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Lors de la soustraction du fond d'une image Western blot, la méthode de soustraction du signal de fond doit-elle être la même pour tous les blots analysés ?


J'analyse des images Western blot et je souhaite soustraire le signal de fond pour mes bandes de protéines d'intérêt. Auparavant, la façon dont je soustrayais l'arrière-plan consistait à dessiner un rectangle (c'était la même zone que le rectangle décrivant ma bande de protéines d'intérêt) en haut de chaque voie, et à soustraire la densité intégrée de ce rectangle d'arrière-plan de la densité intégrée de ma bande de protéines.

Cependant, j'ai lu un article sur les différentes méthodes de soustraction de l'arrière-plan d'une image Western Blot. Dans l'article, il est indiqué: "La zone (généralement un rectangle) utilisée pour la soustraction de fond est généralement placée au-dessus ou en dessous ou est une moyenne de l'intensité de la zone au-dessus ou en dessous de la bande d'intérêt".

Cependant, pour un transfert que j'ai, l'arrière-plan dans la zone en dessous de mes bandes de protéines cibles est beaucoup plus élevé que l'arrière-plan dans la zone au-dessus des bandes.

Pour ce transfert, j'envisage de dessiner 2 rectangles d'arrière-plan, un au-dessus et en dessous des bandes de protéines, et de prendre la moyenne de leur densité intégrée.

Je pense que cette méthode me donnerait une mesure plus précise de l'arrière-plan par rapport au dessin d'un seul rectangle en haut de la voie.

Étant donné que je n'ai que ce problème d'arrière-plan inégal (où l'arrière-plan est beaucoup plus haut dans la moitié inférieure de la tache par rapport au haut) pour une image de tache, je ne pense pas qu'il serait nécessaire d'utiliser deux rectangles d'arrière-plan pour les autres taches .

J'analyse des images de nombreuses taches, où j'ai marqué pour une variété de protéines. Je me demande si la façon dont je soustrait l'arrière-plan de chaque image de tache doit être la même? Ou est-il possible d'utiliser différentes méthodes de soustraction d'arrière-plan en fonction de la situation d'arrière-plan unique pour chaque tache ?

Toutes les idées sont appréciées.


Western blot à résolution cellulaire unique

Ce protocole décrit comment effectuer un transfert western sur des cellules individuelles pour mesurer la variation de cellule à cellule des niveaux d'expression des protéines et de l'état des protéines. Comme le western blot conventionnel, le western blot unicellulaire (scWB) est particulièrement utile pour les cibles protéiques dépourvues d'anticorps sélectifs (par exemple, les isoformes) et dans les cas où le signal de fond des cellules intactes est source de confusion. scWB est réalisée sur un microdispositif qui comprend un réseau de micropuits moulés dans une fine couche d'un gel de polyacrylamide (PAG). La couche de gel fonctionne à la fois comme une matrice de tamisage moléculaire pendant la PAGE et comme un échafaudage de buvardage pendant le sondage immunologique. scWB implique cinq étapes principales : (i) décantation par gravité des cellules dans les micropuits (ii) lyse chimique des cellules dans chaque micropuits (iii) PAGE de chaque lysat unicellulaire (iv) exposition du gel à la lumière UV pour éponger (immobiliser) des protéines à la matrice de gel et (v) une immunosondage dans le gel des protéines immobilisées. Le multiplexage peut être réalisé en sondant avec des cocktails d'anticorps et en utilisant des techniques de décapage/resondage d'anticorps, permettant la détection de plus de 10 protéines dans chaque cellule. Nous décrivons également la fabrication de microdispositifs pour les microgels uniformes et à gradient de pores. Pour étendre l'immunoprobing in-gel aux gels de petite taille de pores, nous décrivons un protocole de dé-réticulation de gel facultatif pour une introduction plus efficace des anticorps dans la couche de gel. Une fois le microdispositif fabriqué, le test peut être effectué en 4 à 6 heures par des novices en microfluidique et il génère des données multiplexées à haute sélectivité à partir de cellules individuelles. La technique est pertinente lorsque la mesure directe des protéines dans des cellules individuelles est nécessaire, avec des applications allant des biosciences fondamentales à la biomédecine appliquée.


Comment quantifier les Western Blots ?

J'ai utilisé ImageJ pour obtenir la zone grise moyenne en utilisant une zone fixe pour chaque protéine d'intérêt, j'ai soustrait le fond, puis je l'ai rapporté en tant que rapport à mon contrôle de charge.

Ma question est - comment feriez-vous? En regardant les bandes, il y a plus d'une différence de 2 fois entre les échantillons traités et non traités, mais cela ne se reflète pas dans les données. Cela montre la tendance, mais je ne pense pas que cela montre aux lecteurs tout ce qu'ils ne pouvaient pas voir en regardant simplement les groupes eux-mêmes.

J'ai parcouru le protocole que tu as posté. Je ne comprends pas pourquoi tu fais comme ça. ImageJ dispose d'un outil de quantification de bande de gel intégré.

Allez dans Analyser --> Gels --> Sélectionnez la première voie (puis utilisez ctrl + 2 pour sélectionner toutes les autres voies et ctrl + 3 pour tracer les données). Cela fait automatiquement ce que dit la partie du protocole que vous avez publié, à savoir qu'il force la boîte que vous utilisez pour sélectionner les données à rester à une taille fixe.

Lorsque les tracés de signal apparaissent, vous pouvez définir la ligne de base et mesurer la zone sous la courbe (qui consiste essentiellement à soustraire l'arrière-plan). Cela vous donnera également des informations si votre tache est surexposée (ce qui est probablement le cas en la regardant), car vous obtiendrez un "sommet plat" sur votre courbe d'intensité plutôt qu'un pic pointu.

Hé, merci pour ta réponse rapide !

J'ai fait ce que vous avez dit (re: analyze->gels) mais j'obtiens juste 10 du même complot qui ressemble à ceci - https://imgur.com/detePpq

Comment faire ce que vous décrivez dans votre 3ème paragraphe ?

J'ai fait la zone sous la courbe pour chaque bande dans l'image J, c'est peut-être la même chose que vous avez fait. En outre, il se peut que, puisque votre tache est surexposée, vous commenciez à stabiliser votre bande plus abondante et perdiez la capacité de quantifier avec précision.

Avez-vous un guide/protocole pour ce processus ? J'adore l'essayer

Première chose que j'ai remarquée - À moins que je ne lise mal ceci, il n'y a AUCUN moyen que D3 ne soit qu'un double changement (ou peut-être qu'il est plus proche de 3 fois, mais c'est difficile à dire avec la façon dont vous avez présenté les données). La différence entre ces bandes semble tellement plus grande que D7. Deux choses:

1 - Les bandes plus intenses semblent saturées, vous devriez essayer une exposition plus courte pour la quantification. C'est la raison pour laquelle je suis passé de la chimiluminescence à la fluorescence, notamment pour la quantification.

2 - Je me demande si vous avez fait quelque chose de différent dans l'analyse. C'est le guide que j'ai utilisé dans le passé pour ImageJ et les taches chimiluminescentes

La normalisation à la GAPDH est bonne.

Chaque fois que je souhaite quantifier une protéine au moins quelque peu abondante, j'utilise des western blots fluorescents avec le système LICOR Odyssey. Je ne peux pas le recommander assez si vous avez accès, et si vous le faites, je serais heureux de vous dire tout à ce sujet.

Quant à savoir si cette analyse est nécessaire ou non, je dirais qu'elle l'est . Vous n'aurez peut-être pas besoin de l'afficher dans la figure finale, mais de l'avoir pour vous-même ou pour les examinateurs. Vous voulez pouvoir dire que le traitement a conduit à un changement de fluorescence de 2 ou 3 fois lorsque vous l'écrivez, plutôt que de simplement donner une déclaration qualitative. La quantification est toujours la voie à suivre, vous êtes donc sur la bonne voie.

Soyez intéressé de savoir pourquoi vous n'utilisez l'odyssée que lorsque les protéines sont en abondance. Je viens de découvrir qu'il y a 2 sur le campus que j'aurais pu utiliser depuis le début (soupir)

Comme d'autres l'ont souligné, vous devez calculer l'aire sous la courbe, et non la valeur moyenne de gris dans votre rectangle. Prendre la valeur moyenne peut fonctionner si les bandes étaient à peu près de la même taille, mais dans votre échantillon, elles ne le sont pas, donc cela ne vous donnera pas de données fiables. La zone sous la courbe totalise essentiellement tous les pixels de votre bande et serait une meilleure méthode de quantification. Par exemple, je l'ai fait brièvement avec l'image que vous avez fournie (n'oubliez pas qu'imgur compresse l'image) et il a obtenu une différence de 2,8 fois dans les échantillons D3.

Préface : Il est préférable de trouver votre plage linéaire avant même de tenter la quantification. Cela peut être aussi simple que de charger une série de dilutions en série de votre lysat, puis d'identifier une plage d'exposition pour la détection par film ou IR qui vous donne des intensités mesurables et non saturées pour les dilutions que vous chargez habituellement. Donc, un bon exemple de mini gel serait 25 ug de lysat, 12,5 ug, 6,25, 3,125, etc. Ensuite, établissez/optimisez les concentrations d'anticorps, les temps de lavage/tampons et le temps de développement.

Au minimum, assurez-vous que vous n'avez pas saturé votre signal (une valeur de pixel max/min pour vos LUT sur imageJ, par exemple). Cela ne vaut même pas la peine de quantifier les bandes saturées.

Voici comment je procède lorsque j'ai besoin de quantifier des bandes pour des réplicats biologiques qui sont exécutés sur différentes membranes. Cela commence par le processus PAGE/transfert. Ne négligez pas la cohérence là-bas !

Chargez des masses d'échantillons égales et transférez avec un courant constant, en utilisant le même mW * h / cm 2 de membrane pour déposer des quantités similaires de protéines sur vos membranes. Cela normalise le courant pour la surface de la membrane et le temps de transfert. Cela améliore grandement la cohérence.

Développez vos blots avec des temps similaires en fonction de votre courbe de dilution ou de votre expérience empirique, comme ci-dessus. Numérisez les films à un DPI suffisamment élevé pour éviter les bandes pixelisées ou capturez une exposition haute résolution pour les méthodes d'imagerie IR. Enregistrer en tant que .tif.

Dans ImageJ, utilisez une image en niveaux de gris de 8 ou 16 bits et utilisez Selection>Specify pour recadrer des zones entières de membrane de taille égale à partir de chaque membrane/film/photo IR (assurez-vous d'inclure toutes les voies/marqueurs/annotations - ne vous contentez pas de recadrer votre groupe d'intérêt). Enregistrez-le en tant qu'image distincte. Je fais cela parce que cela facilite la soumission d'images entières aux journaux et réduit la taille des fichiers.

Utilisez Traiter>Soustraire l'arrière-plan pour réduire les intensités d'arrière-plan.

Utilisez Transform>Rotate pour aligner vos bandes horizontalement. Ceci est important pour faire votre zone sous les mesures de la courbe ci-dessous, car cela gardera vos pics bien alignés à l'étape "plot lanes".

Utilisez à nouveau Selection>Specify pour dessiner un rectangle vertical légèrement plus large que la taille de votre bande, et avec une longueur suffisamment longue pour capturer toute la voie (au cas où des bandes plus petites/plus grandes sont présentes).

