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Knockout et knockdown du gène


Par curiosité, j'ai eu cette question de savoir si la suppression (suppression) d'un gène d'un côté et la suppression (ARNi) du même gène de l'autre côté affecteront la cellule de la même manière ou non.

Si non pourquoi ? Si oui, est-il appliqué à chaque gène ?

Assommer d'un gène correspondra à une absence d'expression (délétion du gène) dans la cellule, ce qui peut être approprié pour confirmer la spécificité fonctionnelle, pour observer des processus qui sont affectés en son absence et quelques autres processus qui compensent l'absence du gène.

Abattre d'un gène entraînera un défaut d'expression en diminuant le niveau du transcrit (mRNA silencing).

Maintenant, les points sur lesquels je m'interroge sont :

  1. aucune présence d'ARNm et un ARNm réduit au silence créeront deux environnements différents pour la cellule à traiter ou non.
  2. si la quantité totale de transcrit doit être ciblée pour avoir le même phénotype que le gène knock-out.

C'est une série de questions fascinantes. La seule que je puisse commenter est la suivante : KD est-il qualitativement similaire à KO ?

Ma réponse est : parfois oui, en général non. Pour comprendre pourquoi, j'aime penser à un tracé hypothétique du "phénotype d'intérêt" sur l'axe des y, et de l'"expression du gène" sur l'axe des x. Vous pouvez imaginer que ce graphique pourrait être monotone, c'est-à-dire que le phénotype augmente ou diminue continuellement à mesure que l'expression augmente. Ou il est également possible que cette parcelle contienne un ou plusieurs minima ou maxima. Un exemple de KD donnant des résultats différents de KO concerne les gènes essentiels. S'ils sont assommés, ils tuent bien sûr l'organisme. Cependant, il peut y avoir certains niveaux de knockdown de gène essentiel pour lesquels le phénotype est en fait augmenté par rapport au type sauvage !

Je partagerai égoïstement un de mes articles où j'ai observé quelque chose comme ça. Nous avons constaté que le knockdown ADH1 améliore la tolérance au butanol chez la levure, mais que le knock-out ADH1 était très préjudiciable à la tolérance au butanol. http://dx.doi.org/10.1007/s10295-015-1713-7


Naïvement, vous vous attendriez à ce qu'ils aient à peu près le même effet, mais en réalité, beaucoup de choses peuvent arriver. Le knock-out du gène peut induire une régulation positive compensatrice d'autres gènes et l'ARNi peut avoir des effets hors cible. Voir par ex. cet article "Compensation génétique induite par des mutations délétères mais pas des knockdowns de gènes" https://www.nature.com/articles/nature14580


Si je comprends bien KD, il s'agit d'une réduction significative de l'expression du gène (le gène est "down"), tandis que KO (dans un organisme homozygote/haploïde) n'entraîne aucune expression du gène (il est "out").

Citant Wikipédia :

Étant donné que l'ARNi peut ne pas totalement abolir l'expression du gène, cette technique est parfois appelée « knockdown », pour la distinguer des procédures de « knockout » dans lesquelles l'expression d'un gène est entièrement éliminée.


Knockout et knockdown de gène - Biologie

Résumé de l'article:

Knockout de gène : La technologie de ciblage de gène
Auteurs: S.P. Adhangale, N.S. Chavan
[email protected]

Le knock-out du gène (GO) est une technique génétique complétée par un outil biotechnologique, dans laquelle un organisme est conçu pour porter un gène qui a été rendu inopérant. Ces gènes sont connus sous le nom de knockouts utilisés pour attribuer une fonction à des gènes spécifiques ayant une fonction inconnue. Stratégie de knock-out de gène, outils de génétique inverse, utilisés pour déterminer la fonction de gènes cibles par technologie génique, mutagenèse et recombinaison homologue. La recombinaison homologue permet l'échange de gènesin vivo. Cette approche est couramment utilisée dans Arabidopsis pour annuler la fonction du gène. La technologie a été développée en premier lieu dans la levure Saccharomyces cerevisae. Dans une étude, un groupe de sociétés basées à Melbourne et d'autres sociétés japonaises Suntory ont essayé de développer la plus grande rose bleue du monde en 2008 grâce à la technologie RNAi, en fabriquant une rose avec un pigment bleu. Dans une autre étude, la souris knock-out a été signalée pour la première fois par recombinaison homologue. Les souris knock-out sont souvent utilisées comme armes pour étudier les produits génétiques et leurs fonctions.

