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Mesure de la densité optique avec/sans remise en suspension des cellules


Lors de la mesure de l'absorbance à l'aide d'un lecteur de plaque, est-il nécessaire (ou mieux) de remettre la culture en suspension si la plaque est restée immobile pendant 1 à 2 jours ?

Bien que cela puisse être une bonne question de physique, je suis plus intéressé par la bonne technique d'analyse biologique.

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Les deux options sont :

1) faire pousser des microbes dans une plaque à l'intérieur d'un incubateur statique, puis mettre la plaque dans un lecteur de plaque sans pour autant agiter le liquide

2) faire pousser des microbes dans une plaque à l'intérieur d'un incubateur statique, puis mettre la plaque dans un lecteur de plaque après agiter le liquide

Dans l'option 2, l'agitation pourrait être réalisée en pipetant doucement le liquide de haut en bas à quelques reprises…


Certainement (2). Les amas de cellules causeront beaucoup de bruit dans vos mesures d'absorbance (selon que le faisceau lumineux frappe un amas ou un espace vide).

Je ne sais pas quel est votre microbe ou sur quel milieu de croissance vous testez, mais il est généralement très important de maintenir la culture bien mélangée à tout moment, pas seulement pendant la mesure. Si vos cellules s'agglomèrent au fond, vous n'obtiendrez pas la même aération que si elles sont bien mélangées, et l'accessibilité d'autres nutriments pourrait également être limitée. Généralement, la condition la plus contrôlée est de maintenir un bon mélange à tout moment, mais cela dépend certainement de l'organisme et du milieu.


9.1 : Comment les microbes se développent

  • Contribution d'OpenStax
  • Biologie Générale à OpenStax CNX
  • Définir le temps de génération pour la croissance basée sur la fission binaire
  • Identifier et décrire les activités des micro-organismes subissant des phases typiques de fission binaire (division cellulaire simple) dans une courbe de croissance
  • Expliquer plusieurs méthodes de laboratoire utilisées pour déterminer le nombre de cellules viables et totales dans les populations en croissance exponentielle
  • Décrire des exemples de division cellulaire n'impliquant pas de fission binaire, comme le bourgeonnement ou la fragmentation
  • Décrire la formation et les caractéristiques des biofilms
  • Identifier les risques pour la santé associés aux biofilms et comment ils sont traités
  • Décrire le quorum sensing et son rôle dans la communication de cellule à cellule et la coordination des activités cellulaires

Clinique Zone de mise au point : PARTIE 1

Jeni, une femme enceinte de 24 ans dans son deuxième trimestre, se rend dans une clinique avec des plaintes de fièvre élevée, 38,9 °C (102 °F), de fatigue et de douleurs musculaires et de signes et symptômes typiques de la grippe. Jeni fait de l'exercice régulièrement et suit un régime nutritif en mettant l'accent sur les aliments biologiques, y compris le lait cru qu'elle achète sur un marché fermier local. Tous ses vaccins sont à jour. Cependant, le fournisseur de soins de santé qui voit Jeni est inquiet et ordonne qu'un échantillon de sang soit envoyé pour analyse par le laboratoire de microbiologie.

Pourquoi le fournisseur de soins de santé s'inquiète-t-il des signes et symptômes de Jeni&rsquos ?

Le cycle cellulaire bactérien implique la formation de nouvelles cellules par la réplication de l'ADN et la partition des composants cellulaires en deux cellules filles. Chez les procaryotes, la reproduction est toujours asexuée, bien qu'une vaste recombinaison génétique sous forme de transfert horizontal de gènes ait lieu, comme cela sera exploré dans un chapitre différent. La plupart des bactéries ont un seul chromosome circulaire, cependant, il existe quelques exceptions. Par exemple, Borrelia burgdorferi, l'agent causal de la maladie de Lyme, possède un chromosome linéaire.

Fission binaire

Le mécanisme de réplication cellulaire le plus courant chez les bactéries est un processus appelé fission binaire, qui est illustré à la figure (PageIndex<1>):. Avant de se diviser, la cellule se développe et augmente son nombre de composants cellulaires. Ensuite, la réplication de l'ADN commence à un endroit sur le chromosome circulaire appelé origine de réplication, où le chromosome est attaché à la membrane cellulaire interne. La réplication se poursuit dans des directions opposées le long du chromosome jusqu'à ce que le terminus soit atteint.

Figure (PageIndex<1>): (a) La micrographie électronique montre deux cellules de Salmonella typhimurium après un événement de fission binaire. (b) La fission binaire chez les bactéries commence par la réplication de l'ADN à mesure que la cellule s'allonge. Un septum de division se forme au centre de la cellule. Deux cellules filles de taille similaire se forment et se séparent, chacune recevant une copie du chromosome d'origine. (crédit a : modification des travaux par les Centers for Disease Control and Prevention).

Le centre de la cellule agrandie se contracte jusqu'à ce que deux cellules filles soient formées, chaque progéniture recevant une copie complète du génome parental et une division du cytoplasme (cytokinèse). Ce processus de cytokinèse et de division cellulaire est dirigé par une protéine appelée FtsZ. FtsZ s'assemble en un anneau Z sur la membrane cytoplasmique (Figure (PageIndex<2>)). L'anneau Z est ancré par les protéines de liaison FtsZ et définit le plan de division entre les deux cellules filles. Des protéines supplémentaires nécessaires à la division cellulaire sont ajoutées à l'anneau Z pour former une structure appelée divisome. Le divisome s'active pour produire une paroi cellulaire de peptidoglycane et construire un septum qui divise les deux cellules filles. Les cellules filles sont séparées par le septum de division, où toutes les couches externes des cellules (la paroi cellulaire et les membranes externes, le cas échéant) doivent être remodelées pour terminer la division. Par exemple, nous savons que des enzymes spécifiques rompent les liaisons entre les monomères dans les peptidoglycanes et permettent l'ajout de nouvelles sous-unités le long du septum de division.

Figure (PageIndex<2>) : les protéines FtsZ s'assemblent pour former un anneau Z qui est ancré à la membrane plasmique. L'anneau Z pince l'enveloppe cellulaire pour séparer le cytoplasme des nouvelles cellules.

Quel est le nom de la protéine qui s'assemble en un anneau Z pour initier la cytokinèse et la division cellulaire ?

Temps de génération

Chez les organismes eucaryotes, le temps de génération est le temps entre les mêmes points du cycle de vie dans deux générations successives. Par exemple, le temps de génération typique pour la population humaine est de 25 ans. Cette définition n'est pas pratique pour les bactéries, qui peuvent se reproduire rapidement ou rester dormantes pendant des milliers d'années. Chez les procaryotes (bactéries et archées), le temps de génération est également appelé temps de doublement et est défini comme le temps nécessaire à la population pour doubler au cours d'un cycle de fission binaire. Les temps de doublement bactérien varient énormément. Tandis que Escherichia coli peuvent doubler en aussi peu que 20 minutes dans des conditions de croissance optimales en laboratoire, les bactéries de la même espèce peuvent avoir besoin de plusieurs jours pour doubler dans des environnements particulièrement difficiles. La plupart des agents pathogènes se développent rapidement, comme E. coli, mais il y a des exceptions. Par exemple, Mycobacterium tuberculosis, l'agent causal de la tuberculose, a un temps de génération compris entre 15 et 20 heures. D'autre part, M. leprae, qui cause la maladie de Hansen (lèpre), croît beaucoup plus lentement, avec un temps de doublement de 14 jours.

CALCUL DU NOMBRE DE CELLULES

Il est possible de prédire le nombre de cellules dans une population lorsqu'elles se divisent par fission binaire à un taux constant. À titre d'exemple, considérons ce qui se passe si une seule cellule se divise toutes les 30 minutes pendant 24 heures. Le diagramme de la figure (PageIndex<3>) montre l'augmentation du nombre de cellules pour les trois premières générations.

Le nombre de cellules augmente de façon exponentielle et peut être exprimé comme 2 m , où m est le nombre de générations. Si les cellules se divisent toutes les 30 minutes, après 24 heures, 48 ​​divisions auraient eu lieu. Si on applique la formule 2 m , où m est égal à 48, la cellule unique donnerait naissance à 2 48 ou 281 474 976 710 656 cellules à 48 générations (24 heures). Lorsqu'il s'agit de nombres aussi énormes, il est plus pratique d'utiliser la notation scientifique. Par conséquent, nous exprimons le nombre de cellules sous la forme 2,8 x 10 14 cellules.

Dans notre exemple, nous avons utilisé une cellule comme nombre initial de cellules. Pour un nombre quelconque de cellules de départ, la formule est adaptée comme suit :

Nm est le nombre de cellules à n'importe quelle génération m, N0 est le nombre initial de cellules, et m est le nombre de générations.

Figure (PageIndex<3>) : La cellule parentale se divise et donne naissance à deux cellules filles. Chacune des cellules filles, à son tour, se divise, donnant un total de quatre cellules dans la deuxième génération et de huit cellules dans la troisième génération. Chaque division double le nombre de cellules.

Avec un temps de doublement de 30 minutes et une taille de population de départ de 1 & x 10 5 cellules, combien de cellules seront présentes après 2 heures, en supposant qu'il n'y ait pas de mort cellulaire ?

La courbe de croissance

Les micro-organismes cultivés en culture fermée (également connue sous le nom de culture discontinue), dans laquelle aucun élément nutritif n'est ajouté et la plupart des déchets ne sont pas éliminés, suivent un modèle de croissance reproductible appelé courbe de croissance. Un exemple de culture discontinue dans la nature est un étang dans lequel un petit nombre de cellules se développent dans un environnement fermé. La densité de culture est définie comme le nombre de cellules par unité de volume. Dans un environnement fermé, la densité de culture est également une mesure du nombre de cellules dans la population. Les infections du corps ne suivent pas toujours la courbe de croissance, mais des corrélations peuvent exister selon le site et le type d'infection. Lorsque le nombre de cellules vivantes est tracé en fonction du temps, des phases distinctes peuvent être observées dans la courbe (Figure (PageIndex<4>)).

Figure (PageIndex<4>) : La courbe de croissance d'une culture bactérienne est représentée par le logarithme du nombre de cellules vivantes tracé en fonction du temps. Le graphique peut être divisé en quatre phases selon la pente, dont chacune correspond aux événements de la cellule. Les quatre phases sont le décalage, le journal, l'arrêt et la mort.

La phase de latence

Le début de la courbe de croissance représente un petit nombre de cellules, appelées inoculum, qui sont ajoutées à un milieu de culture frais, un bouillon nutritionnel qui favorise la croissance. La phase initiale de la courbe de croissance est appelée phase de latence, au cours de laquelle les cellules se préparent pour la prochaine phase de croissance. Le nombre de cellules ne change pas pendant la phase de latence, cependant, les cellules grossissent et sont métaboliquement actives, synthétisant les protéines nécessaires à la croissance dans le milieu. Si des cellules ont été endommagées ou choquées lors du transfert vers le nouveau milieu, la réparation a lieu pendant la phase de latence. La durée de la phase de latence est déterminée par de nombreux facteurs, notamment l'espèce et la constitution génétique des cellules, la composition du milieu et la taille de l'inoculum d'origine.

La phase de journalisation

Dans la phase de croissance logarithmique (log), parfois appelée phase de croissance exponentielle, les cellules se divisent activement par fission binaire et leur nombre augmente de façon exponentielle. Pour toute espèce bactérienne donnée, le temps de génération dans des conditions de croissance spécifiques (nutriments, température, pH, etc.) est déterminé génétiquement, et ce temps de génération est appelé taux de croissance intrinsèque. Pendant la phase logarithmique, la relation entre le temps et le nombre de cellules n'est pas linéaire mais exponentielle cependant, la courbe de croissance est souvent tracée sur un graphique semilogarithmique, comme le montre la figure (PageIndex<5>), qui donne l'apparence de une relation linéaire.

Figure (PageIndex<5>) : les deux graphiques illustrent la croissance de la population pendant la phase log pour un échantillon bactérien avec une population initiale d'une cellule et un temps de doublement de 1 heure. (a) Lorsqu'il est tracé sur une échelle arithmétique, le taux de croissance ressemble à une courbe. (b) Lorsqu'il est tracé sur une échelle semilogarithmique (ce qui signifie que les valeurs sur l'axe des y sont logarithmiques), le taux de croissance apparaît linéaire.