Utilisez Outils>Gels pour sélectionner la première voie (Ctrl 1), puis Ctrl 2 pour chaque voie suivante. Enfin "tracer les voies" en utilisant Ctrl 3.

Vos pics doivent être séparés par la ligne de base, ou presque en raison de la soustraction de fond. Maintenant, dessinez un rectangle verticalement à travers la fenêtre des voies tracées de telle sorte que les bordures gauche et droite du rectangle englobent les limites gauche et droite de chaque pic et que le haut/le bas du rectangle englobe tous les pics. Appuyez sur Ctrl D pour dessiner le rectangle. Cette étape comprend un pic normalisé par rapport à la ligne de base dans la même position pour chaque voie (si les pics ne s'alignent pas bien, vous devrez peut-être revenir à l'étape 5 pour faire pivoter vos bandes, ou vous devrez peut-être approximer la base de chaque pic individuellement.

Utilisez l'outil baguette pour mesurer les zones sous la courbe (AUC).

Exportez vos AUC vers MATLAB ou Excel, ou tout autre programme dans lequel vous aimez faire des calculs.

Normaliser chaque zone à la zone d'une bande de contrôle d'échantillon. Par exemple, les voies "non traitées" ou "de type sauvage" peuvent servir de norme de normalisation. Cette valeur deviendra "1" et chaque autre bande sera une fraction ou un multiple de celle-ci. Répétez cette opération pour vos bandes de contrôle de chargement ou vos bandes de protéines totales si vous examinez des modifications post-traductionnelles.

Normalisez les valeurs normalisées de l'échantillon-contrôle à votre contrôle de charge ou à vos contrôles de protéines totales, respectivement.

Ceci est similaire si tous les réplicats biologiques sont sur une membrane. Vous n'aurez qu'une certaine variation dans vos valeurs de contrôle d'échantillon normalisées. La moyenne de cette valeur devient votre valeur de normalisation, donc encore une fois, il y aura une tendance centrale/moyenne de 1 pour les contrôles non traités ou de type sauvage (ou quelle que soit votre (vos) piste(s) de contrôle).

Enfin, quelques points sur lesquels j'insiste dans notre laboratoire :

Les résultats du Western blot auront une variabilité inhérente qui réduit la sensibilité et masque certaines différences évidentes si vous n'exécutez pas l'expérience avec suffisamment de répétitions biologiques pour tenir compte de la variation. Planifiez donc à l'avance la taille de vos échantillons en prenant en compte la taille de l'effet dans une expérience préliminaire, et acceptez vos résultats pour ce qu'ils sont ! Ne continuez pas à "ajouter plus de répétitions" afin de réduire la variation apparente et d'obtenir des résultats "significatifs". Cela s'appelle p-piratage. C'est contraire à l'éthique et c'est faute de recherche.


Résultats

L'acétate restaure l'acétylation des histones sous hypoxie

Les cellules cancéreuses exigent des nutriments extracellulaires distinctifs et reprogramment les voies métaboliques pour survivre et proliférer lorsqu'elles sont confrontées à des situations difficiles, telles que l'hypoxie 25 . Le stress hypoxique est un acteur essentiel de la tumorigenèse et du développement tumoral 26 . En effectuant une analyse de l'exométabolome basée sur les spectres 1 H-RMN, nous avons constaté que les cellules cancéreuses absorbaient environ 20% d'acétate du milieu de culture sous normoxie tandis que plus de 80% d'acétate étaient consommés sous hypoxie (Fig. 1a, Fig. 1a, b). suggérant que les cellules cancéreuses absorbent plus d'acétate sous hypoxie que nomoxie 7,9,14. De plus, nous avons effectué la quantification de l'acétate de cinq paires de carcinome hépatocellulaire (CHC) et des échantillons adjacents par RMN. Comme le montre la figure supplémentaire 1c, la plage de concentration d'acétate était de 0,56 à 2,67 mol g -1 dans les tissus humides (à gauche) et la concentration d'acétate dans les tissus serait grossièrement estimée entre 0,56 et 2,67 mM (à droite). Dans la plupart des cas, les concentrations d'acétate se situaient autour de 0,5 mM et dans deux échantillons de HCC, les niveaux d'acétate atteignaient 2,5 mM (Fig. 1c supplémentaire). Pour explorer l'effet de l'acétate sur les cellules cancéreuses, nous avons traité les cellules HepG2 avec de l'acétate sous hypoxie et avons constaté que l'acétate compensait le déclin de l'acétylation des histones sous hypoxie par rapport à la normoxie (Fig. 1b). D'un intérêt particulier, l'acétate a induit une augmentation significative des niveaux d'acétylation de H3K9, H3K27 et H3K56, mais pas des niveaux d'acétylation de H3K14, H3K18, H3K23 et H3K36 (Fig. 1b). Cela indique que l'acétate sauve l'acétylation des histones réduite par l'hypoxie avec une certaine spécificité. Plus important encore, en utilisant une technique de marquage métabolique basée sur la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide en mode de surveillance de réactions multiples (LC-MRM MS), nous avons identifié 13 C2-marqués acétylés H3K9 (Fig. supplémentaire 1d), H3K27 (Fig. supplémentaire 1e) et H3K56 (Fig. 1f supplémentaire) dans des cellules HepG2 traitées avec [U-13 C2]-acétate, démontrant que l'acétyl-CoA dérivé de l'acétate était bien incorporé dans les histones. De plus, par rapport à la normoxie, l'acétylation des histones est plus sensible à la supplémentation en acétate sous hypoxie, même à faible concentration, dans les cellules HepG2, A549 et DU 145 (Fig. 1c Fig. 1g, h).

(une) Spectres 1 H-RMN de concentration en acétate en milieu frais, milieu de cellules cancéreuses cultivées sous normoxie ou hypoxie. Les résultats représentaient la moyenne ± s.d. d'expériences en triple. ( ** P<0.01 *P<0.05 par les étudiants non appariés à deux queues t-test). (b) L'acétate sauve les niveaux d'acétylation H3K9, H3K27 et H3K56 réduits par l'hypoxie. Les cellules HepG2 ont été traitées avec ou sans acétate 2,5 mM sous hypoxie (1% O2) pendant 4h. Les niveaux d'acétylation des histones ont été déterminés par western blot. Le total H3 a servi de témoin de chargement. (c) Les cellules cancéreuses sont plus sensibles à l'acétate en cas d'hypoxie. Les cellules HepG2 ont été traitées avec les concentrations indiquées d'acétate sous normoxie ou hypoxie (1% O2) pendant 4h. Les niveaux d'acétylation des histones ont été déterminés par western blot. Le total H3 a servi de témoin de chargement. () L'acétate augmente les niveaux d'acétylation H3K9, H3K27 et H3K56 de manière dépendante du temps sous hypoxie. Les cellules HepG2 ont été traitées avec ou sans acétate 5 mM pendant 0,5, 1, 2 et 4 h sous hypoxie (1% O2), respectivement. Les niveaux globaux d'acétylation des histones ont été déterminés par western blot. L'histone H3 totale a servi de témoin de charge. (e) L'acétate augmente les niveaux d'acétylation de H3K9, H3K27 et H3K56 de manière dose-dépendante en cas d'hypoxie. Les cellules HepG2 ont été traitées avec les concentrations indiquées d'acétate pendant 4 h sous hypoxie (1% O2). Les niveaux d'acétylation des histones ont été déterminés par western blot. Le total H3 a servi de témoin de chargement.

Pour caractériser le mode de régulation épigénétique par l'acétate, nous avons traité des cellules cancéreuses avec de l'acétate à différents moments sous hypoxie. Nous avons constaté que le supplément d'acétate exogène augmentait rapidement les niveaux d'acétylation de H3K9, H3K27 et H3K56 de manière dépendante du temps sous hypoxie dans différentes lignées cellulaires cancéreuses (Fig. 1d Fig. 1i, j). Le supplément d'acétate a considérablement augmenté les niveaux d'acétylation de H3K9, H3K27 et H3K56 en 2 h (Fig. 1d Fig. 1i, j supplémentaire). De plus, l'acétate augmente les niveaux d'acétylation des histones H3K9, H3K27 et H3K56 de manière dose-dépendante sous hypoxie dans HepG2 (Fig. 1e), A549 (Fig. 1k), DU145 (Fig. 1l), SkBr3 (Fig. 1k), DU145 (Fig. 1l), SkBr3 (Fig. 1k) Fig. 1m) et des cellules HT29 (Fig. 1n supplémentaire). Une faible concentration d'acétate (1,25 mM) a légèrement augmenté les niveaux d'acétylation des histones, tandis que des concentrations plus élevées d'acétate (2,5 à 5 mM) ont augmenté de manière significative les niveaux d'acétylation des histones sous hypoxie (Fig. 1e Fig. supplémentaire 1k, l, m, n). Collectivement, ces données impliquent que l'acétate est impliqué dans la régulation de l'acétylation des histones sous hypoxie.

L'acétate active épigénétiquement la lipogenèse de novo

Il est bien connu que l'acétylation des histones est associée à l'activité de transcription 27,28,29. Pour étudier l'effet biologique sur le métabolisme du cancer induit par l'acétylation des histones médiée par l'acétate, nous avons détecté les changements d'expression de l'ARNm des gènes métaboliques. Nous avons conçu des amorces PCR quantitatives (qPCR) ciblant 139 gènes métaboliques, couvrant un large éventail de voies métaboliques (c'est-à-dire la glycolyse, le cycle du TCA, la voie des pentoses phosphates, le métabolisme du glycogène, le métabolisme des corps cétoniques, le métabolisme des acides aminés, la synthèse des acides gras et la β-oxydation , la synthèse du cholestérol, le métabolisme des sphingolipides et les transporteurs liés au métabolisme) (tableau supplémentaire 1) et ont mené une qPCR pour dépister les voies métaboliques potentielles affectées par la régulation épigénétique induite par l'acétate. Le nuage de points des données d'expression de l'ARNm de 139 gènes dans les cellules HepG2 a été montré sur la figure 2a, en comparant la culture cellulaire sous hypoxie avec la normoxie. L'expression de VEGF et LDHA, qui ont été inclus comme témoins positifs pour vérifier l'effet hypoxique, ont augmenté de plus de deux fois sous hypoxie (Fig. 2a). Nous avons ensuite testé l'effet de l'acétate sur l'expression des gènes sous normoxie (Fig. 2b) ou hypoxie (Fig. 2c), respectivement.Par rapport au groupe normoxie, les gènes régulés à la hausse par deux dans le groupe hypoxie et hypoxie avec groupe acétate ont montré beaucoup de chevauchement (Fig. 2a supplémentaire). Outre, FASN et ACSS2 étaient les gènes uniques dans l'hypoxie avec le groupe acétate, indiquant que l'acétate jouait un rôle important dans la synthèse des lipides sous hypoxie (Fig. 2a supplémentaire). En ligne avec cette, FASN et ACACA Les niveaux d'ARNm ont été activés de plus de deux fois avec de l'acétate sous hypoxie, alors qu'aucun effet d'activation n'a été observé sous normoxie (Fig. 2b,c). Les deux FASN et ACACA sont dans la liste des 10 principaux gènes métaboliques régulés à la hausse induits par l'acétate sous hypoxie, indiquant que l'acétate affecte principalement de novo synthèse des lipides par rapport à d'autres voies métaboliques (Fig. 2c,d). De façon intéressante, ACSS1 et ACSS2 Les niveaux d'ARNm ont diminué sous hypoxie par rapport à la normoxie (Fig. 2a), ce qui était en contradiction avec les autres études qui ont indiqué que ACSS2 a été régulée à la hausse sous hypoxie 9,14. Cela peut être dû aux conditions expérimentales, telles que les différentes lignées cellulaires utilisées et les moments de traitement. De plus, le niveau d'ARNm de ACSS1 et ACSS2, plutôt que ACLY, ont également été régulés à la hausse par le traitement à l'acétate sous hypoxie (Fig. 2c,d). Le sauvetage de l'hypoxie réduite ACSS1 et ACSS2 l'expression par l'acétate peut indiquer que ACSS1 et ACSS2 jouent un rôle important dans l'adaptation des cellules cancéreuses à l'hypoxie.