introduction

La technologie de knock-out des gènes est un composant majeur de la boîte à outils de la génomique fonctionnelle, comprend un groupe de méthodes conçues pour abolir la fonction des gènes (c.-à-d. knock-out). La recombinaison homologue permet l'échange de gènesin vivo. La recombinaison homologue chez les plantes n'est rapportée que dans Physcomitrella patens.

Technologie de knock-out de gène

Un organisme dans lequel un seul gène de choix ou d'intérêt est soit activé, soit inactivé d'une manière qui laisse tous les autres gènes non affectés par la méthode de recombinaison homologue. Le knock-out du gène est une technique génétique dans laquelle un organisme est conçu pour porter des gènes inopérants. Ces organismes porteurs de tels gènes sont appelés organismes knock-out ou simples knock-out. La technique est opposée au gène knock-in. La suppression de deux gènes est connue sous le nom de double knock-out et de même les termes triple et quadruple knock-out pour décrire respectivement trois ou quatre gènes knock-out.

Procédure utilisée pour la technologie de knock-out de gène

  1. Knockout est accompagné d'une combinaison de techniques commençant dans le tube à essai avec un plasmide, un chromosome artificiel bactérien (BAC’s) ou une autre construction d'ADN.
  2. L'objectif est de créer des animaux transgéniques avec un gène altéré. Pour cela, les cellules souches embryonnaires sont génétiquement transformées et insérées dans les premiers embryons.
  3. Les animaux résultants avec un changement génétique dans les lignées germinales peuvent transmettre le knock-out du gène à la génération future

L'expression de l'insertion d'un élément d'ADN-T dans le génome dépend de la nature de l'ADN-T et de l'emplacement du point d'insertion.

La mutation “knock-out” comprend l'insertion d'ADN-T dans la région codante ou promotrice, ce qui perturbe complètement l'expression des gènes. La mutation knock-down comprend l'insertion d'ADN-T dans le promoteur ou 31 régions non traduites. Les mutations knock-on sont des mutations typiques dans lesquelles la construction d'ADN porte un promoteur constitutif, tel que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur. La mutation knock-about comprend l'insertion d'ADN-T dans le promoteur ou la région codante. L'insertion d'ADN-T de la plus mauvaise mutation entraînant des réarrangements chromosomiques. Par exemple. Arabidopsis

Arabidopsis g technologie ène knockout : découverte phénotypique

L'Arabidopsis Genome Initiative (TAGI) a commencé le séquençage du génome de la souche Columbia de Arabidopsis thaliana (1996) par International Collaboration en décembre 2000. Des amorces PCR spécifiques à la fois pour les gènes cibles et l'élément d'insertion sont utilisées.

Caractérisation des phénotypes knock-out

Analyse des lignes défonçables dans Arabidopsis ont cependant montré que DAG1 est impliqué dans le contrôle de la dormance des graines. Les plantes DAG1 ont déformé silice avec des graines qui germent plus tôt que la normale, ne nécessitent pas de lumière pour la germination. Les plantes sont des organismes sessiles qui ont développé de nombreux traits adaptatifs qui leur permettent de faire face aux traits biotiques et abiotiques.