Les cellules en phase logarithmique présentent un taux de croissance constant et une activité métabolique uniforme. Pour cette raison, les cellules en phase log sont préférentiellement utilisées pour des applications industrielles et des travaux de recherche. La phase logarithmique est également l'étape où les bactéries sont les plus sensibles à l'action des désinfectants et des antibiotiques courants qui affectent la synthèse des protéines, de l'ADN et de la paroi cellulaire.

État stationnaire

Au fur et à mesure que le nombre de cellules augmente au cours de la phase logarithmique, plusieurs facteurs contribuent à un ralentissement du taux de croissance. Les déchets s'accumulent et les nutriments s'épuisent progressivement. De plus, l'épuisement progressif de l'oxygène commence à limiter la croissance des cellules aérobies. Cette combinaison de conditions défavorables ralentit et finalement cale la croissance démographique. Le nombre total de cellules vivantes atteint un plateau appelé phase stationnaire (Figure (PageIndex<4>)). Dans cette phase, le nombre de nouvelles cellules créées par division cellulaire est désormais équivalent au nombre de cellules mourant ainsi, la population totale de cellules vivantes est relativement stagnante. La densité de culture dans une culture stationnaire est constante. La capacité de charge de la culture, ou densité de culture maximale, dépend des types de micro-organismes dans la culture et des conditions spécifiques de la culture. Cependant, la capacité de charge est constante pour un organisme donné cultivé dans les mêmes conditions.

Pendant la phase stationnaire, les cellules passent à un mode de métabolisme de survie. Au fur et à mesure que la croissance ralentit, la synthèse des peptidoglycanes, des protéines et des acides nucléiques ralentit également, les cultures stationnaires sont donc moins sensibles aux antibiotiques qui perturbent ces processus. Dans les bactéries capables de produire des endospores, de nombreuses cellules subissent une sporulation pendant la phase stationnaire. Les métabolites secondaires, y compris les antibiotiques, sont synthétisés en phase stationnaire. Chez certaines bactéries pathogènes, la phase stationnaire est également associée à l'expression de facteurs de virulence, produits qui contribuent à la capacité des microbes à survivre, se reproduire et provoquer des maladies dans un organisme hôte. Par exemple, la détection de quorum dans Staphylococcus aureus initie la production d'enzymes capables de décomposer les tissus humains et les débris cellulaires, ouvrant la voie à la propagation des bactéries dans de nouveaux tissus où les nutriments sont plus abondants.

La phase de la mort

Au fur et à mesure qu'un milieu de culture accumule des déchets toxiques et que les nutriments s'épuisent, les cellules meurent en nombre de plus en plus important. Bientôt, le nombre de cellules mourantes dépasse le nombre de cellules en division, entraînant une diminution exponentielle du nombre de cellules (Figure (PageIndex<4>)). C'est la phase de mort qui porte bien son nom, parfois appelée phase de déclin. De nombreuses cellules lysent et libèrent des nutriments dans le milieu, permettant aux cellules survivantes de maintenir leur viabilité et de former des endospores. Quelques cellules, appelées persistantes, sont caractérisées par un métabolisme lent. Les cellules persistantes sont médicalement importantes car elles sont associées à certaines infections chroniques, telles que la tuberculose, qui ne répondent pas au traitement antibiotique.

Maintien de la croissance microbienne

Le modèle de croissance illustré à la figure (PageIndex<4>) se déroule dans un environnement fermé, les nutriments ne sont pas ajoutés et les déchets et les cellules mortes ne sont pas éliminés. Dans de nombreux cas, cependant, il est avantageux de maintenir les cellules dans la phase logarithmique de croissance. Un exemple est dans les industries qui récoltent des produits microbiens. Un chémostat (Figure (PageIndex<6>)) est utilisé pour maintenir une culture continue dans laquelle les nutriments sont fournis à un rythme constant. Une quantité contrôlée d'air est mélangée pour les processus aérobies. La suspension bactérienne est éliminée au même rythme que les nutriments affluent pour maintenir un environnement de croissance optimal.

Figure (PageIndex<6>) : un chemostat est un récipient de culture équipé d'une ouverture pour ajouter des nutriments (aliments) et d'une sortie pour éliminer le contenu (effluent), diluant efficacement les déchets toxiques et les cellules mortes. L'ajout et le retrait de fluides sont ajustés pour maintenir la culture dans la phase logarithmique de croissance. Si des bactéries aérobies sont cultivées, des niveaux d'oxygène appropriés sont maintenus.

  1. Au cours de quelle phase la croissance se produit-elle au rythme le plus rapide ?
  2. Nommez deux facteurs qui limitent la croissance microbienne.

Mesure de la croissance bactérienne

L'estimation du nombre de cellules bactériennes dans un échantillon, connue sous le nom de numération bactérienne, est une tâche courante effectuée par les microbiologistes. Le nombre de bactéries dans un échantillon clinique sert d'indication de l'étendue d'une infection. Le contrôle de la qualité de l'eau potable, des aliments, des médicaments et même des cosmétiques repose sur des estimations du nombre de bactéries pour détecter la contamination et prévenir la propagation des maladies. Deux approches principales sont utilisées pour mesurer le nombre de cellules. Les méthodes directes impliquent le comptage des cellules, tandis que les méthodes indirectes dépendent de la mesure de la présence ou de l'activité des cellules sans réellement compter les cellules individuelles. Les méthodes directes et indirectes présentent des avantages et des inconvénients pour des applications spécifiques.

Comptage direct de cellules

Le comptage direct des cellules fait référence au comptage des cellules dans une culture liquide ou des colonies sur une plaque. C'est un moyen direct d'estimer le nombre d'organismes présents dans un échantillon. Examinons d'abord une méthode simple et rapide qui ne nécessite qu'une lame spécialisée et un microscope composé.

La façon la plus simple de compter les bactéries s'appelle la numération cellulaire microscopique directe, qui consiste à transférer un volume connu d'une culture sur une lame calibrée et à compter les cellules sous un microscope optique. La lame calibrée est appelée chambre de Petroff-Hausser (Figure (PageIndex<7>)) et est similaire à un hémocytomètre utilisé pour compter les globules rouges. La zone centrale de la chambre de comptage est gravée en carrés de différentes tailles. Un échantillon de la suspension de culture est ajouté à la chambre sous une lamelle qui est placée à une hauteur spécifique de la surface de la grille. Il est possible d'estimer la concentration de cellules dans l'échantillon d'origine en comptant les cellules individuelles dans un certain nombre de carrés et en déterminant le volume de l'échantillon observé. La surface des carrés et la hauteur à laquelle la lamelle est positionnée sont spécifiées pour la chambre. La concentration doit être corrigée pour la dilution si l'échantillon a été dilué avant le dénombrement.

Figure (PageIndex<7>): (a) Une chambre de Petroff-Hausser est une lame spéciale conçue pour compter les cellules bactériennes dans un volume mesuré d'un échantillon. Une grille est gravée sur la glissière pour faciliter la précision du comptage. (b) Ce diagramme illustre la grille d'une chambre de Petroff-Hausser, qui est constituée de carrés d'aires connues. La vue agrandie montre le carré dans lequel les bactéries (globules rouges) sont comptées. Si la lamelle est à 0,2 mm au-dessus de la grille et que le carré a une aire de 0,04 mm 2 , alors le volume est de 0,008 mm 3 , soit 0,000008 ml. Puisqu'il y a 10 cellules à l'intérieur du carré, la densité des bactéries est de 10 cellules/0,000008 mL, ce qui équivaut à 1 250 000 cellules/mL. (crédit a : modification d'œuvre par Jeffrey M. Vinocur)

Les cellules dans plusieurs petits carrés doivent être comptées et la moyenne prise pour obtenir une mesure fiable. Les avantages de la chambre sont que la méthode est facile à utiliser, relativement rapide et peu coûteuse. Par contre, la chambre de comptage ne fonctionne pas bien avec les cultures diluées car il peut ne pas y avoir assez de cellules pour compter.

L'utilisation d'une chambre de comptage ne donne pas nécessairement un décompte précis du nombre de cellules vivantes car il n'est pas toujours possible de faire la distinction entre les cellules vivantes, les cellules mortes et les débris de la même taille au microscope. Cependant, les nouvelles techniques de coloration par fluorescence permettent de distinguer les bactéries viables et mortes. Ces taches de viabilité (ou taches vivantes) se lient aux acides nucléiques, mais les taches primaires et secondaires diffèrent par leur capacité à traverser la membrane cytoplasmique. Le colorant primaire, qui émet une fluorescence verte, peut pénétrer dans les membranes cytoplasmiques intactes, colorant à la fois les cellules vivantes et mortes. Le colorant secondaire, qui émet une fluorescence rouge, ne peut colorer une cellule que si la membrane cytoplasmique est considérablement endommagée. Ainsi, les cellules vivantes émettent une fluorescence verte car elles n'absorbent que la coloration verte, tandis que les cellules mortes apparaissent en rouge car la coloration rouge déplace la coloration verte sur leurs acides nucléiques (Figure (PageIndex<8>)).

Figure (PageIndex<8>): La coloration par fluorescence peut être utilisée pour différencier les cellules bactériennes viables et mortes dans un échantillon à des fins de comptage. Les cellules viables sont colorées en vert, tandis que les cellules mortes sont colorées en rouge. (crédit : modification d'œuvre par Panseri S, Cunha C, D&rsquoAlessandro T, Sandri M, Giavaresi G, Maracci M, Hung CT, Tampieri A)

Une autre technique utilise un dispositif électronique de comptage de cellules (compteur Coulter) pour détecter et compter les changements de résistance électrique dans une solution saline. Un tube de verre avec une petite ouverture est immergé dans une solution d'électrolyte. Une première électrode est suspendue dans le tube de verre. Une seconde électrode est située à l'extérieur du tube. Lorsque les cellules sont tirées à travers la petite ouverture dans le tube de verre, elles modifient brièvement la résistance mesurée entre les deux électrodes et le changement est enregistré par un capteur électronique (Figure (PageIndex<9>)) chaque changement de résistance représente une cellule . La méthode est rapide et précise dans une plage de concentrations cependant, si la culture est trop concentrée, plus d'une cellule peut traverser l'ouverture à un moment donné et fausser les résultats. Cette méthode ne fait pas non plus la différence entre les cellules vivantes et mortes.

Les comptages directs fournissent une estimation du nombre total de cellules dans un échantillon. Cependant, dans de nombreuses situations, il est important de connaître le nombre de cellules vivantes ou viables. Le dénombrement des cellules vivantes est nécessaire pour évaluer l'étendue d'une infection, l'efficacité des composés antimicrobiens et des médicaments, ou la contamination des aliments et de l'eau.

Figure (PageIndex<9>) : Un compteur Coulter est un appareil électronique qui compte les cellules. Il mesure le changement de résistance dans une solution d'électrolyte qui se produit lorsqu'une cellule passe à travers une petite ouverture dans la paroi intérieure du conteneur. Un détecteur compte automatiquement le nombre de cellules passant par l'ouverture. (crédit b : modification des travaux par les National Institutes of Health)

  1. Pourquoi voudriez-vous compter le nombre de cellules dans plus d'un carré dans la chambre de Petroff-Hausser pour estimer le nombre de cellules ?
  2. Dans la méthode de coloration de viabilité, pourquoi les cellules mortes apparaissent-elles en rouge ?

Numération sur plaque

Le nombre de plaques viables, ou simplement le nombre de plaques, est un nombre de cellules viables ou vivantes. Il est basé sur le principe que les cellules viables se répliquent et donnent naissance à des colonies visibles lorsqu'elles sont incubées dans des conditions adaptées à l'échantillon. Les résultats sont généralement exprimés en unités formant colonie par millilitre (CFU/mL) plutôt qu'en cellules par millilitre, car plusieurs cellules peuvent avoir atterri au même endroit pour donner naissance à une seule colonie. De plus, les échantillons de bactéries qui se développent en grappes ou en chaînes sont difficiles à disperser et une seule colonie peut représenter plusieurs cellules. Certaines cellules sont décrites comme viables mais non cultivables et ne formeront pas de colonies sur des milieux solides. Pour toutes ces raisons, le nombre de plaques viables est considéré comme une faible estimation du nombre réel de cellules vivantes. Ces limitations n'enlèvent rien à l'utilité de la méthode, qui fournit des estimations du nombre de bactéries vivantes.

