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Les virus des plantes attaquent-ils les animaux ? exemples?


Les virus des plantes attaquent-ils les animaux, si oui, veuillez donner un exemple de virus.

Je pense que les virus végétaux et animaux sont différents et qu'ils ne peuvent pas s'attaquer les uns les autres.


De nombreux virus infectent les plantes, cependant, aucun d'entre eux n'est jusqu'à présent connu comme agent pathogène pour les animaux et les êtres humains. Seules trois familles, les Bunyaviridae, les Rhabdoviridae et les Reoviridae contiennent des virus connus pour infecter les plantes, les animaux et les humains.


Les virus végétaux attaquant les animaux ou vice versa signifieraient qu'un animal sert de vecteur biologique à une plante ou qu'une plante sert de vecteur biologique à un animal (selon le potentiel que vous prenez en le considérant comme l'hôte). C'est hautement improbable

  1. en raison des propriétés très différentes des cellules végétales et animales, alors que le virus doit être adapté pour se répliquer dans les deux
  2. en raison de la nature des interactions entre les plantes et les animaux qui sont défavorables à la transmission entre habitats viraux (contrairement, par exemple, aux échanges sanguins directs entre un animal et un insecte piqueur).

D'autre part, les plantes et les insectes servent régulièrement de vecteurs mécaniques pour la transmission de virus : un insecte qui se nourrit d'une plante peut transporter des particules virales vers une autre plante, et de même une plante peut intervenir dans l'échange de particules virales entre les insectes.

Voir Écologie virale par Hurst et al.


Les virus des plantes attaquent-ils les animaux ? exemples? - La biologie

Comme vous l'avez appris, les virus infectent souvent des hôtes très spécifiques, ainsi que des cellules spécifiques au sein de l'hôte. Cette caractéristique d'un virus le rend spécifique à une ou quelques espèces de vie sur Terre. D'un autre côté, il existe tellement de types différents de virus sur Terre que presque chaque organisme vivant possède son propre ensemble de virus. virus essayant d'infecter ses cellules. Même les procaryotes, les cellules les plus petites et les plus simples, peuvent être attaqués par des types spécifiques de virus. Dans la section suivante, nous examinerons certaines des caractéristiques de l'infection virale des cellules procaryotes. Comme nous l'avons appris, les virus qui infectent les bactéries sont appelés bactériophages (Figure 1). Les archées ont leurs propres virus similaires.


Comment les virus affectent-ils les animaux ? -Gianni, 10 ans, Îles Caïmans

Notre planète abrite plus de sept millions d'espèces animales étonnantes. Bien que nous ayons nos différences, nous avons aussi quelque chose en commun : nous sommes tous constitués d'un tas de cellules. Mon ami Jeb Owen m'a tout raconté.

C'est un scientifique de la Washington State University qui est vraiment curieux de savoir comment les insectes mangent le sang et interagissent avec les hôtes animaux. Il a même été appelé détective des maladies, traquant les virus transmis par les insectes.

Nous pouvons considérer les cellules animales comme des ballons d'eau, a déclaré Owen. Bien sûr, les cellules contiennent plus que de l'eau. À l'intérieur des cellules se trouvent différentes parties – presque comme une petite cuisine fonctionnelle – qui fabriquent les choses dont notre corps et nos cellules ont besoin.

La cellule contient également le matériel génétique de l'animal, ou ADN, qui agit comme un petit livre de cuisine. Le livre de cuisine est le matériel génétique qui contient toutes les instructions pour ce qui fait de vous, eh bien, vous. L'extérieur des cellules a de petites ouvertures pour déplacer les objets dans et hors de la cellule.

Mais les virus n'ont pas toutes les parties que les cellules ont. En fait, un virus n'est en réalité qu'un morceau de matériel génétique portant un manteau protecteur. C'est comme un petit livre de cuisine sans cuisine. Ainsi, les virus ne peuvent rien faire par eux-mêmes. Un virus a besoin d'une cellule pour fabriquer plus de virus en utilisant la cuisine de la cellule. D'une certaine manière, les virus sont un peu comme les cambrioleurs. Ils ont des "clés" spéciales sur leurs manteaux qu'ils utilisent pour passer à travers les ouvertures à l'extérieur des cellules.