Création de la première rose bleue au monde

Le CSIRO a développé la technologie ARNi sous licence par Florigene Ltd., une société de biotechnologie basée à Melbourne et faisant partie des sociétés japonaises Suntory (2008)

  1. Désactivez la production de pigment rouge - Vérifiez le gène de la rose DFR (dihydroflavnol réductase) produisant le pigment rouge en le faisant taire.
  2. Ouvrez la porte à la production de pigments bleus - Ouvert par insertion de gène (à savoir delphividin) gène de pensée. Cela a ouvert la porte à la production de pigment bleu dans la fleur de rose
  3. Produire un pigment bleu - Remplacer le gène DFR de la porte d'un iris, excellent dans la production de pigment bleu Le gène DFR de l'iris a été inséré dans la rose et ensuite une rose avec une fleur bleue a été produite Les pétales de rose sont modérément acides avec un pH de 4,5 Les fleurs bleues devraient être réalisables si les pétales de rose peuvent être rendu moins acide car l'acidité inhibe les pigments bleus
  4. La rose bleue est disponible en Australie depuis 1996.
  1. Ils permettent de tester la fonction spécifique d'un gène particulier et d'observer leur processus de régulation.
  2. Les protéines liées aux prions (PRP’s) sont une autre technologie de knock-out chez les animaux, y compris l'inactivation des gènes PRP

Par exemple. Encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), Scrapia etc.

Inconvénients du knock-out du gène

  1. Environ 15% des gènes knock-out développés sont mortels
  2. La suppression de gènes peut également ne pas produire de changement observable (par exemple chez la souris)
  3. La suppression de gènes pourrait éliminer une cible majeure de la réponse de rejet hyper aiguë et ainsi conduire au développement d'animaux servant de donneurs humains.
  1. Le knock-out est l'activité des gènes pour fournir des informations sur ce que le gène fait normalement.
  2. Son développement a été une avancée massive dans le domaine biomédical et pharmaceutique.
  3. La souris Knockout est un outil merveilleux utilisé pour étudier la fonction d'un gène spécifique.
  4. La rose bleue Florigene est doublement historique et la première rose au monde ayant le potentiel de produire des roses « vraiment bleues »


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Silençage génique médié par l'ARNi

Chez les eucaryotes supérieurs, le knockdown médié par l'ARNi est la stratégie la plus courante pour épuiser les cellules d'un produit génique d'intérêt. Cependant, l'ARNi n'arrête généralement pas complètement le gène. Essentiellement, de courtes molécules d'ARN double brin (environ 20 à 25 nucléotides) sont soit générées à partir de précurseurs formant des épingles à cheveux (shRNA) soit introduites de manière exogène (siRNA). Après traitement par Dicer, un ARN simple brin s'apparie avec un ARNm cible (Ketting, 2013). Selon l'organisme, le silençage génique induit par l'ARNi est effectué par les protéines Argonaute via la dégradation de l'ARNm ou l'inhibition de la traduction (Figure 1). Le résultat final est une régulation négative post transcriptionnelle de l'expression des gènes, sans changer le code génétique (Mittal, 2004). Certains ARN ou protéines fonctionnels restent et sont traduits à des niveaux inférieurs. Ainsi, la stratégie d'ARNi pour réduire la fonction des gènes est appelée &ldquoknockdown&rdquo. La fonction des gènes est réduite, mais pas éliminée.

Figure 1. Schéma général des voies ARNi. De Mittal (2004).


Activation vasculaire des cellules musculaires lisses

Antonella Cecchettini, . Lorenzo Citti , dans Revue internationale de biologie cellulaire et moléculaire , 2011

5.1.2 Technologie « Gene knock-down » et son application aux CMLV

Dans les modèles cellulaires cultivés ainsi que dans ex vivo recherches, les approches de « knock-down » du gène oligonucléotidique semblent plus appropriées car elles sont efficaces, rapides, bon marché et reproductibles. De plus, une grande population de cellules peut être ciblée par les véhicules non viraux qualifiés disponibles. Par conséquent, la technique de « knock-down » du gène peut permettre de multiples investigations parallèles répondant simultanément à des questions coordonnées.

Il existe de nombreux inhibiteurs d'oligonucléotides : antisens, siARN, ribozymes, leurres d'ADN, aptamères dont l'activité inhibitrice dépend de mécanismes assez différents. Alors que les antisens, les ARNsi et les ribozymes épuisent la fonction biologique par silençage génique dépendant de l'ARN, les leurres d'ADN agissent au niveau transcriptionnel en détournant les facteurs de transcription du site de liaison naturel ( Citti et al., 2002 ), et les aptamères similaires à les anticorps agissent sur le produit du gène en inhibant l'activité de la protéine ( Keefe et al., 2010 ).