(une) Nuage de points des données d'expression de l'ARNm de 139 gènes métaboliques dans les cellules HepG2, comparant les cellules traitées par hypoxie (oui axe) à la normoxie (X axe). La valeur d'expression de l'ARNm des expériences en triple a été montrée sur une échelle log2. Les lignes grises indiquaient des différences doubles dans les niveaux d'expression d'ARNm entre deux groupes. Gènes régulés à la hausse (changement de plus de 2 fois, P<0.05) étaient affichés en magenta. Gènes exprimés régulés à la baisse (modification de plus de 2 fois, P<0.05) étaient affichés en bleu. Étudiant non apparié à deux queues t-test a été utilisé. (b) Nuage de points des données d'expression de l'ARNm de 139 gènes métaboliques dans les cellules HepG2 sous normoxie, comparant les cellules traitées avec de l'acétate 2,5 mM (oui axe) à sans acétate (X axe). La valeur d'expression de l'ARNm des expériences en triple a été montrée sur une échelle log2. Les lignes grises indiquaient des différences doubles dans les niveaux d'expression d'ARNm entre deux groupes. Gènes régulés à la baisse (changement de plus de 2 fois, P<0.05) étaient affichés en bleu. Étudiant non apparié à deux queues t-test a été utilisé. (c) Nuage de points des données d'expression de l'ARNm de 139 gènes métaboliques dans les cellules HepG2 sous hypoxie, comparant les cellules traitées avec de l'acétate 2,5 mM (oui axe) avec sans acétate (X axe). La valeur d'expression de l'ARNm des expériences en triple a été montrée sur une échelle log2. Les lignes grises indiquaient des différences doubles dans les niveaux d'expression d'ARNm entre deux groupes. Gènes régulés à la hausse (changement de plus de 2 fois, P< 0,05) ont été affichés en magenta. Étudiant non apparié à deux queues t-test a été utilisé. () Analyse de changement de pli de l'expression de l'ARNm de 139 gènes dans des cellules HepG2 traitées avec ou sans acétate 2,5 mM sous hypoxie. (e,F) FASN (e) et ACACA (F) les niveaux d'ARNm dans les cellules HepG2 traitées avec des concentrations indiquées d'acétate pendant 12 h sous normoxie ou hypoxie ont été quantifiés par qPCR. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple. (g,h) Tests ChIP-qPCR montrant l'enrichissement par acétylation H3K9, H3K27 et H3K56 à FASN (g) et ACACA (h) régions promotrices dans les cellules HepG2 traitées avec des concentrations indiquées d'acétate sous normoxie ou hypoxie pendant 4 h. L'IgG de lapin a été incluse comme contrôle négatif. Chaque histogramme était présenté sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (*P<0.05 ** P<0,01 NS, non significatif selon le modèle de Student non apparié bilatéral t-test).

Nous avons également étudié si l'acétylation des histones induite par l'acétate était associée à la transcription du gène promue par l'acétate sur la lipogenèse. Nous avons traité des cellules cancéreuses avec des concentrations en gradient d'acétate et avons constaté que FASN et ACACA L'expression de l'ARNm était régulée positivement de manière dose-dépendante sous hypoxie (Fig. 2e,f). Curieusement, le changement de FASN et ACACA L'expression de l'ARNm est plus sujette à une faible concentration d'acétate sous hypoxie, par rapport au contrôle normoxique (Fig. 2e,f). Pour caractériser si la régulation positive des gènes lipogéniques est causée par l'acétylation des histones induite par la supplémentation en acétate, nous avons traité des cellules cancéreuses avec de la trichostatine A (TSA), un inhibiteur d'histone désacétylase, comme contrôle positif. Nous avons constaté que la TSA et l'acétate augmentaient à la fois le niveau global d'acétylation de l'histone H3 et l'expression de l'ARNm de FASN et ACACA, bien que le TSA et l'acétate n'aient eu aucun effet synergique (Fig. 2b supplémentaire). De plus, le traitement à l'acétate a conduit à une amélioration en fonction du temps des niveaux d'acétylation de H3K9, H3K27 et H3K56 (Fig. 2c supplémentaire). En ligne avec l'augmentation de l'acétylation des histones H3, FASN et ACACA Les expressions d'ARNm étaient également élevées de manière dépendante du temps (Fig. 2c supplémentaire). De plus, nous avons effectué des tests ChIP-qPCR pour définir le mécanisme sous-jacent de la réaction induite par l'acétate FASN et ACACA expressions. Nous avons constaté que l'acétate augmentait nettement le niveau d'acétylation de H3K56 au niveau des promoteurs de FASN et ACACA (Fig. complémentaire 2d,e), mais pas ACLY (Fig. 2f supplémentaire). De plus, nous avons constaté que l'acétylation des histones (H3K9ac, H3K27ac et H3K56ac) au niveau des promoteurs de FASN et ACACA a répondu au traitement à l'acétate de manière dose-dépendante et l'acétylation des histones était plus susceptible d'être induite par une faible concentration (≤ 2,5 mM) d'acétate sous hypoxie, par rapport à la normoxie (Fig. 2g, h). Ces résultats démontrent que l'acétate est capable de réguler épigénétiquement les gènes lipogéniques à une concentration physiopathologique.

Pour exclure la possibilité que l'acétylation du promoteur de FASN et ACACA reflète une transcription accrue, nous avons alternativement effectué une ChIP-qPCR et testé l'acétylation des histones du promoteur de LDHA et VEGF (Fig. complémentaire 2g, h, i, j). Les niveaux d'acétylation (H3K9ac, H3K27ac et H3K56ac) à LDHA et VEGF les promoteurs étaient augmentés sous hypoxie, qui était encore régulée à la hausse par la supplémentation en acétate (Fig. 2g, h, i, j). De manière constante, l'expression de l'ARNm de LDHA et VEGF a également été activé par l'acétate (Fig. 2k,l). Ces observations suggèrent que l'acétate contribue à l'acétylation des histones au niveau des promoteurs des gènes induits par l'hypoxie. Collectivement, ces données soutiennent notre idée selon laquelle l'acétate favorise la voie de synthèse des lipides par le biais de la régulation épigénétique.

La lipogenèse induite par l'acétate ne reflète pas les demandes en lipides

Les cellules cancéreuses présentent des besoins accrus en lipides, en piégeant les lipides extracellulaires ou de novo synthèse des lipides 2,30,31 . Nous avons essayé de déterminer si l'expression induite par l'acétate de FASN ou ACACA est affecté par les lipides extracellulaires sous hypoxie. Conformément aux données de la Fig. 2, FASN et ACACA L'expression de l'ARNm était plus susceptible d'être induite par l'acétate sous hypoxie, par rapport à la normoxie (Fig. 3a, c) et à l'acétylation des histones du promoteur activé par l'acétate de FASN et ACACA plus prononcé sous hypoxie (Fig. 3b,d). De plus, la déplétion lipidique dans le sérum n'a pas modifié l'expression induite par l'acétate de FASN et ACACA dans les cellules HepG2 (Fig. 3e Fig. 3a supplémentaire). De la même manière, FASN et ACACA l'acétylation des histones du promoteur n'a pas non plus été affectée par l'épuisement des lipides (Fig. 3f Fig. 3b supplémentaire). De plus, la supplémentation en palmitate n'a pas modifié l'expression de FASN, VEGF et ACACA (Fig. 3g Fig. 3c, d). Constamment, l'acétylation des histones au niveau des régions promotrices de FASN et ACACA n'a pas répondu à la supplémentation en palmitate (Fig. 3h Fig. 3e supplémentaire). Ces résultats démontrent que l'acétate augmente l'acétylation des histones au niveau des promoteurs des gènes lipogéniques et active leur expression d'ARNm, sans refléter la demande en lipides des cellules hypoxiques.

(une) FASN expression dans les cellules HepG2 traitées avec des concentrations indiquées d'acétate pendant 12 h sous normoxie ou hypoxie ont été quantifiées par qPCR. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0,01 NS, non significatif selon Student t-test). (b) Tests ChIP-qPCR montrant l'enrichissement de l'acétylation des histones à FASN région promotrice dans les cellules HepG2 traitées avec les concentrations indiquées d'acétate sous normoxie ou hypoxie pendant 4 h. L'IgG de lapin a été incluse comme contrôle négatif. Chaque histogramme était présenté sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0,01 NS, non significatif selon Student t-test). (c) ACACA expression dans les cellules HepG2 traitées comme dans le panel (une) ont été quantifiés par qPCR. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0,01 NS, non significatif selon Student t-test). () Tests ChIP-qPCR montrant l'enrichissement de l'acétylation des histones à ACACA région promotrice dans les cellules HepG2 traitées comme dans b. Chaque histogramme était présenté sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0,01 NS, non significatif selon Student t-test). (e) Quantification de FASN expression dans des cellules HepG2 traitées avec ou sans acétate 2,5 mM dans des milieux plus 10 % de FBS ou 10 % de LPDS pendant 12 h sous hypoxie par qPCR. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0.01 par l'étudiant t-test). (F) Tests ChIP-qPCR montrant les niveaux d'acétylation des histones à FASN région promotrice dans les cellules HepG2 traitées comme dans e pendant 4 h sous hypoxie. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0.01 par l'étudiant t-test). (g) Quantification de FASN expression dans des cellules HepG2 traitées avec 10 % de LPDS plus la concentration indiquée de palmitate (PA) pendant 12 h sous normoxie ou hypoxie par qPCR. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (NS, non significatif selon le t-test). (h) Tests ChIP-qPCR montrant l'enrichissement des niveaux d'acétylation des histones à FASN région promotrice dans les cellules HepG2 traitées comme dans g pendant 4 h sous normoxie ou hypoxie. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (NS, non significatif selon le t-test).