Une fois qu'un virus s'est introduit, il peut inciter la cellule à produire plus de virus. La cellule produit tellement de virus qu'elle éclate comme un ballon d'eau surchargé, libérant toutes les nouvelles copies du virus. Lorsque les cellules éclatent, le corps peut avoir du mal à travailler, ce qui provoque des maladies. Le système immunitaire, qui défend le corps de l'animal contre l'infection, peut reconnaître qu'il se passe quelque chose d'inhabituel.

Parfois, si suffisamment de virus pénètrent, le système immunitaire qui fonctionne pour vous protéger finit également par causer des dommages. Les cellules qui vous protègent et tuent le virus finissent par tuer les cellules saines au cours du processus. Cela peut aussi nous rendre malade.

Certains virus insèrent leur matériel génétique dans le matériel génétique des cellules de l'animal. Cela peut entraîner un mauvais comportement des cellules animales et devenir cancéreuses. Les cellules cancéreuses provoquent la défaillance de vos tissus, ou de la communauté de cellules travaillant ensemble. Cela peut aussi vous rendre très malade.

La plupart des virus n'infectent qu'un seul type d'animal. Même si les animaux sont apparentés, il existe de petites différences dans les cellules de chaque type d'animal. C'est comme si les cellules de différents animaux avaient des portes et des serrures spécifiques à l'extérieur des cellules. Les virus ouvrent ces « verrous » et ne peuvent utiliser que ce type d'animal comme hôte. Lorsque les virus développent des « clés » qui fonctionnent sur plusieurs types de cellules, ils peuvent se déplacer entre différents types d’animaux.

C'est une excellente question que tu poses, Gianni. Les scientifiques sont également curieux à ce sujet. Après tout, en savoir plus sur les virus peut nous aider à comprendre comment ils se déplacent et comment les prévenir. De cette façon, nous pouvons aider nos amis animaux et humains à vivre une vie encore meilleure.


Partie 2 : Génie génétique pour la résistance aux virus chez les plantes : différents virus exigent différentes stratégies