Le silençage génique dépendant de l'ARN est l'approche la plus étudiée et la mieux établie. Il fonctionne sur la base d'interactions complémentaires en double hélice entre l'inhibiteur et l'ARN cible et opère dans le compartiment cytoplasmique le plus accessible. Le duplex oligonucléotide-ARNm déclenche un blocage fonctionnel de la traduction et altère la synthèse des protéines. Pour obtenir un effet inhibiteur approprié, deux conditions principales doivent être remplies, le site cible doit être accessible pour la liaison et sa séquence ne doit pas être partagée avec d'autres séquences d'ARNm. Ce dernier aspect est un problème crucial à prendre en compte lors de la conception d'oligonucléotides car il affecte la spécificité de la cible et empêche tout effet secondaire indésirable (Fig. 2.8).

Graphique 2.8. Silençage génique ARN-dépendant par différents inhibiteurs d'oligonucléotides. Oligonucléotides antisens sont des molécules simple brin à base d'ADN conçues pour cibler l'ARNm à épuiser en produisant un duplex hybride ADN/ARN. Ce tronçon hybride est capable de déclencher les ribonucléases RNaseH endogènes qui à leur tour clivent la fraction d'ARN abolissant la traduction. inhibiteurs de siARN sont des segments d'ARN double brin d'environ 20 paires de bases dont l'activité est médiée par la machinerie cellulaire globalement décrite comme une interférence ARN. Les siARN administrés de manière exogène sont incorporés dans un complexe RISC multiprotéique qui coopère à l'effet final en médiant l'alignement des oligonucléotides sur la séquence cible. Une fois la séquence cible capturée, une fraction nucléolytique du complexe RISC catalyse le clivage de l'ARNm déclenchant sa dégradation. Ribozymes endonucléolytiques sont des séquences d'ARN catalytiques capables de se lier et de cliver la séquence à cibler. Ils agissent en une seule étape sans l'intervention d'aucune machinerie cellulaire car ils possèdent leurs propres propriétés catalytiques intrinsèques. Le motif catalytique en tête de marteau est le ribozyme le plus étudié et le plus appliqué avec succès dans les applications de « knock-down » de gènes.

5.1.2.1 Applications de la technologie « knock-down » aux études VSMC

L'approche de knock-down de gène utilisée pour définir le rôle de facteurs spécifiques dans les voies d'activation des CMLV a été largement appliquée à in vitro aussi bien que in vivo des modèles. Dans un article paru en 1998 ( Morishita et al., 1998 ), un ribozyme sélectivement actif contre l'apolipoprotéine-A (apo-A) mais incapable d'affecter l'ARNm hautement homologue du plasminogène a été décrit. Parce qu'il a été rapporté que l'apo-A contribue à la prolifération des CMLV en inhibant la voie plasminogène/plasmine, les auteurs ont proposé l'administration de ribozyme comme stratégie thérapeutique pour l'athérosclérose alternative à l'aphérèse des LDL. Fait intéressant, l'administration locale intrastent d'un ribozyme chimérique adressé à l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), nécessaire à la progression du cycle cellulaire, a considérablement réduit la formation de néointima dans un modèle de resténose porcine (Frimermann et al., 1999). De nombreuses autres publications ont décrit l'utilisation de ribozymes pour cibler différents facteurs tels que Bcl-2, pour contrer l'hyperplasie et induire l'apoptose des CMLV dans la néo-intima (Perlman et al., 2000), et le TGF-β pour inhiber la prolifération des CMLV spontanément. des rats hypertendus et des cultures humaines stimulées par ANG-II (Su et al., 2000 Teng et al., 2000). La croissance exagérée des CMLV provenant de rats hypertendus spontanés a également été étudiée en ciblant le PDGF-A. Un ribozyme ADN/ARN chimérique adapté contre PDGF-A de rat a ciblé avec succès les CMLV de rats hypertendus spontanés en inhibant efficacement la prolifération cellulaire (Hu et al., 2001a). La même équipe de recherche a également développé le ribozyme humain homologue adressé au PDGF-A humain. Ils ont pu enregistrer une inhibition significative de la réplication des CMLV lors de l'administration de ribozyme même après des traitements de stimulation avec ANG-II ou TGF-β (Hu et al., 2001b). La réalisation de ribozymes actifs contre les facteurs de transcription cycline-E et E2F1 a été décrite. Cette approche concerne la cascade de signalisation proliférative où l'activation finale du facteur de transcription E2F1 régule la progression du cycle cellulaire en activant la cycline-E pertinente. L'activité des deux ribozymes a été testée et leur activité biologique évaluée dans des CMLV humaines cultivées ( Grassi et al., 2001 ).