ACSS1 et ACSS2 sont tous deux impliqués dans la lipogenèse induite par l'acétate

Chez les mammifères, deux enzymes principales interviennent dans la production d'acétyl-CoA à partir de l'acétate : l'ACSS2 cytosolique et son paralogue mitochondrial ACSS1. Pour disséquer quelle enzyme est responsable de la médiation de l'augmentation de l'acétylation des histones induite par l'acétate, nous avons renversé ACSS1 ou ACSS2 individuellement et évalué les niveaux d'acétylation des histones correspondants. À notre grande surprise, le renversement de l'un ou l'autre ACSS1 ou ACSS2 était incapable de bloquer l'augmentation induite par l'acétate des niveaux d'acétylation aux sites H3K9, H3K27 et H3K56 (Fig. 4a, b). Bien qu'en discordance avec les autres études rapportant que l'ACSS2, mais pas l'ACSS1, semblait être l'enzyme clé impliquée dans le métabolisme de l'acétate pour la synthèse des lipides 5,9, nos résultats étaient cohérents avec ceux de Yun et al. 32 et Bjornson et al. 33, qui a rapporté que ACSS1 était également vital pour la synthèse des lipides acétate-dépendante. Ces résultats indiquent que ACSS1 et ACSS2 sont fonctionnellement redondants. Nous avons alors établi ACSS1/2 pools de cellules stables à double précipitation. renversement simultané de ACSS1/2 en utilisant deux ensembles différents de shRNA inhibé considérablement l'augmentation induite par l'acétate des niveaux d'acétylation de H3K9, H3K27 et H3K56 sous hypoxie (Fig. 4a, Fig. 4c supplémentaire). De plus, nous avons effectué une quantification basée sur la LC-MRM MS pour voir si ACSS1/2 double knockdown pourrait réduire l'abondance des peptides d'acétylation des histones dérivés de l'acétate en utilisant [U-13 C2traceur ]-acétate. L'acétyl-CoA dérivé de l'acétate a été trouvé activement incorporé dans les sites d'acétylation H3K9, H3K14 et H3K27, par rapport aux sites d'acétylation H3K18, H3K23 et H3K56 (Fig. 4b, Fig. 4d supplémentaire). Ces résultats démontrent que l'acétate pourrait fonctionner comme un donneur d'acétyle pour induire l'acétylation des histones. ACSS1/2 le double knockdown a induit une diminution plus significative du 13 C2-peptides acétylés marqués H3K9, H3K27 dérivés de [U-13 C2]-acétate (Fig. 4b Fig. 4d supplémentaire). Quant à l'écart d'acétylation de H3K56 entre les données de western blot et la quantification MS, cela pourrait être dû au fait que la concentration de 13 C2-le peptide H3K56 acétylé marqué était trop faible pour atteindre la limite de quantification. De plus, nous avons conçu des expériences pour tester si ACSS1/2 double knockdown pourrait bloquer l'acétylation des histones induite par l'acétate à FASN et ACACA régions promotrices. ACSS1/2 L'efficacité du knockdown a été vérifiée par qPCR (Fig. 4e supplémentaire). Nous avons constaté que l'acétate augmentait les niveaux d'acétylation des H3K9, H3K27 et H3K56 à FASN (Fig. 4c) et ACACA (Fig. 4d) les régions promotrices ont été bloquées par ACSS1/2 double knockdown sous hypoxie. ACSS1/2 knockdown n'a eu aucun effet sur les niveaux d'acétylation des histones à ACLY région promotrice (Fig. 4e). Régulièrement, ACSS1/2 knockdown bloqué induit par l'acétate FASN expression (Fig. supplémentaire 4f). Collectivement, nos données démontrent que l'acétate contribue à l'acétylation des histones d'une manière dépendante d'ACSS1/2 sous hypoxie.

(une) Knockdown de manière stable et simultanée ACSS1 et ACSS2 bloque totalement l'augmentation des niveaux d'acétylation des histones induite par l'acétate. Niveaux d'acétylation des histones dans shscr ou shACSS1/2 Les cellules HepG2 traitées avec ou sans acétate 2,5 mM sous normoxie ou hypoxie ont été analysées par western blot. (b) 13C2-les niveaux de H3K9ac et H3K27ac marqués sont diminués de ACSS1/2 abattre. Quantification du 13 C2-niveaux d'acétylation de l'histone H3 marqué dans shscr ou shACSS1/2 Lignée cellulaire stable HepG2 traitée avec [U-13 C2Le ]-acétate pendant 4 h sous hypoxie a été analysé par LC-MRM MS. Le pourcentage indique le rapport de H3K[ 13 C2-ac]/H3Kac total dans chaque site. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (*P<0.05 *** P<0.001 par l'étudiant t-test). (c,) ACSS1/2 knockdown bloque totalement l'association d'acétylation des histones induite par l'acétate avec FASN et ACACA promoteur. Des tests ChIP-qPCR ont été effectués pour déterminer l'enrichissement par acétylation H3K9, H3K27 et H3K56 à FASN (c) et ACACA () région promotrice dans shscr ou shACSS1/2 Lignées cellulaires stables HepG2 traitées avec ou sans acétate sous hypoxie pendant 4 h. IgG a été inclus comme contrôle négatif. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0.01 *** P<0.001 NS, non significatif selon Student t-test). (e) Des tests ChIP-qPCR ont été effectués pour déterminer l'enrichissement par acétylation H3K9, H3K27 et H3K56 à ACLY région du promoteur en shscr ou shACSS1/2 Cellules HepG2 traitées comme dans c. L'IgG a été incluse comme contrôle négatif. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (NS, non significatif selon le t-test).

Une étude précédente a lié le métabolisme du glucose dépendant de l'ACLY à l'acétylation des histones 1,22. Pour disséquer les contributions de différentes sources de carbone à l'acétylation des histones, nous avons effectué des tests qPCR et ChIP-qPCR dans ACSS1/2-knockdown et/ou ACLY-cellules knock-down. L'efficacité du knockdown a été vérifiée (Fig. 4g supplémentaire). L'épuisement de l'un ou l'autre ACSS1/2 ou ACLY expression génique réduite de LDHA et VEGF, qui ont été encore diminués par le renversement des deux ACSS1/2 et ACLY (Fig. supplémentaire 4h,i). systématiquement, soit ACSS1/2 ou ACLY knockdown a réduit l'acétylation des histones dans les régions promotrices de LDHA et VEGF (Fig. supplémentaire 4j, k, l, m). Ces résultats démontrent que ACSS1/2 et ACLY contribuent à l'acétylation des histones sous hypoxie.

La lipogenèse induite par l'acétate favorise la survie cellulaire

Pour tester si l'acétate affecterait le pool lipidique dans les cellules cancéreuses, nous avons cultivé des cellules stables HepG2 dans des milieux avec des isotopes marqués [U-13 C2]-acétate pendant 24 h sous hypoxie et mesuré les isotopologues du pool d'acides gras en utilisant la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). ACSS1/2 le double knockdown a en effet diminué la contribution fractionnelle de l'acétate à la synthèse du palmitate et du stéarate (Fig. 5a). Ces résultats sont cohérents avec le modèle selon lequel l'acétyl-CoA dérivé de l'acétate stimule de novo synthèse des lipides 5,7,9 . De plus, nous avons renversé FASN expression à l'état non stimulé en utilisant l'ARNsi à faible efficacité comme dans la Fig. 5a supplémentaire, et des cellules traitées avec des isotopes marqués [U-13 C2]-acétate sous hypoxie. Les de novo la synthèse des lipides à partir du carbone dérivé de l'acétate a été réduite dans FASN cellules knockdown, démontrant que l'acétate fonctionne comme un donneur d'acétyle pour favoriser la lipogenèse et induite par l'acétate FASN l'expression joue un rôle important dans la lipogenèse (Fig. 5b). Étant donné qu'une synthèse lipidique élevée pourrait favoriser la survie des cellules tumorales sous hypoxie 2,25, nous avons effectué un test CCK8 et constaté que le supplément d'acétate améliorait la survie des cellules sous hypoxie, mais pas la normoxie (Fig. 5c). Pour déterminer si l'acétate a favorisé la survie des cellules cancéreuses en régulant les gènes lipogéniques, nous avons utilisé des siARN spécifiques ciblant FASN ou ACACA, dont les efficacités de précipitation relativement faibles sont capables de supprimer l'acétate simulé FASN et ACACA Expression de l'ARNm au niveau similaire à l'état non stimulé (Fig. 5a supplémentaire). Nous avons constaté que la survie cellulaire induite par l'acétate sous hypoxie était inhibée par le knockdown de l'un ou l'autre FASN ou ACACA, indiquant que la survie cellulaire favorisée par l'acétate dépendait de la lipogenèse et que l'induction de l'expression génique lipogénique était vitale pour la survie cellulaire (Fig. 5d). De manière frappante, nous avons constaté que l'inhibition de l'une ou l'autre FASN ou ACACA au niveau non traité n'a eu aucun effet sur les effets induits par l'acétate FASN promoteur d'acétylation des histones (Fig. 5b supplémentaire). Nous avons tenté de disséquer davantage si l'acétate induit de novo la synthèse des lipides est vitale pour les cellules cancéreuses cultivées sous hypoxie. Nous avons constaté que les cellules HepG2 et SkBr3 étaient plus sensibles au C75, un inhibiteur chimique du FASN, lorsqu'elles étaient cultivées sous hypoxie (Fig. 5c supplémentaire), conformément au rapport précédent selon lequel les cellules cancéreuses dépendaient de de novo synthèse des lipides sous hypoxie 9 . De plus, le traitement au C75 a abrogé la survie des cellules cancéreuses induite par l'acétate sans affecter FASN et ACACA Niveaux d'ARNm (Fig. 5d,e,f supplémentaire). Régulièrement, ACSS1/2 knockdown a bloqué l'augmentation de la survie cellulaire induite par le supplément d'acétate, indiquant que la survie cellulaire induite par l'acétate était ACSS1/2-dépendant (Fig. 5e). De plus, nous avons effectué le test Matrigel et constaté que les cellules HepG2 fournies avec de l'acétate présentaient un avantage de croissance par rapport au groupe témoin, et cet effet a été bloqué par ACSS1/2 double renversement (Fig. 5f). Pris ensemble, au-delà de fonctionner comme un précurseur de la lipogenèse, l'acétate sert également de donneur d'acétyle pour induire l'acétylation des histones et l'expression de l'ARNm des gènes lipogéniques, contribuant à l'adaptation des cellules cancéreuses à l'hypoxie.

(une) ACSS1/2 médie la production de palmitate et de stéarate induite par l'acétate. Abondance fractionnée des isotopologues palmitate (gauche) et stéarate (droite) dans ACSS1/2 Cellules HepG2 à double knockdown stables (désignées magenta) par rapport à celle des cellules témoins (désignées noires) après 24 h de culture sous hypoxie avec [U-13 C2]-acétate. Chaque histogramme était présenté sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple. L'encart montre le pourcentage d'acétyl-CoA lipogénique dérivé de l'acétate de carbone (** P<0.01 par l'étudiant t-test). (b) Abondance fractionnée des isotopologues palmitate (panneau de gauche) et stéarate (panneau du milieu) en brouillage (siscr) et siFASN Les cellules HepG2 se traitent comme dans une. Chaque histogramme était présenté sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple. L'encart montre le pourcentage d'acétyl-CoA lipogénique dérivé du carbone acétate. L'efficacité du knockdown a été détectée par PCR avec transcription inverse (panneau de droite) (** P<0,01 NS, non significatif selon Student t-test). (c) L'acétate favorise la survie des cellules en cas d'hypoxie. La viabilité des cellules HepG2 traitées avec les concentrations indiquées d'acétate sous normoxie ou hypoxie a été déterminée par dosage CCK8. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (** P<0.01 *** P<0.001 NS, non significatif selon Student t-test). () Viabilité du contrôle ou siFSAN ou siACACA Les cellules HepG2 traitées avec ou sans 2,5 mM d'acétate sous hypoxie ont été déterminées par dosage CCK8. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (*** P<0.001 par l'étudiant t-test). (e) ACSS1/2 intervient dans la promotion de la survie cellulaire par l'acétate. Viabilité de shscr ou shACSS1/2 Les lignées cellulaires stables HepG2 traitées comme indiqué ont été déterminées par dosage CCK8. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± s.d. d'expériences en triple (*P<0,05 NS, non significatif selon Student t-test). (F) ACSS1/2 médie l'avantage de la croissance des cellules par l'acétate dans Matrigel. Chscr ou shACSS1/2 Les cellules HepG2 ont été étalées dans le lit de Matrigel et cultivées avec du DMEM avec 10 % de FBS et 2 % de Matrigel pendant 12 jours avant que les images ne soient prises (à gauche). Barre d'échelle, 0,25 mm. Les données quantitatives ont été présentées sous forme de moyenne ± s.d. (m>3) (à droite) ( *** P<0.001 NS, non significatif selon Student t-test).