Les microbiologistes comptent généralement les plaques avec 30 à 300 colonies. Les échantillons avec trop peu de colonies (<30) ne donnent pas des nombres statistiquement fiables, et les plaques surpeuplées (>300 colonies) rendent difficile le décompte précis des colonies individuelles. De plus, les comptes dans cette plage minimisent les occurrences de plus d'une cellule bactérienne formant une seule colonie. Ainsi, le CFU calculé est plus proche du nombre réel de bactéries vivantes dans la population.

Il existe deux approches courantes pour inoculer des plaques pour des dénombrements viables : la méthode de la plaque de coulée et la méthode de la plaque d'étalement. Bien que la procédure d'inoculation finale diffère entre ces deux méthodes, elles commencent toutes deux par une dilution en série de la culture.

Dilution en série

La dilution en série d'une culture est une première étape importante avant de passer à la méthode de la plaque de coulée ou de la plaque d'étalement. L'objectif du processus de dilution en série est d'obtenir des plaques avec des UFC de l'ordre de 30&ndash300, et le processus implique généralement plusieurs dilutions par multiples de 10 pour simplifier le calcul. Le nombre de dilutions en série est choisi en fonction d'une estimation préalable de la densité de culture. La figure (PageIndex<10>) illustre la méthode de dilution en série.

Figure (PageIndex<10>) : La dilution en série consiste à diluer un volume fixe de cellules mélangées à une solution de dilution en utilisant la dilution précédente comme inoculum. Le résultat est la dilution de la culture d'origine par un facteur de croissance exponentielle. (crédit : modification du travail par &ldquoLeberechtc&rdquo/Wikimedia Commons)

Un volume fixe de la culture d'origine, 1,0 ml, est ajouté et soigneusement mélangé à la solution du premier tube de dilution, qui contient 9,0 ml de bouillon stérile. Cette étape représente un facteur de dilution de 10, ou 1:10, par rapport à la culture d'origine. A partir de cette première dilution, le même volume, 1,0 mL, est prélevé et mélangé avec un nouveau tube de 9,0 mL de solution de dilution. Le facteur de dilution est maintenant de 1:100 par rapport à la culture d'origine. Ce processus se poursuit jusqu'à ce qu'une série de dilutions soit produite qui encadrera la concentration cellulaire souhaitée pour un comptage précis. A partir de chaque tube, un échantillon est étalé sur milieu solide en utilisant soit la méthode de la plaque de coulée (Figure (PageIndex<11>)) soit la méthode de la plaque d'étalement (Figure (PageIndex<12>)). Les plaques sont incubées jusqu'à l'apparition de colonies. Deux à trois plaques sont généralement préparées à partir de chaque dilution et le nombre de colonies comptées sur chaque plaque est moyenné. Dans tous les cas, un mélange minutieux des échantillons avec le milieu de dilution (pour s'assurer que la distribution des cellules dans le tube est aléatoire) est primordial pour obtenir des résultats fiables.

Figure (PageIndex<11>) : dans la méthode de comptage des cellules sur plaque de coulée, l'échantillon est mélangé dans de la gélose chaude liquide (45&ndash50°C) versée dans une boîte de Pétri stérile et mélangée davantage par tourbillonnement. Ce processus est répété pour chaque dilution en série préparée. Les colonies résultantes sont comptées et fournissent une estimation du nombre de cellules dans le volume d'origine échantillonné.

Le facteur de dilution est utilisé pour calculer le nombre de cellules dans la culture cellulaire d'origine. Dans notre exemple, une moyenne de 50 colonies a été comptée sur les plaques obtenues à partir de la dilution 1:10 000. Étant donné que seulement 0,1 ml de suspension a été pipeté sur la plaque, le multiplicateur requis pour reconstituer la concentration d'origine est de 10 x 10 000. Le nombre d'UFC par mL est égal à 50 &fois 100 &fois 10 000 = 5 000 000. Le nombre de bactéries dans la culture est estimé à 5 millions de cellules/mL. Le nombre de colonies obtenu à partir de la dilution 1:1000 était de 389, bien en deçà des 500 attendus pour une différence de 10 fois dans les dilutions. Cela met en évidence le problème de l'inexactitude lorsque le nombre de colonies est supérieur à 300 et que plus d'une cellule bactérienne se développe en une seule colonie.

Figure (PageIndex<12>) : Dans la méthode de comptage cellulaire sur plaque étalée, l'échantillon est versé sur de la gélose solide puis étalé à l'aide d'un étaleur stérile. Ce processus est répété pour chaque dilution en série préparée. Les colonies résultantes sont comptées et fournissent une estimation du nombre de cellules dans les échantillons de volume d'origine.

Un échantillon très dilué d'eau potable, par exemple, peut ne pas contenir suffisamment d'organismes pour utiliser l'une des méthodes de comptage sur plaque décrites. Dans de tels cas, l'échantillon d'origine doit être concentré plutôt que dilué avant l'étalement. Ceci peut être accompli en utilisant une modification de la technique de comptage sur plaque appelée technique de filtration sur membrane. Les volumes connus sont filtrés sous vide de manière aseptique à travers une membrane avec une taille de pores suffisamment petite pour piéger les micro-organismes. La membrane est transférée sur une plaque de Petri contenant un milieu de croissance approprié. Les colonies sont comptées après incubation. Le calcul de la densité cellulaire est effectué en divisant le nombre de cellules par le volume de liquide filtré.

Regardez cette vidéo pour des démonstrations de dilutions en série et de techniques de plaques étalées.

Le nombre le plus probable

Le nombre de micro-organismes dans les échantillons dilués est généralement trop faible pour être détecté par les méthodes de comptage sur plaque décrites jusqu'à présent. Pour ces échantillons, les microbiologistes utilisent régulièrement la méthode du nombre le plus probable (NPP), une procédure statistique pour estimer le nombre de micro-organismes viables dans un échantillon. Souvent utilisée pour les échantillons d'eau et d'aliments, la méthode MPN évalue la croissance détectable en observant les changements de turbidité ou de couleur dus à l'activité métabolique.

Une application typique de la méthode MPN est l'estimation du nombre de coliformes dans un échantillon d'eau de bassin. Les coliformes sont des bactéries en bâtonnets à Gram négatif qui fermentent le lactose. La présence de coliformes dans l'eau est considérée comme un signe de contamination par les matières fécales. Pour la méthode illustrée à la figure (PageIndex<13>), une série de trois dilutions de l'échantillon d'eau est testée en inoculant cinq tubes de bouillon de lactose avec 10 ml d'échantillon, cinq tubes de bouillon de lactose avec 1 ml d'échantillon, et cinq tubes de bouillon de lactose avec 0,1 ml d'échantillon. Les tubes de bouillon de lactose contiennent un indicateur de pH qui change de couleur du rouge au jaune lorsque le lactose est fermenté. Après l'inoculation et l'incubation, les tubes sont examinés pour une indication de la croissance des coliformes par un changement de couleur du milieu du rouge au jaune. Le premier jeu de tubes (échantillon de 10 ml) a montré une croissance dans tous les tubes le deuxième jeu de tubes (1 ml) a montré une croissance dans deux tubes sur cinq dans le troisième jeu de tubes, aucune croissance n'est observée dans aucun des tubes (dilution 0,1 mL). Les nombres 5, 2 et 0 sont comparés à la figure B1 de l'annexe B, qui a été construite à l'aide d'un modèle probabiliste de la procédure d'échantillonnage. De notre lecture du tableau, nous concluons que 49 est le nombre le plus probable de bactéries pour 100 ml d'eau de bassin.

Figure (PageIndex<13>) : dans la méthode du nombre le plus probable, des ensembles de cinq tubes de bouillon de lactose sont inoculés avec trois volumes différents d'eau de bassin : 10 ml, 1 ml et 0,1 ml. La croissance bactérienne est évaluée par un changement de couleur du bouillon du rouge au jaune au fur et à mesure que le lactose est fermenté.

  1. Qu'est-ce qu'une unité formant colonie?
  2. Quelles sont les deux méthodes fréquemment utilisées pour estimer le nombre de bactéries dans les échantillons d'eau ?

Comptages cellulaires indirects

Outre les méthodes directes de comptage des cellules, d'autres méthodes, basées sur une détection indirecte de la densité cellulaire, sont couramment utilisées pour estimer et comparer les densités cellulaires dans une culture. La principale approche consiste à mesurer la turbidité (nébulosité) d'un échantillon de bactéries dans une suspension liquide. L'instrument de laboratoire utilisé pour mesurer la turbidité est appelé spectrophotomètre (Figure (PageIndex<14>)). Dans un spectrophotomètre, un faisceau lumineux est transmis à travers une suspension bactérienne, la lumière traversant la suspension est mesurée par un détecteur, et la quantité de lumière traversant l'échantillon et atteignant le détecteur est convertie en pourcentage de transmission ou en une valeur logarithmique appelée absorbance (densité optique). À mesure que le nombre de bactéries dans une suspension augmente, la turbidité augmente également et fait que moins de lumière atteint le détecteur. La diminution de la lumière traversant l'échantillon et atteignant le détecteur est associée à une diminution du pourcentage de transmission et à une augmentation de l'absorbance mesurée par le spectrophotomètre.

La mesure de la turbidité est une méthode rapide pour estimer la densité cellulaire tant qu'il y a suffisamment de cellules dans un échantillon pour produire de la turbidité. Il est possible de corréler les lectures de turbidité au nombre réel de cellules en effectuant une numération sur plaque viable d'échantillons prélevés sur des cultures ayant une plage de valeurs d'absorbance. En utilisant ces valeurs, une courbe d'étalonnage est générée en traçant la turbidité en fonction de la densité cellulaire. Une fois la courbe d'étalonnage produite, elle peut être utilisée pour estimer le nombre de cellules pour tous les échantillons obtenus ou cultivés dans des conditions similaires et avec des densités comprises dans la plage de valeurs utilisées pour construire la courbe.

Figure (PageIndex<14>): (a) Un spectrophotomètre est couramment utilisé pour mesurer la turbidité d'une suspension de cellules bactériennes comme mesure indirecte de la densité cellulaire. (b) Un spectrophotomètre fonctionne en divisant la lumière blanche d'une source en un spectre. Le spectrophotomètre permet de choisir la longueur d'onde de la lumière à utiliser pour la mesure. La densité optique (turbidité) de l'échantillon dépendra de la longueur d'onde, donc une fois qu'une longueur d'onde est choisie, elle doit être utilisée de manière cohérente. La lumière filtrée traverse l'échantillon (ou un témoin avec uniquement du milieu) et l'intensité lumineuse est mesurée par un détecteur. La lumière passant dans une suspension de bactéries est diffusée par les cellules de telle sorte qu'une partie de celle-ci n'atteint jamais le détecteur. Cette diffusion se produit à un degré bien moindre dans le tube témoin avec uniquement le milieu. (crédit a : modification de l'œuvre par Hwang HS, Kim MS crédit b &ldquotest tube photos&rdquo : modification de l'œuvre par Suzanne Wakim)

La mesure du poids sec d'un échantillon de culture est une autre méthode indirecte d'évaluation de la densité de culture sans mesurer directement le nombre de cellules. La suspension cellulaire utilisée pour la pesée doit être concentrée par filtration ou centrifugation, lavée puis séchée avant la prise des mesures. Le degré de séchage doit être standardisé pour tenir compte de la teneur en eau résiduelle. Cette méthode est particulièrement utile pour les micro-organismes filamenteux, qui sont difficiles à dénombrer par comptage direct ou viable sur plaque.

Comme nous l'avons vu, les méthodes pour estimer le nombre de cellules viables peuvent être laborieuses et prendre du temps car les cellules doivent être cultivées. Récemment, des moyens indirects de mesure des cellules vivantes ont été développés qui sont à la fois rapides et faciles à mettre en œuvre. Ces méthodes mesurent l'activité cellulaire en suivant la production de produits métaboliques ou la disparition de réactifs. La formation d'adénosine triphosphate (ATP), la biosynthèse des protéines et des acides nucléiques et la consommation d'oxygène peuvent toutes être surveillées pour estimer le nombre de cellules.