Plus récemment, les chercheurs se sont concentrés sur l'utilisation d'ARNsi pour neutraliser les fonctions des gènes. Un article récent a décrit le rôle de la protéine kinase A (PKA) et du récepteur de la prostacycline sur la différenciation des CMLV dans les maladies cardiovasculaires. L'équilibre entre le thromboxane et la prostacycline est un facteur critique reconnu de la pathogenèse vasculaire, ce dernier représentant le phénotype contractile-quiescent. La cascade de signalisation, déclenchée par le récepteur de la prostacycline, active la PKA dont l'inhibition par l'administration de siRNA s'oppose au maintien du phénotype quiescent ( Fetalvero et al., 2006 ). L'apoptose est fréquemment déclenchée par les ROS également dans les CMLV. En analysant les bibliothèques d'expression d'ADNc, Tchivilev et al. identifié des gènes protecteurs putatifs. Parmi les clones VSMC résistants au stress oxydatif, ils ont trouvé la récurrence de la protéine phosphatase-1c-gamma1 (PP1Cgamma1). En utilisant la technologie siRNA, ils ont pu démontrer une corrélation entre les niveaux de PP1Cgamma1 et (a) l'activation de JNK1, (b) la phosphorylation de p53, et (c) l'expression de Bax et le déclenchement consécutif du processus d'apoptose induit par ROS ( Tchivilev et Al., 2008 ). Plus récemment, le rôle de la fonction bêta-PIX (β-PIX) sur la migration des CMLV induite par ANG-II ( Shin et al., 2009 ) a été établi en utilisant des siRNA. β-PIX appartient à la famille des GEF et est spécifique pour l'activation des petites Rho-GTPases Rac1/Cdc42. Le knock-down de β-PIX a inhibé la migration induite par ANG-II des CMLV de rat, de manière à émettre l'hypothèse quelles voies distinctes sont impliquées dans ce processus de migration.

Malgré l'utilisation généralisée de la technologie siRNA, des inconvénients importants, liés aux approches de validation des marqueurs exploitant le « knock-down » de l'interférence ARN, ont mis en doute la spécificité réelle de la cible siRNA (Tedeschi et al., 2009). Étant donné que des conséquences hors cible incontrôlables semblent affecter considérablement les résultats obtenus avec les siARN, l'utilisation de ribozymes dans les études de validation de marqueurs devrait augmenter au cours des prochaines années.


Knockdown simultané de l'expression de deux gènes à l'aide de plusieurs shRNA et knock-in ultérieur de leur expression

Le petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) est un outil puissant pour inhiber l'expression des gènes. Une limitation a été que cette technique a été utilisée principalement pour cibler un seul gène. Ce protocole s'étend sur les méthodes précédentes en décrivant un vecteur knockdown qui facilite le clonage de plusieurs shRNA, ce qui permet un knockdown ciblé de plus d'un gène ou d'un seul gène qui pourrait autrement être difficile à knockdown à l'aide d'un seul shRNA. Le ou les gènes ciblés peuvent être facilement réexprimés en transfectant des cellules knockdown avec un vecteur knock-in, contenant un ADNc réfractif shRNA qui exprimera la protéine d'intérêt même en présence de shRNA. Les vecteurs knockdown et knock-in construits peuvent être facilement utilisés simultanément pour évaluer les interrelations possibles entre les gènes, les effets de la perte de gènes sur la fonction cellulaire et/ou leur restauration en remplaçant les gènes ciblés un par un. L'ensemble de la procédure knockdown ou knock-in peut être complété en environ 3-4 mois.