ACSS1/2 est en corrélation positive avec l'expression FASN dans le CHC

ACSS2 est signalé à être régulé à la hausse dans divers cancers humains 3,5,9. ACSS1 est également signalé comme étant augmenté dans le carcinome hépatocellulaire 33 . Grâce à une analyse de 190 données d'échantillons de CHC humain du Cancer Genome Atlas (TCGA) 34 , nous avons trouvé une corrélation significative entre FASN et ACSS2 niveaux d'ARNm et aucune corrélation significative entre FASN et ACSS1 Niveaux d'ARNm (Fig. 6a supplémentaire). Nos résultats susmentionnés ont démontré que l'acétate pouvait réguler épigénétiquement FASN expression, ce qui nous incite à examiner les niveaux d'acétylation ACSS1/2, FASN et H3 et leur corrélation dans le CHC humain. Nous avons collecté 53 paires d'échantillons primaires de CHC humain avec des tissus normaux adjacents et déterminé les changements protéiques (ACSS1, ACSS2 et FASN) et six marques d'acétylation des histones (H3K9ac, H3K14ac, H3K18ac, H3K23ac, H3K27ac et H3K56ac) dans tous ces échantillons (m=53) (Fig. 6a Fig. 6b supplémentaire). Pour effectuer une analyse statistique de l'association entre ACSS1/2 et l'acétylation des histones, nous avons divisé les échantillons de tumeurs en deux groupes en fonction de la signature ACSS1/2 (élevée contre faible). Les tumeurs avec une expression 1,5 fois plus élevée de l'ACSS1 ou de l'ACSS2 ou des deux que celle du tissu de contrôle normal adjacent sont regroupées en tumeurs à haute expression de l'ACSS (tumeur/normale ≥1,5, m=26), tandis que les tumeurs à faible expression de l'ACSS (tumeur/normale <1,5, m= 27) expriment les deux protéines ACSS à 1,5 fois moins que son contrôle normal (Fig. 6b). Nous avons trouvé 16 cas avec une expression élevée d'ACSS1, 8 cas avec une expression élevée d'ACSS2 et 2 cas avec une expression élevée d'ACSS1 et d'ACSS2 (Fig. 6b). Le pourcentage plus élevé de cas à haute expression d'ACSS1 que celui d'ACSS2 prouve pleinement l'importance d'ACSS1 dans l'utilisation de l'acétate par le cancer. Nos résultats démontrent que quatre des six marques d'acétylation des histones, y compris H3K9ac (P=0,0220), H3K14ac (P=0,0289), H3K27ac (P=0,0034) et H3K56ac (P= 0,0410), sont significativement plus fortes dans les tumeurs à haute expression de l'ACSS que celles des tumeurs à faible expression de l'ACSS avec des tumeurs de Student non appariées à deux queues t-test (Fig. 6c). Conformément à cette observation, le niveau de protéine FASN est également régulé à la hausse de manière significative dans les tumeurs à haute expression de l'ACSS (Fig. 6d). De manière cohérente, nous avons effectué une analyse d'immunohistochimie (IHC) et avons constaté que l'expression d'ACSS1/2 était positivement corrélée avec l'acétylation H3 et l'expression de FASN dans le HCC humain. Un cas représentatif a été montré sur la figure 6e. En utilisant l'analyse de corrélation de Spearman, nous avons évalué la relation entre l'acétylation des histones et l'expression du FASN. Étonnamment, chaque marque d'acétylation d'histone dans notre analyse présente une corrélation positive significative avec l'expression de FASN (P<0.0001 pour H3K9ac, P=0,0003 pour H3K14ac, P=0.0009 pour H3K18ac, P=0,0385 pour H3K23ac, P<0.0001 pour H3K27ac et P<0.0001 pour H3K56ac Fig. 6c supplémentaire). Collectivement, ces résultats soutiennent fortement une corrélation positive entre ACSS1/2, FASN et l'acétylation des histones dans le CHC humain.

(une) Niveaux de protéines FASN, ACSS1 et ACSS2 (panneaux supérieurs, normalisés par rapport à l'-actine) et niveaux d'acétylation de H3K9, H3K14, H3K18, H3K23, H3K27 et H3K56 (panneaux inférieurs, normalisés par rapport à l'histone H3) dans 53 paires de HCC (chacun associé à les tissus cancéreux (désignés par C) et les tissus normaux adjacents (désignés par N)) ont été analysés par western blot. Deux paires d'échantillons représentatifs ont été présentées. Pour les 51 autres paires d'échantillons, veuillez vous référer à la Fig. 6b supplémentaire. (b) Carte thermique de l'expression des protéines (ACSS1, ACSS2 et FASN) et des niveaux d'acétylation des histones (H3K9ac, H3K14ac, H3K18ac, H3K23ac, H3K27ac et H3K56ac) dans les 53 paires de HCC. Les données ont été présentées comme Z-score d'expression relative des protéines ou d'acétylation des histones. Les tumeurs avec une expression 1,5 fois plus élevée d'ACSS1 ou d'ACSS2 ou des deux que celle du tissu de contrôle normal adjacent sont regroupées en tumeurs à haut niveau d'ACSS (tumeur/normal ≥1,5, m=26), tandis que les tumeurs à faible ACSS (tumeur/normale<1,5, m= 27) expriment les deux protéines ACSS à 1,5 fois moins que son contrôle normal. (c) H3K9ac (P=0,0220), H3K14ac (P=0,0289), H3K27ac (P= 0,0034), et H3K56ac (P= 0,0410), sont significativement plus forts dans les tumeurs ACSS-high que dans les tumeurs ACSS-low. Les analyses statistiques ont été effectuées avec un modèle de Student non apparié bilatéral. t-test (*P<0.05 ** P<0,01 NS, non significatif). () Le niveau de protéine FASN est significativement régulé à la hausse dans les tumeurs à haute teneur en ACSS (P= 0,002). Les analyses statistiques ont été effectuées avec un modèle de Student non apparié bilatéral. t-test ( ** P<0.01). (e) Résultats de coloration immunohistochimique représentatifs pour l'acétylation ACSS1, ACSS2, FASN et H3K9/K27/K56 dans le tissu normal adjacent (N) et le carcinome hépatocellulaire (C). Barre d'échelle, 100 m.


Résultats

Un essai combinant réou-Bbeaucoup et jemmunoréetection (DBID) détecte les interactions ADN-protéine in vitro

Pour développer une méthode permettant de découvrir un inhibiteur chimique de la liaison à l'ADN et de le tester sur CGGBP1, nous devions nous conformer aux conditions préalables suivantes : (i) détecter la liaison à l'ADN indépendante de la séquence et son inhibition, (ii) la liaison à l'ADN doit comprennent la liaison aux répétitions, et (iii) aucune exigence de connaissance préalable de la structure de la protéine cible (dans ce cas, la structure de CGGBP1 n'est pas rapportée). De plus, nous avons cherché à développer une méthode qui serait applicable à n'importe quelle combinaison d'ADN et de protéine et serait basée sur des principes simples de biochimie qui peuvent être personnalisés à peu de frais selon le choix des expérimentateurs. Nous avons conçu un test simple pour dépister les inhibiteurs des interactions protéine-ADN en empruntant les principes du Southwestern blotting [50, 51] et de l'immunochimie [52, 53] et l'avons appliqué pour CGGBP1.

L'ADN génomique a été extrait de cultures à croissance rapide de HEK293T et soniqué pour générer

Fragments longs de 1 ko (longueur moyenne). Des disques de membranes en nylon chargés positivement ont été trempés dans une solution d'ADN génomique soniquée et l'ADN a été attaché de manière covalente aux disques de membrane en nylon par cuisson sous vide à 80 ° C pendant 90 min sans aucune dénaturation (Fig. 1a). On estime que 0,5 ug d'ADN a été immobilisé sur chaque disque membranaire. Les disques membranaires liés à l'ADN ont été bloqués à l'aide de sérum bovin fœtal dans une solution saline tamponnée au phosphate complétée par du triton X-100 et ensuite utilisés comme sondes pour capturer les protéines des lysats cellulaires. L'incubation de disques membranaires recouverts d'ADN avec des lysats cellulaires concentrés permet de capturer les complexes protéiques de liaison à l'ADN présents dans les lysats (Fig. 1b). Ces disques membranaires revêtus d'ADN et réticulés sont désormais appelés « dot blots ».

Une représentation schématique du ou-Bbeaucoup et jemmunotest de détection (DBID). une: L'ADN génomique a été isolé à partir de cellules HEK293T. Des fragments d'ADN soniqués (longueur moyenne de 1 kb) ont été transférés sur des membranes de nylon chargées positivement et réticulés par chauffage sous vide à 80 °C. b: Les cellules HEK293T ont été lysées et les lysats clarifiés ont été utilisés comme source de protéine pour la liaison à l'ADN in vitro. Le test décrit ici est conçu pour détecter la liaison de CGGBP1 (cercle noir) à l'ADN, bien que ce protocole puisse être appliqué de manière générique pour toute protéine d'intérêt. CGGBP1 peut se lier à l'ADN soit directement (panneau supérieur) soit indirectement (par le biais de protéines de liaison, représentées dans le cercle bleu dans le panneau inférieur). La détection ultérieure basée sur l'immunochimie rapporte un signal brun pour les complexes directs et indirects CGGBP1-ADN. L'immunochimie utilise un anticorps primaire contre la protéine d'intérêt, un anticorps secondaire biotinylé, des conjugués streptavidine-HRP et DAB comme substrat chromogène et est de nature semi-quantitative. c: La pré-incubation du lysat cellulaire avec des inhibiteurs permet aux petites molécules de se lier à leurs protéines cibles apparentées dans le lysat. Seuls certains de ces composés inhibent potentiellement la liaison à l'ADN de leurs protéines cibles (illustrées par une croix jaune). : Les différents résultats possibles du dosage DBID pour l'inhibition des interactions CGGBP1-ADN sont représentés. L'inhibition directe de CGGBP1 (cercle noir avec une croix) ainsi que l'inhibition d'une protéine de liaison (cercle bleu avec une croix) nécessaires à la liaison CGGBP1-ADN devraient entraîner un « pas de signal ». Les inhibiteurs qui n'ont aucun effet direct ou indirect sur l'interaction CGGBP1-ADN montrent « Signal »

Des lysats ont été préparés à partir de cellules HEK293T comme décrit dans les méthodes. Les protéines dans les lysats ont été pré-incubées avec les composés de la banque à une concentration uniforme de 100 M (ou 0 M comme contrôle négatif pour l'inhibition) (Fig. 1c). Par la suite, les mélanges lysat-inhibiteur ont été incubés avec les dot blots dans un tampon de liaison pendant 90 min à 4 °C. Les dot blots ont été lavés dans du PBS et réticulés en utilisant du formaldéhyde à 4 %. Les complexes ADN-protéine fixés sur les dot blots ont été sondés avec un anticorps anti-CGGBP1 primaire suivi d'une détection immunohistochimique (Fig. 1d). Pour la détection à l'échelle de la bibliothèque, les dot blots ont été incubés en série avec un anticorps secondaire biotinylé, un conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) et un substrat chromogène HRP qui comprenait du peroxyde d'hydrogène. Les signaux ont été évalués visuellement pour sélectionner des inhibiteurs puissants. Pour un criblage supplémentaire d'un panel de hits primaires à partir du criblage de la bibliothèque, des anticorps secondaires conjugués à HRP ont été utilisés directement suivis d'une détection chimioluminescente. Les signaux sur les dot blots secondaires ont été quantifiés par densitométrie d'images inversées des blots.