  1. À quoi sert une courbe d'étalonnage lors de l'estimation du nombre de cellules à partir de mesures de turbidité ?
  2. Quelles sont les nouvelles méthodes indirectes de comptage des cellules vivantes ?

Modèles alternatifs de division cellulaire

La fission binaire est le schéma de division cellulaire le plus courant chez les procaryotes, mais ce n'est pas le seul. D'autres mécanismes impliquent généralement une division asymétrique (comme dans le bourgeonnement) ou la production de spores dans les filaments aériens.

Chez certaines cyanobactéries, de nombreux nucléoïdes peuvent s'accumuler dans une cellule ronde agrandie ou le long d'un filament, conduisant à la génération de nombreuses nouvelles cellules à la fois. Les nouvelles cellules se séparent souvent du filament parent et flottent dans un processus appelé fragmentation (Figure (PageIndex<15>)). La fragmentation est couramment observée chez les Actinomycètes, un groupe de bactéries anaérobies à Gram positif que l'on trouve couramment dans le sol. Un autre exemple curieux de division cellulaire chez les procaryotes, rappelant la naissance vivante chez les animaux, est présenté par la bactérie géante Epulopiscium. Plusieurs cellules filles se développent complètement dans la cellule mère, qui finit par se désintégrer, libérant les nouvelles cellules dans l'environnement. D'autres espèces peuvent former une longue extension étroite à un pôle dans un processus appelé bourgeonnement. La pointe de l'extension gonfle et forme une cellule plus petite, le bourgeon qui finit par se détacher de la cellule mère. Le bourgeonnement est plus fréquent chez la levure (Figure (PageIndex<15>)), mais il est également observé chez les bactéries prothétiques et certaines cyanobactéries.

Figure (PageIndex<15>): (a) Les cyanobactéries filamenteuses, comme celles illustrées ici, se répliquent par fragmentation. (b) Sur cette micrographie électronique, des cellules de la bactérie Gemmata obscuriglobus sont en train de bourgeonnant. La cellule la plus grande est la cellule mère. Les étiquettes indiquent les nucléoïdes (N) et l'enveloppe nucléaire encore en formation (NE) de la cellule fille. (crédit a : modification du travail par CSIRO crédit b : modification du travail par Kuo-Chang Lee, Rick I Webb et John A Fuerst)

Les bactéries du sol Actinomyces se développent en longs filaments divisés par des septa, similaires aux mycéliums observés chez les champignons, ce qui donne de longues cellules avec plusieurs nucléoïdes. Les signaux environnementaux, probablement liés à la faible disponibilité des nutriments, conduisent à la formation de filaments aériens. Au sein de ces filaments aériens, des cellules allongées se divisent simultanément. Les nouvelles cellules, qui contiennent un seul nucléoïde, se développent en spores qui donnent naissance à de nouvelles colonies.

Identifiez au moins une différence entre fragmentation et bourgeonnement.

Biofilms

Dans la nature, les micro-organismes se développent principalement dans des biofilms, des écosystèmes complexes et dynamiques qui se forment sur une variété de surfaces environnementales, des conduites industrielles et des canalisations de traitement de l'eau aux roches du lit des rivières. Cependant, les biofilms ne se limitent pas aux substrats à surface solide. Presque toutes les surfaces dans un environnement liquide contenant des nutriments minimes finiront par développer un biofilm. Les tapis microbiens qui flottent sur l'eau, par exemple, sont des biofilms qui contiennent de grandes populations de micro-organismes photosynthétiques. Les biofilms trouvés dans la bouche humaine peuvent contenir des centaines d'espèces bactériennes. Quel que soit l'environnement dans lequel ils se produisent, les biofilms ne sont pas des collections aléatoires de micro-organismes, mais plutôt des communautés hautement structurées qui offrent un avantage sélectif à leurs micro-organismes constitutifs.

Structure du biofilm

Des observations utilisant la microscopie confocale ont montré que les conditions environnementales influencent la structure globale des biofilms. Les biofilms filamenteux appelés streamers se forment dans l'eau à écoulement rapide, tels que les ruisseaux d'eau douce, les tourbillons et les cellules d'écoulement de laboratoire spécialement conçues qui reproduisent les conditions de croissance dans les fluides en mouvement rapide. Les flûtes sont ancrées au substrat par un &ldquohead&rdquo et le &ldquotail&rdquo flotte en aval dans le courant. Dans les eaux calmes ou lentes, les biofilms prennent principalement la forme d'un champignon. La structure des biofilms peut également changer avec d'autres conditions environnementales telles que la disponibilité des nutriments.

Des observations détaillées de biofilms au laser confocal et au microscope électronique à balayage révèlent des amas de micro-organismes intégrés dans une matrice entrecoupée de canaux d'eau ouverts. La matrice extracellulaire est constituée de substances polymères extracellulaires (EPS) sécrétées par les organismes du biofilm. La matrice extracellulaire représente une grande partie du biofilm, représentant 50 % à 90 % de la masse sèche totale. Les propriétés du PSE varient en fonction des organismes résidents et des conditions environnementales.

L'EPS est un gel hydraté composé principalement de polysaccharides et contenant d'autres macromolécules telles que des protéines, des acides nucléiques et des lipides. Il joue un rôle clé dans le maintien de l'intégrité et de la fonction du biofilm. Les canaux dans l'EPS permettent le mouvement des nutriments, des déchets et des gaz à travers le biofilm. Cela maintient les cellules hydratées, empêchant la dessiccation. L'EPS protège également les organismes du biofilm de la prédation par d'autres microbes ou cellules (par exemple, les protozoaires, les globules blancs dans le corps humain).

Formation de biofilm

Les cellules microbiennes flottantes qui vivent dans un environnement aquatique sont appelées cellules planctoniques. La formation d'un biofilm implique essentiellement la fixation de cellules planctoniques à un substrat, où elles deviennent sessiles (fixées à une surface). Cela se produit par étapes, comme illustré dans la figure (PageIndex<16>). La première étape implique la fixation de cellules planctoniques à une surface recouverte d'un film de conditionnement de matière organique. À ce stade, l'attachement au substrat est réversible, mais à mesure que les cellules expriment de nouveaux phénotypes qui facilitent la formation d'EPS, elles passent d'un mode de vie planctonique à un mode de vie sessile. Le biofilm développe des structures caractéristiques, notamment une matrice étendue et des canaux d'eau. Les appendices tels que les fimbriae, les pili et les flagelles interagissent avec l'EPS, et la microscopie et l'analyse génétique suggèrent que de telles structures sont nécessaires à l'établissement d'un biofilm mature. Dans la dernière étape du cycle de vie du biofilm, les cellules à la périphérie du biofilm reviennent à un mode de vie planctonique, se détachant du biofilm mature pour coloniser de nouveaux sites. Cette étape est appelée dispersion.

Figure (PageIndex<16>) : Étapes de la formation et du cycle de vie d'un biofilm. (crédit : modification du travail par Public Library of Science et American Society for Microbiology)

Au sein d'un biofilm, différentes espèces de micro-organismes établissent des collaborations métaboliques dans lesquelles les déchets d'un organisme deviennent le nutriment d'un autre. Par exemple, les micro-organismes aérobies consomment de l'oxygène, créant des régions anaérobies qui favorisent la croissance des anaérobies. Cela se produit dans de nombreuses infections polymicrobiennes qui impliquent à la fois des agents pathogènes aérobies et anaérobies.

Le mécanisme par lequel les cellules d'un biofilm coordonnent leurs activités en réponse à des stimuli environnementaux est appelé quorum sensing. La détection de quorum qui peut se produire entre les cellules de différentes espèces au sein d'un biofilm et permet aux micro-organismes de détecter leur densité cellulaire grâce à la libération et à la liaison de petites molécules diffusibles appelées auto-inducteurs. Lorsque la population cellulaire atteint un seuil critique (un quorum), ces auto-inducteurs déclenchent une cascade de réactions qui activent des gènes associés à des fonctions cellulaires qui ne sont bénéfiques que lorsque la population atteint une densité critique. Par exemple, chez certains agents pathogènes, la synthèse des facteurs de virulence ne commence que lorsque suffisamment de cellules sont présentes pour submerger les défenses immunitaires de l'hôte. Bien que principalement étudié dans les populations bactériennes, le quorum sensing a lieu entre les bactéries et les eucaryotes et entre les cellules eucaryotes telles que le champignon Candida albicans, un membre commun du microbiote humain qui peut provoquer des infections chez les personnes immunodéprimées.

Les molécules de signalisation dans le quorum sensing appartiennent à deux classes principales. Les bactéries à Gram négatif communiquent principalement à l'aide de lactones d'homosérine N-acylées, tandis que les bactéries à Gram positif utilisent principalement de petits peptides (Figure (PageIndex<17>)). Dans tous les cas, la première étape du quorum sensing consiste en la liaison de l'auto-inducteur à son récepteur spécifique uniquement lorsqu'une concentration seuil de molécules de signalisation est atteinte. Une fois la liaison au récepteur effectuée, une cascade d'événements de signalisation entraîne des changements dans l'expression des gènes. Il en résulte l'activation de réponses biologiques liées au quorum sensing, notamment une augmentation de la production de molécules de signalisation elles-mêmes, d'où le terme d'autoinducteur.

Figure (PageIndex<17>) : les peptides courts chez les bactéries gram-positives et les lactones d'homosérine N-acétylées chez les bactéries gram-négatives agissent comme des auto-inducteurs dans la détection du quorum et médient la réponse coordonnée des cellules bactériennes. La chaîne latérale R de la lactone homosérine N-acétylée est spécifique de l'espèce de bactéries gram-négatives. Certaines lactones d'homosérine sécrétées sont reconnues par plus d'une espèce.

Biofilms et santé humaine

Le corps humain abrite de nombreux types de biofilms, certains bénéfiques et d'autres nocifs. Par exemple, les couches de microbiote normal qui tapissent les muqueuses intestinales et respiratoires jouent un rôle dans la prévention des infections par les agents pathogènes. Cependant, d'autres biofilms dans le corps peuvent avoir un effet néfaste sur la santé. Par exemple, la plaque qui se forme sur les dents est un biofilm qui peut contribuer aux maladies dentaires et parodontales. Des biofilms peuvent également se former dans les plaies, provoquant parfois des infections graves qui peuvent se propager. La bactérie Pseudomonas aeruginosa colonise souvent les biofilms dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose, provoquant des infections pulmonaires chroniques et parfois mortelles. Des biofilms peuvent également se former sur les dispositifs médicaux utilisés dans ou sur le corps, provoquant des infections chez les patients porteurs de cathéters à demeure, d'articulations artificielles ou de lentilles de contact.

Les agents pathogènes intégrés dans les biofilms présentent une résistance plus élevée aux antibiotiques que leurs homologues flottants. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer pourquoi. Les cellules des couches profondes d'un biofilm sont métaboliquement inactives et peuvent être moins sensibles à l'action des antibiotiques qui perturbent les activités métaboliques. L'EPS peut également ralentir la diffusion des antibiotiques et des antiseptiques, les empêchant d'atteindre les cellules dans les couches plus profondes du biofilm. Les changements phénotypiques peuvent également contribuer à la résistance accrue présentée par les cellules bactériennes dans les biofilms. Par exemple, la production accrue de pompes à efflux, des protéines intégrées à la membrane qui extrudent activement les antibiotiques hors des cellules bactériennes, s'est avérée être un mécanisme important de résistance aux antibiotiques chez les bactéries associées au biofilm. Enfin, les biofilms offrent un environnement idéal pour l'échange d'ADN extrachromosomique, qui comprend souvent des gènes qui confèrent une résistance aux antibiotiques.