Les figures

Aperçu schématique de la procédure

Aperçu schématique de la procédure

Représentation schématique du tandem de clonage,…

Représentation schématique de séquences multi-shRNA en tandem de clonage. En A), le pSilencer 2.1 original…

Représentation schématique du tandem de clonage,…

Représentation schématique de séquences multi-shRNA en tandem de clonage. En A), le pSilencer 2.1 original…

Conception d'oligonucléotides shRNA pour…

Conception d'oligonucléotides shRNA pour supprimer l'expression des gènes et les mutations silencieuses pour…

Analyse des ARNm ciblés dans…

Analyse d'ARNm ciblés dans des cellules transfectées codant pour des vecteurs knockdown. Northern blotting de…

Autoradiogramme de sélénoprotéines marquées au 75 Se…

Autoradiogramme de sélénoprotéines marquées au 75Se dans des cellules double knockdown/knock-in. Cellules NIH 3T3 qui…


Knockout et knockdown de gène - Biologie

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&ldquoUsing Cagen&rsquos souris knock-out constitutives générées par CRISPR a grandement facilité notre compréhension t.

&ldquoCyagen a fabriqué deux souris knock-in reporter (c'est-à-dire MLC-2v-tdTomato et Nppa-tagBFP) qui ont été utilisées dans mon public récent.

"Notre laboratoire utilise le service LacZ d'embryons de souris transgéniques transitoires de Cagen&rsquos pour tester les séquences candidates pour en.

« Nous sommes très satisfaits des services transgéniques professionnels de pointe fournis par Cagen pour la publication de notre étude.

&ldquoParmi plusieurs services commerciaux qui se prétendent spécialisés dans la génération de modèles murins avec modification génétique.


Coup de grâce génétique : la perte d'un gène peut être compensée par un autre gène

De nouvelles méthodes de modification du génome sont actuellement largement débattues : en utilisant CRISPR/Cas par exemple, les scientifiques peuvent supprimer des parties du code génétique d'un gène, le mettant ainsi KO. De plus, il existe des moyens d'inhiber la traduction d'un gène en une protéine. Les deux méthodes ont en commun d'entraver la production d'une protéine et devraient donc avoir des conséquences comparables pour un organisme. Cependant, il a été démontré que les conséquences peuvent différer, après qu'un gène est soit assommé, soit seulement bloqué. Un scientifique du MPI for Heart and Lung Research à Bad Nauheim a maintenant découvert que des gènes supplémentaires compensent un gène assommé et atténuent les conséquences ou compensent complètement les déficits. Les résultats suggèrent la prudence lors de l'interprétation des données d'études de biologie moléculaire ou du développement de thérapies géniques pour traiter diverses maladies.

Pour analyser la fonction d'un gène inconnu, les scientifiques éteignent souvent le gène et étudient les conséquences de ce traitement pour l'organisme. Pour ce faire, ils ont coupé des fragments d'ADN du gène à l'aide d'enzymes supprimant l'information génétique d'une protéine fonctionnelle. Une telle méthode est appelée « knock-out génétique ». En revanche, dans un « knockdown de gène », les scientifiques bloquent la production de protéines en utilisant des substances particulières, par ex. microARN.

Des études récentes, cependant, ont montré que les résultats peuvent varier entre les animaux knock-out et knock-down. Les scientifiques du groupe de Didier Stainier à l'Institut Max Planck de recherche cardiaque et pulmonaire en ont maintenant identifié la raison. Les chercheurs basés à Bad Nauheim ont étudié un gène appelé egfl7 chez le poisson zèbre. Le gène est impliqué dans la production de tissu conjonctif dans les parois des vaisseaux sanguins, les stabilisant ainsi. Ce faisant, egfl7 régule la croissance des vaisseaux sanguins.