Dans un premier temps, nous nous sommes assurés que la détection était spécifique en utilisant des contrôles négatifs. Le signal chromogène détecté sur les dot blots à l'aide de l'anticorps anti-CGGBP1 était spécifique car le signal était réduit à un bruit de fond faible lorsque l'anticorps primaire était remplacé par un IgG ou un sérum de contrôle isotypique. De même, le remplacement du lysat par le tampon de blocage a diminué le signal.

Écran de bibliothèque pour l'identification des inhibiteurs de CGGBP1 à l'aide de DBID

Pour identifier les inhibiteurs de l'interaction CGGBP1-ADN, nous avons pré-incubé les lysats de cellules HEK293T avec des inhibiteurs d'une bibliothèque de composés bioactifs avant de permettre la capture de complexes protéiques par dot blots liés à l'ADN. La pré-incubation avec tout composé qui a réussi à inhiber les interactions ADN-CGGBP1 entraînerait un signal plus faible en utilisant un anticorps anti-CGGBP1 par rapport à une inhibition fictive (uniquement le tampon de dilution du composé) (Fig. 2a). Le lysat a été incubé avec chaque composé séparément à une concentration finale de 100 µM. La nature parallèle de l'incubation composé-protéine dans ce protocole a rendu pratique l'utilisation d'une seule concentration pour tous les composés de la bibliothèque. Comme l'inhibition de la liaison à l'ADN nécessite des concentrations de médicament plus élevées [22], nous avons opté pour une concentration de 100 M pour l'ensemble de la bibliothèque de criblage. Étant donné que cette concentration était uniquement pour le criblage in vitro, où les hits seraient soumis à des expériences de vérification, nous avons choisi cette concentration. Ainsi, le choix d'une concentration chimique de 100 M était susceptible d'éliminer les faux négatifs alors que les expériences de vérification ultérieures pour les résultats de l'écran à des concentrations plus faibles nous permettraient d'éliminer les faux positifs. La majorité des composés de la bibliothèque n'ont montré aucune inhibition de la liaison CGGBP1-ADN, alors qu'un sous-ensemble de composés présentait une inhibition modérée à forte de la liaison CGGBP1-ADN (Fig. 2b et c). Les 1685 dot blots, un pour chaque composé de la bibliothèque, ont été classés en trois groupes : aucune inhibition pour 1554 composés (signaux forts et cohérents comparables à l'inhibition fictive), inhibition modérée pour 20 composés (signal relativement plus faible par rapport à l'inhibition fictive), et une forte inhibition pour 11 composés (signaux négligeables à très faibles par rapport à l'inhibition fictive) (Fig. 2b). Pour 100 composés, le test n'a pas été concluant et nous les avons éliminés de l'analyse.

Le criblage DBID d'une bibliothèque chimique de petites molécules (1685 composés) identifie des inhibiteurs de l'interaction CGGBP1-ADN. une: Le test DBID primaire a été réalisé dans plusieurs plaques à 96 puits. Le lysat a été pré-incubé individuellement avec les composés (un composé par puits). Après transfert des complexes lysat-composé (comme indiqué sur la figure 1c) sur des dot blots (comme indiqué sur la figure 1a), une détection immunochimique a été réalisée en utilisant un cocktail d'anticorps primaire de lapin anti-CGGBP1. Le schéma représente les signaux obtenus pour une plaque 96 puits. b: Les dot blots de l'ensemble de l'écran de la bibliothèque pour CGGBP1 ont été classés manuellement en 11 inhibiteurs forts et 20 inhibiteurs modérés. Les images réelles de ces deux groupes de dot blots sont montrées ici avec les contrôles positifs et négatifs comme indiqué. Les identités des inhibiteurs sont les suivantes : inhibiteurs puissants [A1-Givinostat (ITF2357), A2-LRRK2-IN-1, A3-Peficitinib (ASP015K, JNJ-54781532), B1-Ispinesib (SB-715992), B2-TWS119 , B3-Dompéridone, C1-Gallamine Triéthiodide, C2-Moxifloxacine HCl, C3-Sirtinol D1-NAD+, D2-Palbociclib (PD-0332991) HCl], Inhibiteurs modérés [A5-VX-661, A6-BRD73954, A7-NCT- 501, A8-Tenovin-1, A9-Prasugrel, B5-U0126-EtOH, B6-Foretinib (GSK1363089), B7-JNJ-7706621, B8-CHIR-99021 (CT99021), B9-Asénapine maléate, C5-Ethylparaben, C6 -LY2874455, C7-Golgicide A, C8-PD173955, C9-Mirin, D5-Ramelteon, D6-Cilnidipine, D7-Dopamine HCl, D8-VR23, D9-AZD3759]. La majorité des composés de la bibliothèque n'ont montré aucune inhibition de l'interaction CGGBP1-ADN. Trente dot blots représentatifs des non-inhibiteurs sont indiqués dans les numéros de puits F1-F10, G1-G10, H1-H10. c: Les signaux des dot blots représentés en B sont quantifiés par densitométrie. Le graphique montre les signaux des images inversées pour chaque dot blot

Bien que nous ayons pu identifier certains inhibiteurs de l'interaction CGGBP1-ADN, il est resté difficile de savoir si l'inhibition était directe ou indirecte. Nous avons poursuivi les inhibiteurs identifiés dans ce criblage principal pour détecter les inhibiteurs directs des interactions CGGBP1-ADN.

Application du DBID pour identifier les inhibiteurs directs de CGGBP1

Pour identifier les inhibiteurs directs de la liaison CGGBP1-ADN, la prochaine série d'expériences a été réalisée sur CGGBP1 recombinant (rCGGBP1) contenant une étiquette FLAG C-terminale et un panel d'inhibiteurs disponibles identifiés dans le criblage primaire. Les dot blots ont été bloqués avec un tampon de blocage. De même, au lieu des lysats, rCGGBP1 a été incubé pendant 30 min avec les inhibiteurs (100 M) identifiés à partir du criblage primaire. Le mélange d'inhibiteurs de rCGGBP1 a été incubé avec les dot blots bloqués et sondé avec des anticorps anti-FLAG ou anti-CGGBP1 suivis d'une incubation d'anticorps secondaires conjugués à HRP et d'une détection de signal chimiluminescent (Fig. 3a et b) (données brutes dans les fichiers supplémentaires 1, 2, 3, 4, 5 et 6). Les signaux ont été quantifiés et analysés par densitométrie (Fig. 3c). Les inhibiteurs utilisés dans ce test DBID secondaire pourraient à nouveau être classés comme ayant (i) une inhibition directe faible ou indétectable (Palbociclib, BRD73954, Peficitinb, LRRK2-IN-1 et Ispinesib) ou (ii) une inhibition modérée (Sirtinol et Tenovin-I ). Un seul composé, Givinostat, présentait une forte inhibition de l'interaction rCGGBP1-ADN (Fig. 3c).

Givinostat agit comme un inhibiteur direct spécifique de l'interaction rCGGBP1-ADN in vitro. A et B : DBID utilisant l'anti-FLAG (une) ou des anticorps anti-CGGBP1 (b) contre rCGGBP1 pré-incubé avec des composés comme indiqué montrent une inhibition directe par Givinostat. Les multiples dot blots par composé sont des répliques techniques. c: Quantification des signaux obtenus à partir des dot blots de criblage secondaire (b) sont tracés. D : Les signaux densitométriques du dosage DBID pour CGGBP1 utilisant des concentrations plus faibles de Givinostat ne montrent aucune inhibition à des concentrations inférieures à 100 M. e: La pré-incubation de rCGGBP1 avec Givinostat réduit la quantité d'ADN Alu co-précipitant avec l'anticorps FLAG de 70 à 80 %. F: Une quantification relative δδCt normalisée en entrée de l'ADN de la puce CGGBP1 provenant de cellules HEK293T traitées avec 2 M de Givinostat ou DMSO pendant les durées indiquées montre une inhibition de l'occupation de CGGBP1 aux éléments Alu par Givinostat. g: Le test DBID pour les protéines nucléaires extraites à l'acide en utilisant l'anticorps anti-histone H3 total ne montre aucune inhibition de la liaison à l'ADN de l'histone H3 par Givinostat. h: Les signaux DBID (arrière-plan soustraits et normalisés pour les signaux IgG) pour les H3K4me3, H3K9me3 et l'histone totale H3 ne montrent aucun changement significatif dû à 100 M de Givinostat. je et j: qPCR sur CTCF et H3K4me3 ChIP-DNA montrent que H3K4me3 est significativement augmenté au niveau des éléments Alu (je) alors que l'occupation du CTCF sur un site de liaison au CTCF régulé par le CGGBP1 est significativement diminuée (j) par traitement Givinostat. * indique Mann-Whitney p-valeur < 0,05 ns représente p-valeur > 0.05. k: L'analyse de la fraction nucléaire-cytoplasmique de cellules HEK293T simulées ou traitées par Givinostat a montré que les niveaux nucléaires de CGGBP1 et d'histone H3 restent inchangés lors du traitement par Givinostat. GAPDH sert de contrôle de charge pour la fraction cytoplasmique. je: Une comparaison de l'ADN génomique traité par Givinostat ou DNaseI montre que Givinostat ne provoque pas la dégradation de l'ADN tandis que DNaseI digère l'ADN en fragments de faible poids moléculaire et augmente le frottis de faible poids moléculaire

Pour établir l'effet de concentrations plus faibles de Givnostat sur l'interaction CGGBP1-ADN, le dosage a été refait sur une série de concentrations de Givnostat (10 M, 1 M, 0,1 M, 0,01 M et 0,001 M). Des concentrations inférieures à 100 M n'ont pas donné d'inhibition détectable dans DBID (Fig. 3d) (données brutes dans le fichier supplémentaire 7). Cependant, cela pourrait être dû en partie à une faible plage dynamique des signaux DBID.