  1. De quoi est composée la matrice d'un biofilm ?
  2. Quel est le rôle du quorum sensing dans un biofilm ?

Introduction

Des expériences complètes et bien reproduites sont à la base d'une science rigoureuse, mais les humains ne peuvent effectuer qu'un nombre limité d'actions simultanément. Une solution possible est l'automatisation, qui a été largement mise en œuvre en biotechnologie (Sparkes et al, 2010 Appleton et al, 2017 Freemont, 2019) pour faciliter les tâches de routine impliquées dans le séquençage de l'ADN (Meldrum, 2000), la synthèse chimique (Ley et al, 2015), la découverte de médicaments (Schneider, 2018) et la biologie moléculaire (Smanski et al, 2014). En principe, les robots programmables de manière flexible pourraient permettre diverses expériences nécessitant des conditions et reproduire des nombres au-delà des capacités des chercheurs humains dans un éventail de disciplines (Vasilev et al, 2011 Hans et al, 2018 Keller et al, 2019). Cependant, les logiciels existants pour les robots de manipulation de liquides se concentrent étroitement sur l'automatisation des protocoles conçus pour les pipettes à main, tandis que les langages de fonderie tels qu'Antha et les laboratoires distants tels qu'Emerald Cloud se concentrent sur l'automatisation des flux de travail plutôt que sur l'extension des limites expérimentales. En tant que tel, même les laboratoires dotés d'infrastructures à haut débit bien établies ont du mal à utiliser le plein potentiel de leurs robots, ce qui exclut de nombreuses expériences complexes qui nécessitent une programmation flexible (Appleton et al, 2017).

La bioautomatisation est à la traîne du domaine de la fabrication, où les robots sont censés être flexibles dans les tâches, réactifs aux nouvelles situations et interactifs avec les humains ou les systèmes de gestion à distance lorsque des situations ambiguës ou des erreurs surviennent (Appleton et al, 2017). Une limitation clé est l'absence d'un écosystème logiciel complet, convenablement abstrait et accessible (Bär et al, 2012 Linshiz et al, 2014 Walsh et al, 2019). Bien que la bioinformatique soit de plus en plus ouverte & source (Gentleman et al, 2004 coq et al, 2009), la bioautomatisation a mis du temps à adopter des pratiques clés telles que la modularité, le contrôle de version et la programmation asynchrone. Pour permettre une expérimentation flexible à haut débit, nous avons développé Pyhamilton, un package Python qui facilite les opérations à haut débit au sein du laboratoire, avec des protocoles qui peuvent être facilement partagés et modifiés. De plus, Pyhamilton permet aux robots de manipulation de liquides d'exécuter des méthodes auparavant inimaginables et de plus en plus impressionnantes. Avec ce package, les utilisateurs peuvent exécuter des simulations de robots pour dépanner et planifier des expériences, planifier des processus expérimentaux, mettre en œuvre une gestion des erreurs pour un dépannage rapide et intégrer facilement des robots à des équipements externes.


Protocole

1. Préparation des substrats de plaque d'essai multi-phénotype (MAP), des milieux de base, des milieux de pré-croissance et du tampon

Faire 50 ml de 1,0 - 1,25% de stocks de substrat.

Dissoudre 1,0 - 1,25% (w/v) de substrat solide dans de l'eau stérile (chauffer si nécessaire). Filtrez les solutions de stérilisation avec une unité de filtration de 0,22 µm et stockez les stocks à température ambiante. Des exemples de substrats utilisés dans ces expériences sont fournis dans Tableau 2.

Faire 250 ml de milieu de base 3x pour toutes les classes de substrat (carbone, azote, soufre et phosphore). Le milieu de base à base de MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonate) 22 contient les éléments suivants : 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4 % de glycérol*, 9,5 mM de NH4Cl*, 0,25 mM NaSO4*, 1,0 mM de MgSO4*, 1,32 mMK2HPO4*, 10 mM de KCl, 0,5 µM de CaCl2, 5 mM NaCl, 6 µM FeCl3, et 0,1 % (p/v) de L-arabinose** (Tableaux 1 et 2). Remarque : *Ces composés ne sont pas inclus en fonction du milieu de base. Par exemple, 0,4 % de glycérol n'est pas utilisé dans le milieu basal carboné et dans le milieu basal soufré 1,0 mM MgSO4 est remplacé par 1,0 mM de MgCl2. ** Le L-arabinose est spécifique de l'induction du vecteur promoteur pBAD, pEMB11, qui a été transformé en un ara - E. coli Souche K-12 (BW 27784) 23 .

Ajouter chaque composant du milieu de base dans un flacon stérile et amener la solution au volume. Bien mélanger. Avec une unité de filtration de 0,22 µm, stérilisez par filtre chaque média basal dans une bouteille stérile.

Préparez 500 ml de milieu de pré-croissance MOPS. Le milieu de pré-croissance à base de MOPS 22 contient les éléments suivants : 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4 % de glycérol, 9,5 mM de NH4Cl, 0,25 mM NaSO4, 1,0 mM de MgSO4, 1,32 mMK2HPO4, 10 mM de KCl, 0,5 µM de CaCl2, 5 mM de NaCl et 6 µM de FeCl3.

Ajouter chaque composant du milieu de pré-croissance dans un flacon stérile et porter au volume. Filtrez stérilisez avec une unité de filtration de 0,22 µm, puis ajoutez de l'ampicilline à une concentration finale de 100 µg/ml. Solution de stockage à 4 ଌ.

Faire 500 ml de 0,5x plaques de gélose Luria-Bertani (LB). Dans un flacon stérile, ajoutez des composants LB pour obtenir une concentration de 0,5x (1,25 g d'extrait de levure, 2,5 g de NaCl, 2,5 g de tryptone, 7,5 g d'agar). Bien mélanger et autoclaver pour stériliser.

Refroidir la gélose, puis ajouter 100 µg/ml d'antibiotique ampicilline en mélangeant. Verser

25 ml d'agar dans des boîtes de Pétri, laisser reposer et conserver à 4 ଌ jusqu'à utilisation.

Faire 250 ml de Tris 10 mM (pH 7,4) plus MgSO 10 mM4 solution tampon. Filtrez stérilisez avec une unité de filtration de 0,22 µm et stockez la solution à température ambiante.

2. Préparation de la suspension cellulaire bactérienne

Préparez des colonies fraîches. A partir d'un bouillon surgelé à 12,5% de glycérol, frais d'assiette E. coli clones sur gélose 0,5x LB contenant 100 µg/ml d'ampicilline. Incuber à 37 ଌ pendant 24 h.

Pipeter 3 ml de milieu de pré-croissance contenant 100 µg/ml d'ampicilline dans des tubes de culture. Pour chaque clone, utilisez des triples biologiques.

Inoculer des colonies indépendantes de la section 2.1 dans des tubes de culture préparés. Incuber à 37 &# x000b0C avec agitation pendant 22 h.

Pellet et lavage des cellules bactériennes :

Transférer les cultures O/N dans des tubes à centrifuger de 1,7 ml. Pellet cellules par centrifugation à vitesse maximale (16 900 x g) pendant 2 min dans une microcentrifugeuse. Décanter le surnageant et laver les cellules en le remettant en suspension dans 500 µl de 10 mM Tris/10 mM MgSO4 amortir. Répéter.

Ré-granuler les cellules, décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 ml de Tris 10 mM/10 mM MgSO4 amortir.

Mesurer la densité cellulaire et concentrer les cellules (si nécessaire) :

Diluer les cellules de la section 2.3.3 10 fois dans le Tris 10 mM/10 mM MgSO4 tampon et transférer cette dilution dans une cuvette. Mesurer la densité optique (OD600 nm) de cette dilution et enregistrer.

Concentrer les cellules pour obtenir une concentration finale de 0,07 (DO600 nm) dans les MAP (les cellules seront diluées 15 fois lorsqu'elles seront ajoutées aux MAP, les cellules doivent donc être à une concentration initiale de DO600 nm = 1,05). Transférer la suspension cellulaire concentrée dans un réservoir et enregistrer (à température ambiante) jusqu'à l'étape 3.5 de la préparation des MAP.

3. Préparation de plaques de dosage multi-phénotypes (MAP)

Étiquetez les MAP. Étiqueter des plaques de microtitrage à 96 puits stériles avec un E. coli numéro d'identification du clone et type de schéma MAP.

Aliquoter l'eau stérile dans les MAP. Transférer aseptiquement de l'eau stérile dans un réservoir de liquide. Pipeter 60 µl dans chaque puits de la plaque de micro-titrage à l'aide d'une pipette multicanaux.

Aliquoter les milieux de base dans les MAP. Transférer aseptiquement 3 fois le milieu basal dans un réservoir de liquide. Pipeter 50 µl dans chaque puits de la plaque de micro-titrage à l'aide d'une pipette multicanaux. Répétez les étapes 3.2 et 3.3 pour chaque média basal utilisé dans le schéma MAP.

Aliquoter les substrats dans les MAP. Transférer 30 µl de chaque substrat dans le puits approprié des MAP.

Ajouter une suspension bactérienne aux MAP. Transférer 10 &# x000b5l de cellules bactériennes de la section 2.4.2 dans chaque puits de la MAP à l'aide d'une pipette multicanaux. Changer les pointes avant de réintroduire la pipette dans le stock de culture.

Recouvrir les MAP d'un film adhésif. Recouvrir chaque plaque d'un seul film adhésif pour plaque. Appuyez fermement sur le film au-dessus des puits de la plaque et le long des bords pour créer un joint uniforme et étanche. Retirez l'excès de film sur les bords de la plaque de micro-titre avec une lame de rasoir stérile.

Mesurer la densité optique des MAP :

Placer les cartes préparées dans le manchon “Input” d'un lecteur de plaques de spectrophotomètre multi-plaques. Ouvrez le logiciel de lecture de plaques et créez un protocole qui mesure l'absorbance (DO600 nm) toutes les 30 min, pour un total de 32 h, avec 60 sec d'agitation entre les lectures.

Réglez la température dans l'appareil à 37 ଌ. Démarrer le protocole une fois que les MAP se sont équilibrées pour régler la température.

Après 32 heures, retirez les MAP du manchon “Output” du lecteur de plaques. Étiquetez chaque fichier texte de données pour inclure : E. coli le numéro d'identification du clone, la date d'exécution du MAP et le type de schéma du MAP.

4. Traitement et paramétrage des plaques de dosage multi-phénotypes (MAP)

Évaluer les courbes de croissance à l'aide d'un processus d'assurance qualité automatisé, par exemple., PMAnalyzer 24 .

Vérifiez que les courbes de croissance ont OD600 nm < 0,20 dans les 2 premières heures. Ne pas utiliser l'absorbance au point de temps initial (t0) dans le filtre en raison d'artefacts de condensation, qui se résolvent généralement à t1 (30 minutes).

Supprimez les courbes de croissance qui violent le filtre QA. Enregistrer les informations de la courbe (nom de l'échantillon, numéro de puits et OD600 nm valeurs) dans un fichier de sortie séparé pour référence future. Continuez l'analyse si la courbe de croissance passe le filtre QA.

Calculer les courbes de croissance médianes. En utilisant des données répliquées, par puits, calculez la courbe de croissance médiane en prenant la densité optique médiane (DO600 nm) valeur à chaque instant. Enregistrez les courbes de croissance médiane résultantes dans un fichier de sortie séparé pour une utilisation future.

Calculer le modèle logistique le mieux adapté pour chaque courbe de croissance en utilisant une adaptation de l'équation proposée par Zwietering 25 . L'équation logistique comprend trois paramètres décrivant la croissance bactérienne : le temps de latence, λ (h), le taux de croissance maximal, µmax (D.O.600 nm 100 -1 ), et le rendement final de la biomasse, α (OD600 nm). Utiliser les données au temps = 30 min (y1) comme valeur initiale due aux artefacts de condensation.

Calculez le taux de croissance maximum à l'aide d'une recherche directe. Enregistrez le plus grand taux de changement sur un intervalle de 90 minutes dans les données. ​

Estimez le rendement final de la biomasse en recherchant la valeur asymptotique supérieure de la plus grande moyenne mobile sur une fenêtre de 90 min. Plus précisément, définir comme l'asymptote de la courbe de croissance.