Les biologistes du développement, cependant, ne sont pas sûrs de ce qui se passe dans un organisme de poisson, une fois que le gène egfl7 a été supprimé. "Si le gène a été bloqué lors d'un knockdown, les vaisseaux sanguins ne se développent pas normalement", explique Andrea Rossi, en collaboration avec Zacharias Kontarakis, premier auteur de l'étude. En revanche, si le gène lui-même est supprimé par une manipulation génétique, la croissance des vaisseaux sanguins n'est pas affectée.

Au début, les chercheurs de Max Planck ont ​​exclu les effets secondaires potentiels de la substance knockdown responsables d'interférences dans le développement vasculaire. À cette fin, ils ont injecté la substance dans des larves de poisson dans lesquelles le gène egfl7 avait déjà été supprimé. Cependant, les larves se sont presque développées normalement.

"Comme la substance n'a pas causé de perturbations dans la croissance des vaisseaux sanguins, nous avons pensé à un mécanisme différent : la perte de gènes pourrait être compensée par un autre gène prenant en charge la fonction", explique Kontarakis. "Par conséquent, nous recherchions des gènes de secours, qui auraient pu être produits chez des animaux sans gène egfl7 fonctionnel."

Les chercheurs ont comparé les molécules d'ARNm et les protéines chez les poissons avec ou sans gène egfl7 fonctionnel et ont détecté plusieurs ARNm et protéines présents en plus grande quantité chez les poissons sans egfl7. Un exemple est emilin 3B. Lorsque des animaux "knockdown" sont traités avec de l'emilin 3B après que egfl7 a été bloqué, les vaisseaux sanguins se développent presque normalement. "Cela nous indique qu'emilin 3B peut compenser la perte d'egfl7. Chez les poissons knock-out egfl7, la production d'emilin est régulée à la hausse. Ce n'est pas le cas chez les poissons knockdown", explique Stainier.

Comme prochaine étape, le groupe prévoit d'analyser comment les gènes "savent" qu'un autre gène a été supprimé, puis de compenser la perte. Plusieurs chercheurs du monde entier tentent de supprimer les gènes de la maladie pour des raisons thérapeutiques. Avant d'établir de telles thérapies, nous devons bien comprendre les conséquences que la perte ou le blocage d'un gène pourrait avoir. « De plus, notre étude illustre le pouvoir de comparer des knockouts et des knockdowns pour identifier des gènes modificateurs, un objectif qui reste un défi majeur dans le domaine de la génétique humaine », explique Stainier.


En ce qui concerne l'aspect expérimental de l'utilisation de CRISPR, les gènes knockdown sont l'un des rares qui captivent vraiment l'attention des scientifiques du monde entier. Alors que les gènes knock-out et knock-in peuvent offrir un aperçu considérable du fonctionnement interne du génome des mammifères, les knockdowns apparaissent comme une source précieuse de recherche. Avec CRISPR, obtenir des gènes knockdown peut être beaucoup plus facile qu'avec d'autres techniques, même si elles sont utilisées depuis longtemps. De plus, l'avenir de CRISPR est prometteur, car un nombre croissant de scientifiques du monde entier adoptent la technique et l'adaptent à leurs recherches.

Qu'est-ce que Gene Knockdown et pourquoi l'utilisons-nous ?

Jusqu'à présent, lors de l'utilisation de CRISPR, les techniques de précipitation ne constituent pas l'essentiel de la recherche sur laquelle la plupart des scientifiques se concentrent. Le knockdown du gène est toujours considéré comme une technique expérimentale, qui pourrait cependant s'avérer utile pour de futures applications pratiques. Un knock-down est essentiellement un gène dont l'expression a été réduite, au lieu d'être complètement arrêté (comme dans le cas d'un knock-out). Les gènes Knockdown peuvent être obtenus soit par manipulation génétique, via CRISPR, soit avec des réactifs tels que l'oligonucléotide d'ARN ou un ADN court.