Vérification de l'inhibition de l'interaction CGGBP1-ADN par Givinostat

Nous avons ensuite vérifié l'inhibition de l'interaction rCGGBP1-ADN en utilisant une approche alternative. L'ADN Alu est un site de liaison puissant pour CGGBP1 et les interactions entre l'ADN Alu et CGGBP1 ont été démontrées plus tôt in vitro ainsi qu'in vivo [32].

Nous avons effectué une immunoprécipitation in vitro de l'ADN Alu en utilisant rCGGBP1 avec ou sans inhibition par Givinostat. La différence dans la quantité d'ADN Alu immunoprécipité en utilisant le rCGGBP1 inhibé par simulation ou le CGGBP1 inhibé par Givinostat a été quantifiée par PCR en temps réel (Fig. 3e). En utilisant la quantité d'ADN Alu d'entrée comme contrôle, nous avons pu établir que Givinostat est un puissant inhibiteur direct de l'interaction ADN CGGBP1-Alu.

De plus, l'inhibition de l'interaction CGGBP1-ADN par Givinostat a été validée par la ChIP-qPCR pour les sites de liaison de CGGBP1. La puce a été réalisée pour CGGBP1 sur des cellules HEK293T traitées avec 2 M de Givinostat à différents moments (6 h et 24 h). Givinostat a provoqué une inhibition de la liaison CGGBP1-ADN comme le montre l'amplification ChIP-qPCR pour Alu à 6 h par rapport à 0 h (simulation inhibée, DMSO). Cette inhibition a été significativement augmentée lors du traitement des cellules avec Givinostat pendant 24 h (Fig. 3f).

Pour tester rigoureusement les limites du dosage DBID, nous devions tester le protocole sur la liaison à l'ADN d'une protéine présumée non inhibée par Givinostat. Nous avons choisi d'appliquer DBID sur l'histone H3 et ses formes modifiées post-traductionnellement H3K9me3 et H3K4me3. Bien que les histones H3 et CGGBP1 soient des protéines non apparentées, elles ont toutes deux des poids moléculaires comparables et se lient au motif d'ADN indépendamment du motif. De plus, H3K9me3 et H3K4me3 sont régulés différemment par la déplétion en CGGBP1 dans les cellules HEK293T [41]. Ainsi, nous avons comparé les résultats avec les tests ChIP-qPCR sur H3K4me3 et CTCF, une protéine cible connue de CGGBP1 [41].

Le test DBID utilisant un anticorps total contre l'histone H3 contre les protéines extraites à l'acide de noyaux purifiés a montré que Givinostat n'inhibait pas la liaison à l'ADN de l'histone H3 (Fig. 3g) (données brutes dans les fichiers supplémentaires 8 et 9). Une analyse similaire avec H3K4me3 et H3K9me3 et sa comparaison avec l'histone H3 totale a montré que Givinostat n'inhibait pas la liaison à l'ADN de ces formes d'histone H3 (Fig. 3h) (données brutes dans le fichier supplémentaire 10). Bien que certaines répétitions techniques du test H3K4me3 DBID aient montré une grande variation du signal DBID, aucune d'entre elles n'était significative (test de Mann-Whitney p > 0,05). Des puces pour CTCF ou H3K4me3 suivies de qPCR ont été utilisées pour tester si, dans les cellules HEK293T, une inhibition de CGGBP1 par Givinostat pouvait imiter les effets déjà connus de l'épuisement de CGGBP1 par shRNA. Le traitement par Givinostat n'a pas affecté l'occupation du CTCF mais a significativement augmenté les niveaux de H3K4me3 aux éléments Alu (Fig. 3i). Inversement, sur un site de liaison CTCF dépendant de CGGBP1 nouvellement déterminé auquel H3K4me3 n'est pas affecté par l'épuisement de CGGBP1, nous avons pu établir que le traitement par Givinostat réduisait l'occupation du CTCF sans aucun changement significatif des niveaux de H3K4me3 (Fig. 3j).

Les analyses Western-blot des fractions nucléaires et cytoplasmiques de cellules HEK293T simulées ou traitées par Givinostat ont montré que les niveaux de CGGBP1 dans la fraction nucléaire n'étaient pas réduits en raison du traitement par Givinostat (Fig. 3k) (données brutes dans les fichiers supplémentaires 11 et 12) . De même, les niveaux d'histone totale H3 ou H3K4me3 dans la fraction nucléaire n'ont pas été affectés par le traitement Givinostat (Fig. 3k). Ainsi, la réduction de l'occupation de CGGBP1 aux éléments Alu, l'occupation du CTCF aux sites de liaison CTCF régulés par CGGBP1 et une augmentation de H3K4me3 aux éléments Alu n'étaient pas dues à des changements dans les distributions subcellulaires de ces protéines. De plus, nous nous sommes également assurés que l'inhibition induite par Givinostat de la liaison à l'ADN observée dans les tests DBID et les IP d'ADN in vitro n'était pas due à la dégradation de l'ADN. L'ADN génomique de haut poids moléculaire des cellules HEK293T a été incubé avec Givinostat (pour imiter les conditions d'incubation DBID) ou DNaseI (contrôle positif pour la digestion de l'ADN). Alors que la DNaseI a digéré l'ADN et généré un frottis de faible poids moléculaire, aucune dégradation de l'ADN n'a été observée par incubation avec Givinostat (Fig. 31) (données brutes dans le fichier supplémentaire 13).


DISCUSSION

L'indice que l'épuisement de la frataxine pourrait être lié à la synthèse de la vitamine D est venu de données [49] révélant que, sur un modèle cellulaire humain de cellules de la granulosa, l'épuisement de la frataxine a entraîné une synthèse déficiente des stéroïdes (progestérone). Dans ce processus mitochondrial, l'adrénodoxine (ferredoxine) transfère des électrons d'une réductase au cytochrome correspondant CYP11A1, pour la conversion du cholestérol en prégnénolone. Fait intéressant, la ferredoxine est également le lien entre la ferredoxine réductase (FDXR) et le CYP27B1 pour l'étape finale de la synthèse du calcitriol, une réaction qui a lieu dans les mitochondries [50]. De plus, il a déjà été décrit que la ferredoxine interagit physiquement avec la frataxine [36]. Dans ce contexte, la possibilité que la déplétion en frataxine puisse avoir un impact sur les enzymes de la voie de biosynthèse du calcitriol et les effets en aval, nous amène à analyser les effets de la supplémentation de ce composé sur les cellules déficientes en frataxine.

Les résultats présentés ici révèlent que les niveaux de FDX1 sont significativement inférieurs à ceux trouvés dans les neurones DRG normaux ou dans les cellules lymphoblastoïdes FA (Figs, 1 et S1), soutenant ainsi le raisonnement selon lequel la supplémentation en calcitriol devrait être en mesure de récupérer la survie cellulaire après l'épuisement de la frataxine. Bien que nous soyons conscients que l'explication sur la façon dont la carence en frataxine entraîne une diminution des niveaux de FDX1 reste à élucider, une carence en protéines contenant des clusters Fe/S a été observée dans plusieurs modèles de la maladie [51,52]. Néanmoins, d'autres explications sont possibles : il serait envisageable que cette protéine soit la cible de protéases mitochondriales activées par le calcium, du fait du déséquilibre calcique survenant après le déficit en frataxine rapporté ici (Fig. 3). En outre, il faut garder à l'esprit que la carence en frataxine est connue pour provoquer un stress oxydatif [53] et que les protéines du cluster Fe/S sont sujettes aux dommages oxydatifs et à la dégradation [54,55]. Pour cette raison, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la récupération induite par le calcitriol des niveaux de FDX1 puisse être favorisée par des défenses antioxydantes accrues, car il est bien connu que le calcitriol déclenche une telle réponse. En fait, les deux effets peuvent agir en synergie sur la récupération des quantités de FDX1.

Le rôle bénéfique du calcitriol dans les maladies neurodégénératives a été rapporté dans la maladie d'Alzheimer en réduisant les niveaux de protéine bêta-amyloïde [56,57] ou en diminuant les événements neurotoxiques dans des modèles animaux de la maladie de Parkinson [58]. La vitamine D contribue également à la neuroprotection [59] et prévient le déclin cognitif dans le cerveau âgé [60]. Il est important de mentionner que le VDR, le récepteur intracellulaire du calcitriol, a été détecté dans les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes, soulignant l'importance que le VDR et le calcitriol peuvent jouer sur le développement du cerveau [61,62]. De plus, la présence de CYP27B1 dans plusieurs types cellulaires du cerveau, notamment les cellules endothéliales, la microglie, les neurones et les astrocytes [63], suggère que la synthèse du calcitriol pourrait être un facteur in situ processus dans le système nerveux central.

Les résultats révèlent également que le calcitriol est capable d'inverser les marqueurs cellulaires altérés que nous avons décrits dans des articles précédents, tels que les niveaux de NCLX. La restauration des niveaux de NCLX par traitement au calcitriol est un résultat pertinent (Fig. 3A et B) car cette protéine est essentielle pour maintenir le bon équilibre sodium/calcium dans les mitochondries [41,64] de plusieurs types cellulaires tels que les neurones, les lymphocytes, le pancréas. cellules bêta, cardiomyocytes [43]. Dans les neurones nociceptifs, le NCLX a un rôle fondamental en raison de sa coordination avec les canaux TRPV1 [65] l'inhibition de l'échangeur et le déséquilibre calcique ont été décrits dans une forme familiale de la maladie de Parkinson [66] de plus, le NCLX a été lié à l'hypertrophie cardiaque [ 45] et impliqué dans la sécrétion d'insuline [67-69]. La raison pour laquelle cet échangeur présente des niveaux réduits dans les cellules déficientes en frataxine n'est pas bien comprise, mais cela pourrait être lié aux protéases activées par le calcium puisque, comme indiqué dans un article précédent [34], BAPTA a pu restaurer partiellement la NCLX à des niveaux normaux. Dans ce contexte, nous avons récemment montré que les inhibiteurs de la calpaïne tels que le MDL28170 et la calpeptine, entraînent une restauration partielle des niveaux de NCLX dans les neurones DRG déficients en frataxine et la réduction des niveaux de calpaïne 1 entraîne une neuroprotection [47]. De plus, comme récemment publié [13], des altérations du potentiel membranaire mitochondrial peuvent avoir un impact négatif sur la fonction NCLX. Étant donné que nous avons observé que les DRG montrent une altération Ψm, cela pourrait affecter l'activité des quantités restantes de NCLX, aggravant ainsi l'homéostasie du calcium mitochondrial.

La principale raison pour laquelle le calcitriol pourrait exercer ces effets bénéfiques sur les cellules déficientes en frataxine est l'augmentation observée des niveaux de frataxine dans plusieurs types cellulaires. Les résultats montrés dans les neurones DRG (Fig.2) ont été corroborés par les augmentations observées dans les lignées cellulaires lymphoblastoïdes dérivées de patients AF (Fig, S2). Pour compléter davantage ces résultats, nous avons fourni des données supplémentaires montrant que la frataxine est induite de manière significative par le calcitriol dans les cardiomyocytes déficients en frataxine (Fig.S3). Dans ce modèle cellulaire, le calcitriol exerce également des effets bénéfiques sur les marqueurs altérés, tels que l'accumulation de gouttelettes lipidiques et l'hypertrophie des mitochondries (Fig. S4). Ces effets de restauration dans les myocytes cardiaques sont attribuables à la récupération des quantités de frataxine et à l'amélioration des fonctions mitochondriales, mais un effet direct du calcitriol sur l'augmentation de la voie d'oxydation bêta pourrait également être considéré comme suggéré par les résultats décrits dans les adipocytes 3T3-L1 [70]. De plus, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que le calcitriol contribue à prévenir l'accumulation de gouttelettes lipidiques [71].