Utilisation du µmax et A valeurs de 4.3.1 et 4.3.2, trouvez la valeur λ en essayant toutes les valeurs λ :

Utilisez chaque valeur λ pour calculer une somme d'erreur au carré (SSE). Utilisez le SSE le plus bas est le SSE (λS) :

5. Analyse phénotypique des MAP

Calculer le niveau de croissance (GL) pour chaque courbe de croissance pour évaluer la croissance globale par clone par substrat. Définissez GL comme la moyenne harmonique des valeurs ajustées logistiques décalées :

Attribuez un phénotype à chaque courbe de croissance en fonction des valeurs GL. Ici, les quatre phénotypes utilisés sont : croissance attendue, absence de croissance, gain de fonction et perte de fonction.

Déterminer les phénotypes en comparant la croissance de tous les clones sur un substrat spécifique en termes d'écarts types par rapport à la moyenne. Utilisez cette statistique et un seuil de croissance minimum pour désigner le phénotype présenté par la courbe de croissance (Figure 1A,B). Figure 1C fournit des exemples d'attribution de phénotypes.

Définir la croissance comme GL ≥ 0,4 (Figure 1A,B). Définir le gain de fonction (Figure 1C, vert) comme ayant un GL > deux écarts types au-dessus de la moyenne et une moyenne > le seuil de croissance. Perte de fonction (Figure 1C, rouge) est défini comme ayant un GL < deux écarts types en dessous de la moyenne et une moyenne > le seuil de croissance.

Créez des représentations visuelles de l'ensemble de données en fonction des phénotypes et des courbes de croissance.

Visualiser la dynamique de croissance décrivant le DO600 nm valeurs comme couleur pour comparer rapidement les courbes de croissance entre plusieurs clones (Figure 2).

Affichez les distributions phénotypiques parmi tous les clones en fonction des conditions de croissance (figure 3).

6. Construire l'appareil de culture continue

Construction du port du réacteur (Figure 4A,B).Percez trois trous de 1/4 po, espacés de 3/4 po, dans le capuchon du réacteur à culture continue.

Pour le port α : vissez un support de panneau à filetage luer femelle à 1/16 po du bas du capuchon avec la pointe vers le haut, hors du capuchon. Fixez la cannelure avec un contre-écrou de montage sur panneau de 1/4 po.

Pour le port β : vissez un support de panneau à filetage Luer femelle sur une cannelure de 1/16 po avec la cannelure dirigée vers le haut, hors du capuchon. Fixez la cannelure avec un contre-écrou de montage sur panneau de 1/4 po.

Pour le port γ : vissez un support de panneau à filetage Luer femelle à 1/16 po du bas du capuchon de sorte que le canon pointe vers le haut, hors du capuchon. Fixez la cannelure avec un contre-écrou de montage sur panneau de 1/4 po. Vissez un Luer mâle avec bague de verrouillage intégrée sur un tuyau de 1/8 po de large au raccord cannelé à l'intérieur du capuchon.

Pour l'orifice de sortie : percez un trou de 5/16 po au niveau du repère 75 ml du réacteur de culture en continu. Coupez 3/4 po de l'extrémité de l'écrou du raccord de cloison cannelé de 1/4 po. Vissez le raccord de cloison cannelé de 1/4 po (le joint est à l'extérieur de la bouteille et l'écrou est à l'intérieur, Figure 4B).

Construction de port de biberon (Figure 4C). Percez deux trous de 1/4 po espacés de 1 po dans le bouchon du biberon.

Pour le port δ : vissez un support de panneau à filetage Luer femelle sur une cannelure de 1/8 po avec la cannelure dirigée vers le haut, hors du capuchon. Fixez la cannelure avec un contre-écrou de montage sur panneau de 1/4 po.

Pour le port ε : vissez un support de panneau à filetage Luer femelle sur une cannelure de 1/16 po avec la cannelure dirigée vers le haut, hors du capuchon. Fixez la cannelure avec un contre-écrou de montage sur panneau de 1/4 po.

Vissez un Luer mâle avec bague de verrouillage intégrée sur un tuyau de 1/8 po de large au raccord cannelé, à l'intérieur du capuchon.

Tubes d'alimentation et rallonges de tube :

Coupez deux morceaux de tube de 1 pouce (1/8 pouce de diamètre extérieur (OD) x 1/16 pouce de diamètre intérieur (DI)). Monter les pièces sur les ports α et γ du réacteur à culture continue réalisé à la section 5.2.

Coupez un seul morceau de tube de 1 po (1/4 po de diamètre extérieur x 1/8 po de diamètre intérieur). Monter la pièce sur le port Β du réacteur à culture continue.

Coupez un seul morceau de tube de 3,5 po (1/8 po de diamètre extérieur x 1/16 po de diamètre intérieur). Montez cette pièce à l'intérieur du port γ, sur le luer mâle avec bague de verrouillage intégrée sur un tuyau à alésage large de 1/8 po. Le port γ est le port d'échantillonnage du réacteur à culture continue.

Coupez un seul morceau de tube de 1 po (1/4 po de diamètre extérieur x 1/8 po de diamètre intérieur). Montez cette pièce sur le port δ du biberon.

Coupez un seul morceau de tube de 11 po (1/16 po de diamètre extérieur x 1/8 po de diamètre intérieur). Montez cette pièce à l'intérieur du port ε du biberon, sur le luer mâle avec bague de verrouillage intégrée au tuyau de 1/8 po de large.

Coupez deux morceaux de tube de 18 po (1/8 po de diamètre extérieur x 1/16 po de diamètre intérieur). Montez une pièce sur le port ε du biberon. Gardez l'autre pièce pour la section 7.

7. Exécution de cultures continues pour la métabolomique

Autoclaver les matières sèches pendant 30 min. Assurez-vous d'envelopper le bouchon du biberon fait dans la section 5 dans du papier d'aluminium. Gardez le tube attaché droit.

Envelopper le capuchon du réacteur de culture continue, réalisé dans la section 5, dans du papier aluminium. Gardez le tube attaché droit. Enveloppez le tube de 18 pouces coupé dans la section 6.3.5 et le plus petit adaptateur de tube de pompe péristaltique dans du papier d'aluminium. Gardez le tube droit. Autoclaver pendant 30 min.

Faire 2 L de bouillon 0,5x LB. Dans le biberon, préparez un bouillon 0,5x LB. Couvrir le biberon avec du papier d'aluminium. Autoclaver pendant 1h.

Faire 70 ml de bouillon 0,5x LB. Verser le bouillon dans le réacteur de culture en continu. Placer un barreau d'agitation dans le réacteur de culture en continu. Couvrir le réacteur avec du papier d'aluminium et autoclaver pendant 30 min.

A partir d'un bouillon surgelé à 12,5% de glycérol, frais d'assiette E. coli clones sur gélose 0,5x LB contenant 100 µg/ml d'ampicilline. Incuber à 37 ଌ pendant 24 h.

Inoculer une seule colonie dans 3 ml de bouillon 0,5x LB contenant 100 µg/ml d'ampicilline. Pour chaque clone, utilisez des triples biologiques. Incuber à 37 &# x000b0C avec agitation pendant 22 h.

Connectez les pièces ensemble.

Placez tous les matériaux autoclavés dans une enceinte de sécurité biologique et allumez la lumière ultraviolette pendant que le support refroidit. Une fois le milieu refroidi, ajouter 0,1% de L-arabinose et 100 µg/ml d'ampicilline à tout le bouillon 0,5x LB.

Déballer le bouchon du réacteur à culture continue et le visser sur le réacteur. Évitez de toucher le tube de prélèvement. Déballez le bouchon du biberon et vissez-le sur le biberon. Évitez de toucher le tube de prélèvement.

Gardez le tube de 18 pouces attaché au port ε stérile. Déballez la tubulure de 18 pouces et l'adaptateur de tubulure de pompe péristaltique.

Montez une extrémité libre du tube de 18 pouces sur une extrémité de l'adaptateur de tube de pompe péristaltique. Fixez l'autre extrémité de l'adaptateur de tube de pompe péristaltique au tube de 18 pouces fixé au port ε du bouchon du biberon.

Visser 0,22 unités de filtration µm sur les ports β et δ du réacteur de culture continue. Visser un bloc filtre 0,22 µm sur l'adaptateur du port α. À l'unité de filtre de 0,22 µm, installez l'extrémité libre du tube de 18 pouces.

Démarrez la culture continue.

Dans la hotte de biosécurité, inoculer le réacteur à culture continue avec 100 µl de culture O/N faite dans la section 7.2.1.1.

Fermer le système avant de déplacer la culture continue dans un incubateur à 37 ଌ. Dans l'incubateur, installez une plaque d'agitation magnétique et une mini pompe péristaltique.

Insérez l'adaptateur de tube de pompe péristaltique dans la pompe péristaltique. La tubulure du biberon commence du côté “In” et la tubulure menant au réacteur commence du côté “Out”.

Réglez la pompe péristaltique sur : �ST”. Démarrez la pompe péristaltique en passant à 𠇏ORWARD”. Vérifiez que le média commence à s'écouler dans la tubulure.

Placer le réacteur sur une plaque d'agitation magnétique et commencer à mélanger. Le réacteur à culture continue doit s'équilibrer pendant 24 heures avant l'échantillonnage.

Échantillonnage de la culture continue. Visser une seringue Luer Lok de 5 ml sur le port γ et extraire 4,5 ml de culture.

Utilisez 500 µl de la culture pour mesurer la densité (DO600 nm). Diluer les cellules pour faire 4 cultures de 1 ml à OD600 nm = 0.35.

Aliquoter les cultures diluées dans des tubes à centrifuger de 1,7 ml. Répéter l'échantillonnage toutes les 12 heures pendant 4 jours.

Préparer des échantillons pour GC-TOFMS :

Cellules à granulés par centrifugation à vitesse maximale (16 900 x g) pendant 2 min. Décanter le surnageant. Laver les cellules avec 500 &# x000b5l de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Répétez cette étape.

Décanter le surnageant une dernière fois, puis immerger les tubes de microcentrifugation avec des culots de cellules dans de l'azote liquide jusqu'à ce que les bulles s'arrêtent. Conservez les échantillons dans un congélateur à -80 ଌ.

8. Exécution de cultures par lots à passage en série pour la métabolomique

Préparation de la suspension cellulaire bactérienne. A partir d'un bouillon surgelé à 12,5% de glycérol, frais d'assiette E. coli clones sur gélose LB 0,5x contenant 100 µg/mlampicilline. Incuber à 37 ଌ pendant 24 h.

Inoculer des colonies individuelles dans 3 ml de bouillon 0,5x LB contenant 100 µg/mlampicilline. Utilisez des triples biologiques pour chaque clone.

Cultures par lots à passages en série.

Sous-culture O/N de 8.1.1 via une dilution de 500 fois dans 3 ml de bouillon LB contenant 50 µg/ml d'ampicilline et 0,1% de L-arabinose. La sous-culture doit avoir un OD600 nm < 0,005. Incuber à 37 ଌ en agitant.

Vérifier la densité optique (OD600 nm) à 2 et 2,5 h. Cultiver des cellules pour atteindre la DO600 nm = 0.35.

Subculture via une dilution 500 fois dans 3 ml de bouillon LB contenant 50 &# x000b5g/ml d'ampicilline et 0,1% de L-arabinose. La sous-culture doit avoir un OD600 nm < 0,005.

Vérifier la densité optique (OD600 nm) à 2 et 2,5 h. Cultiver des cellules pour atteindre la DO600 nm = 0.35.

Échantillonnage des cultures par lots à passages en série.

À l'aide de pinces stériles, placez un filtre à membrane de 0,22 µm au-dessus d'un collecteur de filtre. Aliquoter 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur le papier filtre, puis allumer la pompe à vide.

Répéter l'ajout de 1 ml de PBS. Transférer 1 ml de sous-culture de la section 8.2.3 sur le papier filtre. À partir de là, déplacez-vous rapidement pour transférer immédiatement les échantillons dans l'azote liquide. Terminez-le en 1 min.

Aliquoter 1 ml de PBS sur du papier filtre pour laver l'échantillon. Rincer rapidement sans renverser l'échantillon sur les côtés du papier filtre. Répéter.

À l'aide de pinces stériles, placez le filtre dans un tube à centrifuger de 1,7 ml en pliant soigneusement le filtre. Immerger le tube de microcentrifugeuse dans de l'azote liquide jusqu'à ce que les bulles s'arrêtent. Conservez l'échantillon dans un congélateur à -80 ଌ.