00:00:03.04 Bonjour et bienvenue à la conférence. Je suis Roger Beachy,
00:00:05.23 le président du centre des sciences végétales Donald Danforth à St. Louis, Missouri.
00:00:09.06 Certains d'entre vous ont vu la conférence précédente dans laquelle j'ai parlé de la réplication et de la propagation de cellule à cellule
00:00:17.11 du virus de la mosaïque du tabac, un virus modèle.
00:00:21.12 Dans cette conférence, je veux parler de la façon dont nous avons utilisé ces informations
00:00:26.12 et informations précédentes pour développer des stratégies pour les plantes transgéniques
00:00:33.05 qui serait résistant à l'infection virale.
00:00:35.27 Je vais vous montrer plusieurs exemples et en fin de compte, je suppose que le message à retenir est
00:00:40.17 d'abord, si vous allez faire des études qui, espérons-le, auront des applications en biotechnologie,
00:00:47.13 vous devez connaître votre agent pathogène, savoir comment il fonctionne, comment il se transmet de cellule en cellule,
00:00:51.24 comment il se transmet d'une plante à l'autre, afin que vous puissiez utiliser des introdictions génétiques ou des approches de thérapie génique
00:00:58.28 pour améliorer la résistance des plantes à l'infection ou à la réplication ou à la propagation,
00:01:04.14 et donc réduire l'impact des maladies sur une plante.
00:01:09.16 Nous allons parler de plusieurs virus dans cette conférence
00:01:13.08 et je vais d'abord passer en revue certaines des stratégies qui ont été utilisées pour développer des plantes résistantes aux virus.
00: 01: 19.25 Je vais parler du virus de la mosaïque du tabac comme modèle de la façon dont nous utilisons ces informations pour développer ce que nous appelons la résistance à médiation par les protéines du manteau
00:01:28.13 et un exemple réel de la façon dont nous l'avons appliqué, ou l'appliquons maintenant,
00:01:32.15 en combinaison ou en collaboration avec nos collègues en Inde,
00:01:37.13 pour développer une résistance contre une maladie très grave de l'arachide ou de l'arachide,
00:01:42.25 une culture qui affecte de nombreux petits agriculteurs en Inde.
00:01:48.03 Si nous pouvons résoudre ce problème, nous en serons très heureux bien sûr.
00:01:51.25 Et puis je veux parler d'un exemple très différent, le virus bacilliforme du tungro du riz, c'est un pararétrovirus
00:01:57.11 et vous verrez que les stratégies que nous avons utilisées ici sont très différentes de celles que nous avons utilisées ci-dessus pour le virus de la mosaïque du tabac.
00:02:02.25 Et enfin, un autre défi sur lequel un de mes collègues, Claude Fauquet, et son laboratoire travaillent :
00:02:08.08 donc, le virus à ADN simple brin, un type très différent, et les stratégies utilisées là-bas seront différentes
00:02:13.25 que les stratégies utilisées dans le numéro 1, le numéro 2 et le numéro 3.
00:02:17.11 Alors, allons-y. Cela fait maintenant plus de vingt ans que nous avons eu le premier essai sur le terrain
00:02:23.16 d'une culture vivrière génétiquement modifiée et résistante aux maladies.
00:02:28.00 Mon labo a été impliqué dans la collaboration avec la société Monsanto
00:02:31.20 car très tôt, nous n'avions pas toute la technologie nécessaire pour développer des plantes transgéniques
00:02:36.22 dans nos propres laboratoires et nous avons collaboré avec des scientifiques de Monsanto pour développer les plantes que vous voyez ici.
00:02:43.18 Ce sont des plants de tomates, ils portent une capside de protéine d'un virus simple, le virus de la mosaïque du tabac.
00:02:50.16 Le virus de la mosaïque du tabac et le virus de la mosaïque de la tomate sont cousins.
00:02:53.20 Et ce sont, c'est le résultat de l'infection de ces dix plantes sur cette diapositive avec le virus dans nos serres
00:03:03.06 et vous pouvez voir que les plantes ici poussent beaucoup plus hautes et sont beaucoup plus saines que celles ci-dessous.
00:03:09.25 Ceux-ci sont résistants à l'infection virale et ce que nous avons découvert en 1985, c'est que nous pouvions reproduire le travail à partir du tabac
00:03:17.11 à la tomate aux pétunias et autres plantes.
00:03:21.02 Nous avons ensuite pu, grâce aux demandes adressées au département américain de l'Agriculture
00:03:25.26 et l'Environmental Protection Agency, pour les planter sur le terrain.
00:03:28.23 Et ça fait maintenant plus de vingt ans, mes cheveux ne sont plus bruns,
