs qui recherchent une brève introduction au sujet. Les examens devraient fournir de nouvelles perspectives et résumer les informations actuellement disponibles. Les meilleures critiques reflètent le point de vue unique de l'auteur et montrent comment les nouvelles découvertes modifient la réflexion actuelle sur les problèmes majeurs dans un domaine particulier. Les critiques sont évaluées par des pairs pour l'érudition, l'exactitude, la clarté et l'efficacité de la présentation.

Protocoles fournir des instructions et des notes étape par étape sur les techniques de recherche par transduction de signal - des informations souvent seulement évoquées dans les sections 'Matériaux et méthodes'. Signalisation scientifique ne publie plus de protocoles.

Instructions détaillées pour les auteurs

Informations générales concernant la préparation des manuscrits

Symboles, abréviations et acronymes doivent être définis la première fois qu'ils sont utilisés.

Unités de mesure doivent être exprimés en unités SI. Si les mesures ont été faites en unités anglaises, donnez des équivalents métriques.

Références et notes sont numérotées dans l'ordre où elles sont citées, d'abord par le texte et les références, puis par les légendes des tableaux et des figures. Les références à des communications personnelles ou à des manuscrits sous presse sans DOI ne sont pas autorisées. Les références des articles de revues doivent être complètes, y compris la liste complète des auteurs, les titres complets et la pagination inclusive. Des informations détaillées sont fournies dans les instructions détaillées aux auteurs pour chaque type de manuscrit.

Chiffres et tableaux peut être inclus avec tout type de manuscrit. Toutes les figures doivent être indiquées dans le texte. Les figures doivent être numérotées dans l'ordre de leur citation dans le texte. Les détails sur la préparation des figures et des tableaux sont inclus dans les instructions détaillées pour les auteurs, car ils varient selon le type de manuscrit.

Légendes des figurines doit être inclus dans le fichier texte immédiatement après le corps du texte et avant les références. La nomenclature, les abréviations, les symboles et les unités utilisés dans une figure doivent correspondre à ceux utilisés dans le texte. Le titre de la figure doit figurer sur la première ligne de la légende.

les tables devrait compléter, et non dupliquer, le texte. Ils doivent être numérotés dans l'ordre de leur citation dans le texte. La première phrase de la légende doit être un bref titre descriptif. Chaque colonne verticale d'un tableau doit avoir un titre et, le cas échéant, inclure l'unité de mesure entre parenthèses. Les unités ne doivent pas changer dans une colonne. Les titres centrés du corps du tableau peuvent être utilisés pour diviser les entrées en groupes. Les notes de bas de page doivent contenir des informations relatives à des entrées ou des parties spécifiques du tableau.

Matériaux supplémentaires peut inclure des ressources numériques, des ensembles de données volumineux ou des fichiers vidéo ou audio. Celles-ci doivent être limitées aux informations qui ne sont pas essentielles à la compréhension et à l'évaluation de l'article ou qui ne sont pas présentables dans un format imprimable. Tous les documents supplémentaires doivent être accompagnés d'une brève description textuelle, semblable à une légende. Les détails sur les formats de fichiers préférés et les tailles de fichiers sont inclus dans les instructions détaillées pour les auteurs.

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Des informations détaillées sur les formats de fichiers acceptables sont incluses dans les instructions détaillées pour les auteurs de chaque type de manuscrit.


Détection de cytokines

Divers types de cellules activées peuvent sécréter des cytokines, des chimiokines et d'autres médiateurs inflammatoires tels que la perforine et les granzymes dans le cadre d'une réponse immunitaire ou inflammatoire.

Des méthodes telles que ELISA et BD ® Cytometric Bead Array (CBA) mesurent les protéines sécrétées produites par des populations cellulaires entières. En revanche, la cytométrie en flux intracellulaire permet l'analyse des cytokines et d'autres médiateurs inflammatoires produits par des types cellulaires individuels identifiés de manière phénotypique au sein des populations cellulaires d'intérêt.

La cytométrie de flux intracellulaire permet de déterminer facilement si la production de cytokines par une population cellulaire activée est le résultat de quelques cellules produisant de grandes quantités de cytokines ou d'une grande population de cellules produisant de petites quantités de cytokines par cellule. De plus, la cytométrie en flux intracellulaire permet de mesurer facilement plusieurs cytokines simultanément, pour identifier des cellules polyfonctionnelles. 1 La coloration intracellulaire des cytokines est également utile pour une variété d'études, y compris la différenciation et la plasticité des cellules B et T.