9. Analyse des métabolites & Traitement

Expédiez 3 échantillons par clone sur de la neige carbonique à une installation centrale de métabolomique pour le traitement, l'analyse et la normalisation des échantillons de GC-TOFMS.

Pour chaque échantillon, déterminez la moyenne, la médiane, l'écart type et le coefficient de variation entre les métabolites, en utilisant des données répétées.

Pour l'analyse statistique, codez manuellement un pipeline d'assurance qualité à l'aide d'instructions conditionnelles et d'exécutions répétitives 26 pour supprimer les métabolites qui ne respectent pas les conditions définies.

Pour la condition 1, supprimer les métabolites dans lesquels plus de 2 échantillons ont une abondance nulle. Supprimer les étalons internes des profils métabolomiques.

Pour la condition 2, supprimez les métabolites qui ne se trouvent pas dans les cellules d'intérêt. Ici, supprimez les métabolites suivants : acétate d'indole 3, acide dihydroabiétique, acide nonadécanoïque, acide salicylique, salicylaldéhyde, cholestérol, phénol, 1-monostéarine, octadécanol, 1-monopalmitine, dodécane, dodécanol, 1-hexadécanol, 5-méthoxytryptamine, acide benzoïque , acide pentadécanoïque, acide phosphorique, acide pélargonique, acide palmitique, acide caprique, hydroxylamine, acide stéarique, acide myristique, maléimide, lévoglucosan et acide 4-hydroxybutyrique.

Pour la condition 3, supprimez les métabolites dont le coefficient de variation est supérieur à 1.

Capturez les effets métabolomiques mondiaux en examinant les abondances relatives des métabolites.

Créez une représentation visuelle de l'abondance médiane des métabolites par clone pour chaque métabolite (Figure 6).

Identifiez les valeurs aberrantes en observant les fréquences des paires clones-métabolites.

Calculez le score Z pour chaque valeur médiane de chaque métabolite dans un clone. Calculez les scores z à l'aide de l'équation suivante :

[7] ​Remarque : Terme XMC représente le niveau d'abondance d'un métabolite spécifique pour un clone spécifique. Terme µC représente la moyenne de tous les clones pour un métabolite spécifique. Terme σC est l'écart type associé.

Créez une représentation visuelle des données dans laquelle les valeurs aberrantes sont mises en évidence (données non fournies).


Contenu

Loi Bouguer-Lambert Modifier

Les racines du terme absorbance se trouvent dans le loi de Bouguer (loi Bouguer-Lambert). Au fur et à mesure que la lumière se déplace à travers un média, elle deviendra plus faible au fur et à mesure qu'elle s'éteint. Bouguer a reconnu que cette extinction (maintenant souvent appelée atténuation) n'était pas linéaire avec la distance parcourue à travers le milieu, mais liée par ce que nous appelons maintenant une fonction exponentielle. Si I 0 > est l'intensité de la lumière au début du trajet et I s > est l'intensité de la lumière détectée après parcours d'une distance d , la fraction transmise, T , est donnée par : T = I s I 0 = exp ( − μ d ) < style d'affichage T=>>>=exp(-mu d)> , où μ est appelé constante d'atténuation (terme utilisé dans divers domaines où un signal est transmis via un support) ou coefficient. La quantité de lumière transmise diminue de façon exponentielle avec la distance. En prenant le logarithme napierien (naturel) dans l'équation ci-dessus, on obtient : − l n ( T ) = l n I 0 I s = μ d ><>>>=mu d> . Pour les milieux de diffusion, la constante est souvent divisée en deux parties, μ = μ s + μ a +mu _> , le séparant en un coefficient de diffusion, μ s > , et un coefficient d'absorption, μ a , [3] obtenant : − ln ( T ) = ln I 0 I s = ( μ s + μ a ) d ><>>>=(mu _+mu _)d> .

La loi de la bière avec des échantillons non diffusants Modifier

Au sein d'un milieu homogène tel qu'une solution, il n'y a pas de dispersion. Pour ce cas, largement étudié par August Beer, la concentration de l'espèce absorbante suit la même réponse linéaire que la longueur du trajet. De plus, les contributions des espèces absorbantes individuelles sont additives. C'est une situation très favorable, et fait de l'absorbance comme mesure d'absorption de loin préférable à la fraction d'absorption (absorbance). C'est le cas pour lequel le terme "absorbance" a été utilisé pour la première fois.

Absorbance pour les échantillons de diffusion Modifier

Même si cette fonction d'absorbance est très utile avec les échantillons diffusants, la fonction n'a pas les mêmes caractéristiques souhaitables que pour les échantillons non diffusants. Il existe cependant une propriété appelée pouvoir absorbant qui peut être estimée pour ces échantillons. Le pouvoir absorbant d'une seule unité d'épaisseur de matériau constituant un échantillon diffusant est le même que l'absorbance de la même épaisseur de matériau en l'absence de diffusion. [5]

Optique Modifier

En optique, absorbance ou absorbance décadaire est le logarithme commun du rapport entre l'incident et transmis puissance rayonnante à travers un matériau, et absorbance spectrale ou absorbance spectrale décadaire est le logarithme commun du rapport d'incident à transmis puissance spectrale de rayonnement à travers un matériau. L'absorbance est sans dimension, et en particulier n'est pas une longueur, bien qu'il s'agisse d'une fonction croissante monotone de la longueur du trajet, et s'approche de zéro lorsque la longueur du trajet s'approche de zéro. L'utilisation du terme "densité optique" pour l'absorbance est déconseillée.

Absorbance d'un matériau Modifier

Les absorbance d'un matériau, noté UNE, est donnée par [1]

L'absorbance est une grandeur sans dimension. Néanmoins, le unité d'absorbance ou UA est couramment utilisé dans la spectroscopie ultraviolet-visible et ses applications de chromatographie liquide haute performance, souvent dans des unités dérivées telles que l'unité milli-absorbance (mAU) ou milli-absorbance unit-minute (mAU × min), une unité d'absorbance intégrée sur temps. [6]

L'absorbance est liée à la profondeur optique par

?? est la profondeur optique.

Absorbance spectrale Modifier

Absorbance spectrale en fréquence et absorbance spectrale en longueur d'onde d'un matériau, noté UNE?? et UNE?? respectivement, sont donnés par [1]

??e,ν t est le flux radiant spectral en fréquence transmis par ce matériau,e,ν i est le flux radiant spectral en fréquence reçu par ce matériau, T?? est la transmittance spectrale en fréquence de ce matériau,e,λ t est le flux radiant spectral en longueur d'onde transmis par ce matériau,e,λ i est le flux radiant spectral en longueur d'onde reçu par ce matériau, T?? est la transmittance spectrale en longueur d'onde de ce matériau.

L'absorbance spectrale est liée à la profondeur optique spectrale par

???? est la profondeur optique spectrale en fréquence, ???? est la profondeur optique spectrale en longueur d'onde.

Bien que l'absorbance soit proprement sans unité, elle est parfois rapportée en "unités d'absorbance", ou AU. De nombreuses personnes, y compris des chercheurs scientifiques, expriment à tort les résultats des expériences de mesure d'absorbance en fonction de ces unités composées. [7]

Atténuation Modifier

L'absorbance est un nombre qui mesure la atténuation de la puissance rayonnante transmise dans un matériau. L'atténuation peut être causée par le processus physique d'« absorption », mais aussi par la réflexion, la diffusion et d'autres processus physiques. L'absorbance d'un matériau est approximativement égale à sa atténuation [ éclaircissements nécessaires ] lorsque l'absorbance est bien inférieure à 1 et que l'émittance de ce matériau (à ne pas confondre avec l'exitance ou l'émissivité radiante) est bien inférieure à l'absorbance. En effet,

??e t est la puissance rayonnante transmise par ce matériau,e att est la puissance radiante atténuée par ce matériau,e i est la puissance rayonnante reçue par ce matériau,e e est la puissance rayonnante émise par ce matériau,

T =e t /Φe i est le facteur de transmission de ce matériau, ATT = Φe att /Φe je suis le atténuation de ce matériau, E =e e /Φe i est l'émittance de ce matériau,

et selon la loi de Beer-Lambert, T = 10 −A , donc

Coefficient d'atténuation Modifier

L'absorbance d'un matériau est également liée à sa coefficient d'atténuation décadaire par

je est l'épaisseur du matériau traversé par la lumière, une(z) est le coefficient d'atténuation décadaire de ce matériau à z.

Si une(z) est uniforme le long du trajet, l'atténuation est dite atténuation linéaire, et la relation devient

Parfois, la relation est donnée en utilisant le coefficient d'atténuation molaire du matériau, c'est-à-dire son coefficient d'atténuation divisé par sa concentration molaire :

?? est le coefficient d'atténuation molaire de ce matériau, c(z) est la concentration molaire de ce matériau à z.

Si c(z) est uniforme le long du chemin, la relation devient

L'utilisation du terme « absorptivité molaire » pour le coefficient d'atténuation molaire est déconseillée. [1]

Mesures logarithmiques vs mesures directement proportionnelles Modifier

La quantité de lumière transmise à travers un matériau diminue de façon exponentielle au fur et à mesure qu'elle traverse le matériau, selon la loi de Beer-Lambert (A=(ε)(l)). Puisque l'absorbance d'un échantillon est mesurée sous forme de logarithme, elle est directement proportionnelle à l'épaisseur de l'échantillon et à la concentration du matériau absorbant dans l'échantillon. Certaines autres mesures liées à l'absorption, telles que la transmittance, sont mesurées sous la forme d'un simple rapport de sorte qu'elles varient de manière exponentielle avec l'épaisseur et la concentration du matériau.

Absorbance : −log10e t /Φe je ) Transmission : Φe t /Φe je
0 1
0.1 0.79
0.25 0.56
0.5 0.32
0.75 0.18
0.9 0.13
1 0.1
2 0.01
3 0.001

Plage de mesure de l'instrument Modifier

Tout instrument de mesure réel a une plage limitée sur laquelle il peut mesurer avec précision l'absorbance. Un instrument doit être étalonné et vérifié par rapport à des normes connues pour que les lectures soient fiables. De nombreux instruments deviendront non linéaires (ne respecteront pas la loi de Beer-Lambert) à partir d'environ 2 UA (

1 % de transmission). Il est également difficile de mesurer avec précision de très petites valeurs d'absorbance (inférieures à 10 -4 ) avec des instruments disponibles dans le commerce pour l'analyse chimique. Dans de tels cas, les techniques d'absorption laser peuvent être utilisées, car elles ont démontré des limites de détection qui remplacent celles obtenues par les instruments conventionnels non laser de plusieurs ordres de grandeur (les détections ont été démontrées jusqu'à 5 × 10 − 13).La meilleure précision théorique pour la plupart des instruments non laser disponibles dans le commerce est atteinte dans la plage proche de 1 UA. La longueur du trajet ou la concentration doit ensuite, dans la mesure du possible, être ajustée pour obtenir des lectures proches de cette plage.

Méthode de mesure Modifier

Typiquement, l'absorbance d'une substance dissoute est mesurée en utilisant la spectroscopie d'absorption. Cela implique de faire passer une lumière à travers une solution et d'enregistrer la quantité de lumière et les longueurs d'onde transmises sur un détecteur. En utilisant ces informations, les longueurs d'onde qui ont été absorbées peuvent être déterminées. [8] Premièrement, les mesures sur un « blanc » sont prises en utilisant uniquement le solvant à des fins de référence. C'est ainsi que l'absorbance du solvant est connue, puis tout changement d'absorbance lors de la mesure de la solution entière est effectué uniquement par le soluté d'intérêt. Ensuite, des mesures de la solution sont prises. Le flux radiant spectral transmis qui traverse l'échantillon de solution est mesuré et comparé au flux radiant spectral incident. Comme indiqué ci-dessus, l'absorbance spectrale à une longueur d'onde donnée est

Le spectre d'absorbance est tracé sur un graphique d'absorbance en fonction de la longueur d'onde. [9]

Un spectrophotomètre UV-Vis fera tout cela automatiquement. Pour utiliser cette machine, les solutions sont placées dans une petite cuvette et insérées dans le support. La machine est contrôlée par un ordinateur et, une fois qu'elle a été "vidée", affiche automatiquement l'absorbance tracée en fonction de la longueur d'onde. L'obtention du spectre d'absorbance d'une solution est utile pour déterminer la concentration de cette solution à l'aide de la loi de Beer-Lambert et est utilisée en HPLC.