Renversements permanents ou transitoires

Outre l'utilisation de CRISPR, des gènes knockdown peuvent également être obtenus à l'aide d'oligonucléotides qui se lient temporairement à un gène, conduisant à un knockdown temporaire ou « transitoire ». Les méthodes de knockdown transitoires sont couramment utilisées en biologie du développement et sont fréquemment appelées techniques de « génétique inverse ». Ils impliquent un certain nombre d'options possibles, telles que la liaison génique, le blocage de la traduction de l'ARNm ou l'utilisation de siRNA (small interfering RNA).

Utilisation du système CRISPR

Lorsqu'il s'agit d'utiliser CRISPR, le knockdown est plus facilement obtenu qu'avec toute autre technique, comme de nombreux experts peuvent l'admettre. Le nouveau système a été découvert à l'aide de procaryotes, bien que les chercheurs puissent désormais utiliser CRISPR pour l'édition du génome, et en particulier la création de gènes knockdown, mettant également en vedette des cellules eucaryotes. La technique pour obtenir des knockdowns avec CriSPR implique l'utilisation de protéines connues sous le nom de gènes associés à CRISPR, qui peuvent être programmées pour insérer des fragments d'ADN exogènes dans un locus de répétition CRISPR. Cette méthode permet la production de petits ARN qui peuvent servir de matrice aux protéines Cas pour faire taire cette même séquence dans une cellule. CRISPR est couramment utilisé par de nombreux chercheurs pour obtenir des knockdowns dans divers modèles de souris, dans le but d'affiner leurs recherches génétiques. L'objectif principal est généralement de trouver le mécanisme précis par lequel fonctionnent les gènes réduits au silence, et ce qui se passe lorsque leur expression est diminuée ou arrêtée.

Interférence d'ARN et autres techniques de knockdown

Outre CRISPR, les gènes knockdown peuvent également être obtenus par divers autres moyens. Les TALEN et l'interférence ARN sont deux des méthodes les plus connues, et elles jouissent également d'une popularité presque aussi grande que la technique CRISPR. L'interférence ARN utilise la dégradation de l'ARNm pour obtenir des effets de silençage dans des gènes spécifiques. Il s'agit principalement d'un outil de recherche qui permet un dépistage facile et permet aux chercheurs de déterminer sur quel domaine de recherche génétique se concentrer ensuite. Les TALEN sont une autre méthode courante pour obtenir des knockdowns, qui se concentre toutefois sur la manipulation du génome à l'aide de nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN).

Knockdowns pour la recherche et la commercialisation futures

Quant aux knockdowns, la commercialisation n'est pas encore en plein essor, la méthode n'en étant qu'à ses balbutiements. À l'heure actuelle, les chercheurs n'ont fait qu'effleurer la surface de ce qui est possible avec la technique. Knockdown animals such as rats and mice are most commonly used for reverse genetics purposes, and there are several companies that make knockdown mouse models available commercially. With the help of CRISPR, knockdown genes are easier to obtain than ever before, and the technique shows great promise for future study.

The mice were delivered on time, as billed!

“I’ve been working with iTL over the past 5 years in the production of 3 different genetically altered mice. Not only did iTL help in the design of the mice, [&hellip]


Optimized inducible gene knockdown and knockout in hPSCs

Optimized inducible gene knockdown and knockout in hPSCs. Développement 1 December 2016 143 (23): e2302. est ce que je:


Image source credit-https://www.genome.gov/12514551/

GENE KNOCK DOWN - Idea is same need to ommit the expression of desired gene but not completely . Genes are present but they are blocked . It is not physically deleted we need to block only the expression . It can achived in few weeks .

Technique used - By RNAi

NOTE-
A knockin model replaces an endogenous gene with a mutant gene, but leaves the original promoter region intact such that expression is controlled by normal regulatory mechanisms. Therefore, gene expression typically occurs at normal levels.
Knockout models remove a gene from the genome, and thus do not increase levels of gene expression.

MCQs. -
1.Homologous recombination can be employed to generate
A. transgenic animals
B. Gene knockout animals
C. Site specific mutagenesis
D. Specific promoter sequences
Rép. B (GATE XL - 2005)