Étant donné que les cytokines sont généralement des protéines sécrétées, elles doivent d'abord être piégées à l'intérieur de la cellule en utilisant un inhibiteur de transport de protéines. Les deux inhibiteurs de transport de protéines les plus couramment utilisés sont la monensine (BD GolgiStop™ Inhibitor) et la brefeldine A (BD GolgiPlug™ Inhibitor). La monensine empêche la sécrétion de protéines en interagissant avec le transport transmembranaire Na ++ /H + de Golgi, tandis que la brefeldine A redistribue les protéines produites intracellulairement du complexe de Golgi cis/médial vers le réticulum endoplasmique. 2 Par conséquent, le meilleur choix d'inhibiteur de transport de protéines varie selon les cytokines et les espèces (voir le tableau ci-dessous).

Espèce Cytokines Inhibiteur de transport
Humain IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α Monensin
Humain IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-12, MCP-1, MCP-3, MIG, MIP-1α, RANTES Soit Monensin ou Brefeldin A
Souris IL-6, IL-12, TNF-α Brefeldin A
Souris GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 Monensin
Souris IFN-γ, IL-2 Soit Monensin ou Brefeldin A

Production d'IFN-γ et d'IL-2 dans les cellules CD8+

Les PBMC ont été stimulées avec l'entérotoxine B staphylococcique pendant 6 heures en présence de brefeldine A. Après stimulation, les cellules ont été fixées et perméabilisées à l'aide du BD Cytofix/Cytoperm™ Buffer System. Les cellules ont été colorées avec les anticorps fluorescents suivants : CD3 FITC, CD4 PerCP-Cy5.5, CD8 BD Horizon Brilliant Violet™ 421, IFN-γ PE et IL-2 APC. Les cellules ont ensuite été lavées et analysées à l'aide du cytomètre en flux BD FACSVerse™.

BD Biosciences a simplifié la détection des cytokines et des marqueurs de surface cellulaire avec des kits, des systèmes tampons et de riches panels d'anticorps fluorescents. Des anticorps contre des marqueurs de surface et des cytokines conjugués à une variété de fluorochromes sont disponibles. Cela permet une flexibilité dans la conception du panneau de coloration, prenant en charge les analyses cytométriques en flux multicolores à haute teneur pour obtenir le plus de données à partir d'échantillons cellulaires précieux.

Les kits BD FastImmune™ contiennent des cocktails testés d'anticorps fluorescents, un inhibiteur de transport de protéines approprié, des tampons compatibles et un protocole détaillé pour la préparation, la coloration et la détection optimales des cellules productrices de cytokines à partir du sang total. Les tests embarqués sur le système de cytomètre en flux BD FACSVerse™ simplifient davantage le processus.

Le BD Cytofix/Cytoperm™ Buffer a été cité dans des milliers de publications pour l'analyse des cellules productrices de cytokines par cytométrie en flux. Les chercheurs sélectionnent l'inhibiteur de transport de protéines le mieux adapté à leur cytokine d'intérêt et utilisent le BD Cytofix/Cytoperm™ Buffer System pour fixer, perméabiliser et colorer leurs cellules pour une analyse par cytométrie en flux.

Production d'IFN-γ spécifique de l'antigène par les lymphocytes CD4 + CD69 + T stimulés par le cytomégalovirus (CMV) pp65.


La signalisation cellulaire

La capacité des cellules à réguler temporellement et spatialement les processus cellulaires au sein de leur microenvironnement en réponse à des signaux physiques et biochimiques est essentielle à toutes les formes de vie. Des voies de signalisation cellulaire spécifiques sont couramment modifiées dans une gamme de maladies, offrant aux chercheurs l'opportunité d'étudier et d'identifier les cibles biochimiques impliquées et de développer des stratégies thérapeutiques.

Agilent Cell Analysis propose de nouvelles techniques pour élucider les voies de signalisation cellulaire via :

  • Méthodes avancées de cytométrie en flux NovoCyte, fournissant à la fois une analyse de population et de cellule unique de biomarqueurs et une altération des voies de signalisation par des modifications post-traductionnelles des protéines intracellulaires et
  • L'analyse cellulaire en temps réel xCELLigence (RTCA), qui fournit un test fonctionnel hautement sensible et cinétique pour l'évaluation des processus médiés par les récepteurs via les événements initiaux de &ldquosensing&rdquo.

En savoir plus sur les autres gammes de produits et applications Agilent Cell Analysis.