Certains filtres, notamment le verre de soudage, sont classés par numéro de teinte (SN), qui est 7/3 fois l'absorbance plus un : [10]

Par exemple, si le filtre a une transmittance de 0,1% (0,001 transmittance, ce qui correspond à 3 unités d'absorbance), son numéro de teinte serait 8.


Utiliser un spectrophotomètre pour déterminer la croissance des algues ?

J'essaie de déterminer l'effet des engrais sur la croissance des algues dans l'eau du bassin. Je veux utiliser un spectrophotomètre pour obtenir des données quantitatives sur la quantité d'algues qui finit par pousser. Je continue de constater que vous POUVEZ utiliser la spectrophotométrie pour déterminer la concentration, mais que vous ne pouvez pas trouver COMMENT le faire. Je me rends compte que cela a quelque chose à voir avec l'absorption de la chorophylle A, mais je suis complètement confus quant à ce que je fais réellement. Tout conseil sur la façon dont je peux le faire, ou même si cela fonctionnera, serait très apprécié!

Si vous connaissez les molécules des algues, vous pouvez regarder leurs spectres d'absorption, la chlorophylle a pour référence. Vous utilisez le photomètre pour mesurer l'extinction de la lumière par rapport à une référence (généralement la solution simple sans rien dedans), vous pouvez mesurer la concentration de chlorophylle selon la loi de Lamert-beers : E(Extinction) = (coefficient d'extinction) * d (épaisseur de la solution à travers laquelle vous faites passer la lumière) * c (concentration). par exemple. le coefficient pour la chlorophylle a est de 88,15 dans 100 % d'acétone ou de 87,67 dans 90 % d'acétone. Le problème avec votre plan, comme je le vois, c'est qu'il y a beaucoup de molécules qui absorberont la lumière dans les algues vivantes, je pense que si vous isolez la chlorophylle a (ou toute autre molécule spécifiquement absorbante) auparavant, vous pouvez obtenir des résultats complets .

Juste pour clarifier, ce qui est important n'est pas la valeur réelle de l'extinction mesurée, mais l'extinction mesurée après comparée à celle que vous avez mesurée pour la pré-croissance des algues.

Pensez à la façon dont la spectrophotométrie utilise la lumière pour déterminer la concentration d'un produit chimique donné. Quelle est la relation entre la longueur d'onde et votre analyte ? Quelles propriétés de la lumière permettent d'identifier un produit chimique en solution ? Qu'indique l'absorbance une fois que vous avez effectué l'analyse ? Quelle équation pourriez-vous utiliser pour tracer votre courbe standard ? Votre manuel de chimie devrait contenir des informations sur la théorie derrière la spectrophotométrie, vous devriez donc le lire. Peut-être aussi rechercher quelques protocoles pour avoir une idée de la façon dont le processus fonctionne - l'EPA en a beaucoup de bons pour les analytes courants qui sont accessibles au public. Parlez ensuite à votre professeur pour obtenir de l'aide sur l'utilisation réelle de l'instrument. Je ne sais pas comment fonctionne le vôtre, mais dans mon université, nous devions obtenir un "permis de conduire" pour utiliser l'un des équipements les plus chers, ce qui nécessitait des cours et un test d'un TA.

Vous découvrirez peut-être également qu'il est plus facile de regarder la chlorophylle à l'aide d'un instrument différent. Je pouvais voir votre idée fonctionner avec un spectrophotomètre UV-visuel (UV-vis) ou un spectromètre de masse à chromatographe en phase gazeuse (GCMS). Avec l'UV-vis, vous devrez extraire la chlorophylle et l'isoler avant de pouvoir l'analyser, ce qui peut nécessiter des réactifs coûteux ou dangereux, des étapes fastidieuses et un chagrin d'amour lorsque quelque chose ne va pas inévitablement et que vous devez refaire tout ça. Avec un GCMS, vous n'avez pas à vous soucier des autres déchets dans votre solvant, et il devrait déjà exister un programme pour examiner la chlorophylle.


Présentation de la discussion

Le Dr Malte Paulsen donne une introduction à la cytométrie en flux avec une excellente explication des principes de base régissant la technique. Il explique comment le flux de fluide est utilisé pour focaliser un échantillon dans un faisceau laser. La lumière du laser est diffusée par les cellules de l'échantillon et le degré de diffusion fournit des informations sur la densité optique de la cellule et d'autres caractéristiques. Dans la cytométrie en flux conventionnelle, les lasers sont principalement utilisés pour exciter des anticorps fluorescents liés à des types cellulaires spécifiques. Un détecteur avec différents filtres permet de disséquer des longueurs d'onde spécifiques de la fluorescence globale. Ce signal peut ensuite être affiché de manière à fournir le plus d'informations sur le type de cellule d'intérêt.


Développement d'une méthode à haut débit pour évaluer l'impact des composés inhibiteurs des hydrolysats lignocellulosiques sur la croissance des Zymomonas mobilis

Surmonter les effets de la toxicité des hydrolysats vis-à-vis des éthanologènes est un obstacle technique clé dans le processus de conversion biochimique des matières premières de la biomasse en éthanol. Malgré son importance, la complexité des phénomènes de toxicité des hydrolysats et le manque d'études, d'analyses et d'outils systématiques entourant cette question ont bloqué une compréhension complète des relations impliquant des composés toxiques dans les hydrolysats et leurs effets sur la croissance et la fermentation de l'éthanologène. Dans cette étude, nous avons développé un essai de croissance biologique quantitatif à haut débit à l'aide d'un turbidomètre automatisé pour obtenir une cinétique d'inhibition détaillée pour les composés individuels présents dans l'hydrolysat de biomasse lignocellulosique. Des informations sur le temps de latence prolongé et les densités cellulaires finales peuvent également être obtenues. Les effets du furfural, de l'hydroxyméthylfurfural (HMF), de l'acétate et de l'éthanol sur le taux de croissance et les densités cellulaires finales de Zymomonas mobilis 8b sur le glucose sont présentés. Cette méthode s'est également avérée utile dans les études de toxicité de l'hydrolysat lui-même, malgré la nature très colorée de ce matériau. En utilisant cette approche, nous pouvons générer des profils inhibiteurs complets avec de nombreux composés individuels et développer des modèles qui prédisent et examinent les effets toxiques dans le mélange complexe d'hydrolysats, conduisant au développement de processus de prétraitement et de conditionnement améliorés ainsi que d'organismes de fermentation.


De multiples mesures optiques révèlent l'activation cellulaire unique sans agent de contraste

Nicolas Pavillon (professeur adjoint), Nicholas I. Smith (professeur agrégé, Immunology Frontier Research Center, Université d'Osaka) et leurs collaborateurs ont développé une plate-forme de microscopie multimodale sans marquage qui permet l'étude non invasive de préparations cellulaires sans avoir besoin de produits chimiques supplémentaires ou agent de contraste. Les paramètres extraits de ces mesures, couplés à des algorithmes machine, permettent l'étude de processus cellulaires fins tels que l'activation des cellules macrophages lors de l'exposition au lipopolysaccharide (LPS). Les auteurs démontrent que l'activation, ainsi que l'inhibition de l'activation partielle, peuvent être observées au niveau d'une cellule unique grâce à la caractérisation phénotypique et moléculaire uniquement par des moyens optiques non invasifs.

Les mesures optiques sans marquage sont devenues populaires grâce à leur capacité à observer des échantillons de manière non invasive. Des techniques telles que la microscopie de phase quantitative ou la spectroscopie Raman, telles qu'utilisées dans cette étude, ont été largement utilisées ces dernières années pour caractériser des spécimens et identifier des cellules d'origines différentes. Cependant, la spécificité de ces approches ne permet généralement que la discrimination des types cellulaires. Le groupe montre dans cette étude que des processus fins tels que l'activation des macrophages au sein de populations de cellules identiques sont également possibles.


Juste au moment où vous pensiez que tout avait un sens…

Un mot d'avertissement cependant, étant donné que la DO d'un échantillon dépend de la taille et de la forme des particules qu'il contient, différentes lignées cellulaires peuvent avoir des relations complètement différentes entre la DO et les cellules/mL. Cela signifie qu'un étalonnage séparé sera nécessaire pour chaque type de cellule que vous utilisez, ce qui est fastidieux, mais mieux que d'enregistrer des nombres insignifiants et arbitraires dans votre livre de laboratoire.

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17 commentaires

Je suis un amateur de microbiologie, s'il vous plaît laissez-moi préciser la relation entre le od et le nombre de cellules car je travaille avec de la levure, alors quel devrait être le od correct de la culture pendant la nuit afin d'obtenir un bon nombre de colonies sur une plaque , ma deuxième question est ce qui devrait être od de la culture si nous sommes censés faire de la transformation, veuillez expliquer cela

Bravo, c'est très instructif et clair pour moi.

Oh génial!
Donc, faire des cellules compétentes, que plusieurs protocoles mentionnent, ne doivent pas être cultivées au-delà de OD600 = 0,4 est un travail assez délicat.

Article très impressionnant. Je suis nouveau en microbiologie et j'aimerais demander l'étalonnage pour la mesure OD600. Les résultats du calibrage varieront-ils entre les différents stades de croissance ? (Par exemple, la valeur de CFU/ml en phase de latence ou de journalisation sera-t-elle différente lorsque la valeur OD600 est ajustée à la même valeur ?) Merci.

oui, ce sera différent, car dans la phase stationnaire, certaines cellules seront déjà mortes, comme il est écrit dans l'article. Ainsi, l'OD600 sera plus élevé, mais le CFU sera plus faible.

Cela signifie que des échantillons similaires donneront des valeurs de DO complètement différentes dans différentes spécifications en raison des spécifications ayant des ampoules différentes, ou même dans la même spécification au fil du temps, car l'intensité du faisceau diminue avec l'âge de l'ampoule.

OD600 est certainement une valeur de merde qui ne devrait pas être utilisée/publiée telle qu'elle est, mais votre explication quant à la raison pour laquelle il en est ainsi est complètement incorrecte. Cela n'a rien à voir avec l'ampoule/monochromateur/etc – pour cela, il y a une valeur à blanc qui doit être prise et un étalonnage interne qui assure une réponse linéaire par rapport à la lumière entrante. Une fois ces deux éléments terminés, tous les spectrophotomètres donneront la même lecture pour les échantillons *absorbants*. Mais ce que l'on mesure avec OD600 n'est pas de l'absorbance, c'est de la diffusion !

Voici donc une explication correcte : la DO600, en tant que mesure de la concentration cellulaire, repose sur la diffusion de la lumière. Une partie de la lumière est "perdue" car la lumière diffusée se déplace maintenant dans toutes les directions. Donc, ce qui arrive au photomultiplicateur a deux composants : A1+A2 où A1 est la quantité de lumière qui n'a pas été diffusée (fonction de la concentration cellulaire) et A2 est une certaine proportion de lumière diffusée qui l'a encore fait (lumière diffusée provenant d'une fente dans le porte-cuve se trouve à peu près un cône de lumière). C'est A2 qui est variable d'une spécification à l'autre car il dépend de la géométrie de la spécification : les tailles de la fente dans le support de cuvette et le photomultiplicateur, ainsi que la distance de la cuvette au photomultiplicateur (plus elle est proche, plus la lumière diffusée sera être enregistré par erreur comme non diffusé, réduisant ainsi la valeur OD600).

Mais oui, bien sûr, quand cela compte, il faut prendre la courbe d'étalonnage - non seulement la DO600 n'est pas une fonction linéaire de la concentration cellulaire, mais différentes cellules se dispersent différemment. (Par exemple, les cellules avec des corps d'inclusion semblent se disperser beaucoup plus de souches/espèces différentes peuvent se disperser différemment, etc.).


Voir la vidéo: Tiheyden määrittäminen (Novembre 2021).