00:03:34.18 c'est plus clair, mais j'ai grisé à cause de beaucoup de choses.
00:03:40.29 Et l'un de ces défis que je trouve encore curieux est de savoir comment une technologie comme celle-ci et d'autres
00:03:47.11 ont toujours du mal à être libérés dans le flux de commercialisation.
00:03:55.27 À ce jour, nous n'avons qu'un seul succès d'un laboratoire académique
00:04:00.08 de plantes résistantes aux virus qui ont été développées grâce à ce type de technologies.
00:04:05.15 C'est une papaye qui a été développée à l'Université d'Hawai'i.
00:04:10.01 Et il y a maintenant une variété de courge qui est également sur le marché du secteur public, du secteur privé.
00:04:16.25 Alors, pourquoi n'y a-t-il pas eu plus de succès ?
00:04:18.19 Est-ce parce que nous n'en savons pas assez sur le virus ?,
00:04:21.22 ou est-ce que nous n'en savons pas assez sur la façon de faire des règlements ?,
00:04:25.11 est-ce ce que nous ne savons pas sur la commercialisation,
00:04:28.12 pourquoi le secteur public n'a-t-il pas été plus impliqué dans cette science et technologie ?
00:04:33.01 Parce que, comme vous le verrez, ce que nous pouvons apporter est important.
00:04:36.13 Et nous devons apprendre à utiliser nos connaissances pour améliorer la contribution de notre science
00:04:44.16 à la production alimentaire dans ce monde où la population continuera de croître,
00:04:50.09 où de plus en plus de pressions sur la production alimentaire continueront de croître à mesure que la population augmente,
00:04:55.25 où il n'y a encore qu'une certaine quantité de terre qui peut être plantée,
00:05:00.02 seule une certaine quantité d'eau douce peut aller sur les terres agricoles, et pourtant la population continue de croître.
00:05:05.22 Les défis des sciences végétales incluent ceux, les études des mécanismes de base de la maladie,
00:05:12.00 et trouver des moyens d'interdire ces maladies, soit par la génétique classique et la sélection végétale
00:05:17.09 ou, peut-être, par la biotechnologie et ce dont je veux parler aujourd'hui, ce sont des exemples spécifiques
00:05:22.14 où la biotechnologie peut être utilisée, ou a été utilisée, pour développer des plantes résistantes au pathogène.
00:05:29.13 Notre prochain défi consiste à les faire tester dans des situations d'essais sur le terrain confinés
00:05:35.29 pour les évaluer non seulement en laboratoire, dans des serres, mais dans des situations réelles de terrain,
00:05:41.11 comme cela a été fait dans ce premier cas, il y a maintenant plus de vingt ans.
00:05:44.21 Ce que j'espère, c'est qu'il y aura de plus en plus d'exemples du secteur public, comme nous le sommes,
00:05:50.13 au développement de produits qui seront utiles à la libération pour que les gens augmentent leur production alimentaire.
00:05:58.14 Donc, d'abord un petit tour d'horizon de ce qui a été fait dans les laboratoires scientifiques pour développer la résistance aux virus.
00:06:08.07 Il y a eu une variété de stratégies. Certains d'entre eux sont appelés dérivés d'agents pathogènes.
00:06:12.06 C'est-à-dire que nous utilisons des gènes et des cadres de lecture ouverts ou de petits ARN
00:06:16.26 pour développer des stratégies pour arrêter le virus dans son processus de réplication virale.
00:06:22.24 Et il y en a une variété,
00:06:24.06 dans certains cas, il est possible d'utiliser les gènes qui proviennent des séquences de protéines d'enveloppe,
00:06:29.10 comme nous l'avons fait pour le cas du virus de la mosaïque de la tomate.
00:06:31.21 Ou, en utilisant des protéines liées à la réplicase, les enzymes nécessaires à la réplication du génome viral.
00:06:39.13 Dans d'autres cas, leurs stratégies ont consisté à bloquer la fonction de la protéine de mouvement,
00:06:43.11 ce dernier n'a pas eu beaucoup de succès à ce jour, mais j'espère à travers la dernière conférence,
00:06:48.11 vous avez une idée de ce que nous savons sur les protéines du mouvement,
00:06:52.02 et plus nous en savons, la possibilité de bloquer leur action, peut-être avoir un plus large éventail d'effets sur l'infection virale.
00:07:00.28 Les stratégies complémentaires consistent à utiliser des séquences du génome viral qui vont induire la formation de petits ARN
00:07:08.07 qui peut alors faire taire et conduire à la dégradation des ARN viraux pendant le processus de réplication.