Bien que le mécanisme par lequel la supplémentation en calcitriol entraîne une augmentation des quantités de frataxine dans les modèles cellulaires testés nécessite une étude plus approfondie, une possibilité raisonnable serait que le calcitriol puisse augmenter la transcription du gène de la frataxine. À l'appui de cette notion, il convient de mentionner que les analyses in silico du promoteur du gène de la frataxine sur la base de données EPDnew (https://epd.epfl.ch//index.php), révèlent la présence de motifs de liaison VDR prédits dans la région promotrice du gène de la frataxine. En fait, à partir de ces données, la région promotrice humaine du gène de la frataxine contient cinq régions aux positions -812, -543, -497, -321, -282 du site de démarrage de la transcription (TSS) avec une coupure (p- valeur) de 0,001. Cette valeur est du même ordre de grandeur que celles retrouvées pour des gènes cibles très connus du VDR : gènes liés à l'homéostasie calcique comme la parvalbumine, l'échangeur de calcium NCX1 (SLC8A2-2) ou liés à des gènes de défense antioxydante comme la glutathion peroxydase, ou NRF2 (NFE2L2-4) pour n'en citer que quelques-uns [24,28]. Il est intéressant de rappeler que NRF2, à son tour, active la transcription de gènes antioxydants et détoxifiants tels que la catalase, les superoxyde dismutases ou la thiorédoxine réductase [72]. Dans ce contexte, les effets bénéfiques du calcitriol, en tant qu'inducteur naturel de NRF2, sont en accord avec l'une des thérapies émergentes de l'AF qui repose sur l'activation de NRF2 dont le sulforaphane [73], le dimethyl fumarate [74] ou l'omaveloxolone [75, 76].

Bien que nous ne puissions pas encore expliquer pourquoi l'épuisement de la frataxine entraîne une baisse des niveaux de FDX1, l'effet du calcitriol sur la restauration de ses quantités pourrait être (i) une conséquence de la récupération des niveaux de frataxine, (ii) l'activation des défenses antioxydantes qui, en conséquence, seraient protéger FDX1 des dommages oxydatifs et de la dégradation, (iii) augmenter l'expression de FDX1 directement induite par le calcitriol comme indiqué [77] ou une combinaison des trois. En fait, dans les neurones DRG normaux, nous avons trouvé une induction (1,5 à 2 fois) de FDX1 par le calcitriol (données non présentées) qui serait indicative d'un effet génomique concernant l'expression du gène FDX1. Des expériences futures seront nécessaires pour clarifier ce point. Néanmoins, à partir des résultats fournis dans cet article, on peut conclure que le calcitriol pourrait être envisagé pour les patients AF car le cadre thérapeutique ainsi que les effets secondaires sont très bien connus permettant un test de dosage facile.


CD36 est une protéine transmembranaire présente dans de nombreux tissus qui est censée faciliter le transport des acides gras vers l'intérieur. Le Western blot est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer la teneur en protéines CD36 des tissus, mais elle prend du temps, est techniquement exigeante et semi-quantitative. Pour mesurer plus précisément la teneur en CD36 du tissu adipeux, nous avons développé un dosage immuno-enzymatique (ELISA) après avoir établi que : 1) les anticorps anti-CD36 ont donné une seule bande distincte sur les Western blots traditionnels, et 2) la grande majorité des adipocytes CD36 réside dans la membrane plasmique. En utilisant des dilutions en série de chaque échantillon et en incluant un échantillon d'étalonnage et un échantillon de contrôle qualité sur chaque plaque, nous avons pu atteindre une variabilité inter- et intra-essai de ∼ 10 %. Nous avons constaté que la teneur en CD36 dans le tissu adipeux sous-cutané de l'épiploon et de l'abdomen variait de 2 à 5 fois selon les moyens d'expression des données (par unité de protéine tissulaire, de poids ou de lipide). La teneur en CD36 de l'épiploon chez les femmes a nettement diminué (P = 0,01) en fonction de la taille des cellules graisseuses. Pour la plupart, la teneur en CD36 des tissus n'était pas corrélée avec l'ARNm de CD36. Cette méthode ELISA pour la teneur en CD36 des tissus devrait améliorer la recherche sur le rôle de cette protéine sur l'absorption des acides gras par les tissus.

Soutenu par les subventions DK45343, DK40484 et DK50456 du US Public Health Service, 7-07-DCS-03 de l'American Diabetes Association et par la Mayo Foundation.

L'adresse actuelle de A. H. Ali est la Direction de l'endocrinologie clinique, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, Bethesda, MD.


Mots clés

Abréviations : Alix, gène X CC lié à l'apoptose, coiled coil CD2BP3, protéine de liaison CD2 3 CIN85, protéine d'interaction Cbl de 85 kDa EGFR, récepteur du facteur de croissance épidermique GST, glutathion-S-transférase IP, MAb par voie intrapéritonéale, anticorps monoclonal PBS, solution saline tamponnée au phosphate PI3K, phosphatidylinositol 3 kinase Ruk, régulateur de la kinase universelle SB1, SETA liant la protéine 1 SETA, domaine SH3, encodage du domaine SH3, exprimé dans les astrocytes tumorigènes SH3, src homologie trois WB, Western tache.


Fond

En plus des forces mécaniques physiologiques lors de la déglutition, de la parole ou de la mastication, le ligament parodontal (PDL) et ses cellules en tant que partie du parodonte, c'est-à-dire l'appareil de maintien de la dent, est exposé à des forces appliquées thérapeutiquement, qui visent le mouvement dentaire orthodontique [1]. Le PDL est un tissu conjonctif mou spécialisé aux propriétés viscoélastiques, composé principalement de fibroblastes et de matrice extracellulaire (MEC) [2], parmi lesquels les fibres de collagène de type I de Sharpey facilitent l'ancrage de la dent dans l'os alvéolaire [3].

Les forces mécaniques qui interfèrent avec le parodonte s'adressent d'abord à l'ECM du PDL, impliquant ainsi les fibroblastes du PDL (PDLF), puisque les cellules sont reliées à l'ECM par des intégrines [4]. Les intégrines en tant qu'hétérodimères consistent en des combinaisons de chaînes α/β de promiscuité, par ex. αvβ1 ou αvβ3, facilitant les interactions cellule-matrice passant par la formation de contacts focaux, qui sont localisés au niveau des sites d'adhésion focale [5]. Les intégrines en tant que molécules transmembranaires interconnectent le microenvironnement extracellulaire du PDLF avec leurs protéines cytoplasmiques et sont donc des mécano-capteurs ou des mécano-percepteurs, essentiels pour la conversion des signaux mécaniques en signaux biochimiques [6]. Ceci est réalisé en transposant le signal externe à des molécules mécano-transductrices, co-localisées avec les intégrines dans le complexe d'adhésion focale [7]. L'une des molécules clés de la mécano-transduction est la kinase d'adhésion focale FAK/p125 FAK qui est activée par phosphorylation à 6 à 8 résidus de tyrosine lors de l'engagement des intégrines de contact focales par les ligands de l'ECM [8]. Dans des études antérieures sur le PDLF, nos propres résultats ont révélé que FAK/p125 FAK semble être mécano-sensible, car son activité était modulée en réponse à la souche [9]. D'autres molécules qui sont des acteurs clés dans la transduction du signal et localisées en aval de FAK sont les MAP-kinases ERK1 et 2, également connues sous le nom de p42/44, et la kinase de stress p38 [10, 11]. Les résultats récemment publiés s'ajoutent aux preuves croissantes que ces kinases ne sont pas seulement les pierres angulaires de la transduction du signal, c'est-à-dire la médiation des signaux de la membrane plasmique vers le noyau lors de la formation d'un complexe facteur de croissance spécifique-ligand, mais également d'importance égale concernant la mécano- transduction. Ceci est illustré dans une étude sur les myocytes qui a démontré qu'ERK est rapidement activé lors de la souche et que la kinase de stress p38 semble être le partenaire de diaphonie d'ERK dans le contexte biologique de la modulation et de la différenciation du phénotype des myocytes [12].

Ainsi, à contribution égale, la transduction signal/mécano-cytoplasme membrane plasmique conduit à l'activation de facteurs de transcription précédant le transport du signal dans le noyau [13], qui sont responsables de la transcription des gènes signal/mécano-senseurs. Parmi la pléthore de facteurs de transcription, c-fos a été identifié comme mécano-sensible [14-16].Conjointement avec c-jun, c-fos se forme au facteur de transcription AP-1, ce dernier localisé sur le promoteur de la métalloprotéinase matricielle (MMP) 13 [17]. Les MMP, telles que la MMP-13 qui a une large gamme de substrats comprenant divers collagènes, fibronectine et protéoglycanes, sont responsables du clivage des molécules de l'ECM dans des conditions physiologiques. De ce fait, ils contribuent non seulement à l'homéostasie de la MEC, mais également à des situations thérapeutiques ou pathologiques. Concernant la situation thérapeutique, le mouvement dentaire orthodontique induit par des forces mécaniques s'accompagne non seulement d'un remodelage parodontal incluant une résorption et une formation osseuses aux sites de pression et de tension, respectivement, mais aussi avec un remodelage de la MEC [18]. À l'état stable de l'ECM, l'homéostasie est reflétée par l'équilibre de la synthèse et de la dégradation de l'ECM, tandis que la dégradation devient à son tour équilibrée par l'expression et l'activation des MMP, qui sont contrecarrées par leurs inhibiteurs tissulaires spécifiques, appelés TIMP [19].

Dans la présente étude, nous montrons que l'une des réponses cellulaires à la contrainte mécanique est illustrée par la modulation de l'expression de la forme activée de MMP-13, qui au niveau mécanistique est régie par l'activité des MAP- et des kinases de stress p42/ 44 et p38, respectivement.


REMERCIEMENTS

Les auteurs sont reconnaissants aux autres membres du laboratoire Boletta pour les discussions utiles et en particulier au Dr Roberto Pagliarini pour son aide avec les graphiques et l'analyse statistique. Cette recherche a été financée par la Fondation PKD US (PKD-218G18A), l'Association italienne pour la recherche sur la PKD (AIRP). Les auteurs remercient le Dr S. Bramani pour son soutien continu.

L'assistance technique a été fournie par : l'Advanced Light and Electron Microscopy BioImaging Center (ALEMBIC), établi par l'Institut Scientifique de San Raffaele et l'Université Vita-Salute San Raffaele, pour les analyses d'imagerie, en particulier C. Panzeri pour l'imagerie MET et V. Berno pour l'imagerie de fluorescence le projet intra-muros de la clinique souris Ospedale San Raffaele pour le support technique, en particulier A. Fiocchi pour l'analyse histologique et M. Raso du laboratoire de chimie clinique et d'hématologie murine pour les analyses hématologiques.


Voir la vidéo: Luvut prosenteiksi (Janvier 2022).