00:07:14.24 Cela semble fonctionner assez bien dans certains cas, mais pas dans d'autres.
00:07:17.24 Maintenant, le défi ici est que ceux-ci, on l'imagine ou on s'attend à ce que l'ARN médie les événements de résistance
00:07:24.26 fonctionnera dans les cas où il y a très peu de divergence dans la séquence virale.
00:07:29.29 Comme vous le savez, les complexes de silençage se forment en raison de la similitude de séquence étroite entre un ARN et l'ARN cible.
00:07:40.12 Si ceux-ci divergent en raison de la divergence des séquences virales, cela pourrait être un défi pour ce type d'approche.
00:07:47.25 Néanmoins, la résistance médiée par l'ARN peut donner des niveaux de résistance très élevés aux plantes transgéniques.
00:07:53.08 Ce ne sera pas le sujet de mon exposé aujourd'hui, nous avons principalement travaillé sur des événements à médiation protéique.
00:07:59.23 Il existe d'autres exemples utilisés dans lesquels la résistance n'est pas dérivée des séquences pathogènes,
00:08:06.06 mais d'autres séquences.
00:08:07.21 Par exemple, je vais vous montrer un cas dans lequel nous avons utilisé des facteurs de transcription
00:08:11.22 pour restreindre la réplication et la maladie causée par la maladie de la tungro du riz.
00:08:16.15 Dans certains cas, il existe des protéines de liaison à l'ADN simple brin.
00:08:20.03 D'autres stratégies ont recréé des stratégies de type interféron dans les plantes ou en utilisant, en développant des plantes qui ont des anticorps monoclonaux
00:08:29.00 qui lierait des virus spécifiques ou des protéines virales et ralentirait leur réplication virale en le faisant.
00:08:35.17 Il existe toute une série de données qui indiquent maintenant que certains des facteurs de traduction qui sont impliqués
00:08:43.17 dans la traduction des ARN viraux peut être utilisé pour améliorer la résistance aux maladies dans certains cas, classes, de virus.
00:08:50.27 Donc, encore une fois, plus nous en savons sur le virus et comment il se réplique,
00:08:54.18 et plus nous en savons sur l'hôte et comment il réagit à l'invasion virale,
00:08:58.18 plus nous réussirons à développer des stratégies de résistance contre l'infection.
00:09:03.09 Donc, je veux parler d'un système modèle, la résistance à médiation par la protéine d'enveloppe.
00:09:09.03 Comment ça marche ? Pourquoi ça marche ? Et comment pouvons-nous le rendre plus efficace?
00:09:13.25 Je veux vous donner un exemple réel d'un virus où nous avons utilisé une protéine d'enveloppe pour protéger contre le virus de la strie du tabac en Inde,
00:09:22.03 c'est une application dans le monde réel de la technologie qui a maintenant plus de vingt ans.
00:09:25.21 La maladie de la tungro du riz, en utilisant de nouvelles approches parce que les approches ici n'ont pas fonctionné dans celle sur la tungro du riz,
00:09:32.00 nous l'avons découvert il y a environ dix ou douze ans.
00:09:33.29 Et deuxièmement, enfin, je veux parler d'une protéine que nous appelons protéine G5,
00:09:37.22 c'est une protéine d'un inovirus, un bactériophage, pour contrôler la réplication du virus des gémeaux.
00:09:43.25 Maintenant, il y a beaucoup de virus végétaux, beaucoup de virus animaux, beaucoup de virus de phage,
00:09:49.25 et dans cette virosphère, développée par le Comité international sur la taxonomie des virus,
00:09:55.16 et Claude Fauquet et ses confrères, ont développé cette virosphère, je ne vais pas la passer en revue,
00:10:00.05 mais je veux parler de ce groupe de virus à ce stade. Le virus dont je vais parler est la mosaïque du tabac,
00:10:05.21 il appartient à cette classe de virus à ARN simple brin qui fait l'objet de ma précédente conférence.
00:10:15.13 Un petit abécédaire sur le virus de la mosaïque du tabac. Comme je l'ai indiqué plus tôt, nous en savons assez sur la façon dont cela se reproduit
00:10:21.25 du point de vue moléculaire. Nous avons beaucoup appris sur la façon dont le virus se réplique dans la cellule,
00:10:27.14 où il agit dans la cellule, comment il forme ces complexes de réplication et comment le virus pourrait se déplacer d'une cellule à l'autre.
00:10:34.05 Maintenant, en 1985, nous avons découvert que lorsque nous avons introduit l'un des gènes du virus, le gène de la protéine de capside,
00:10:41.28 dans des plants de tomates, nous avions une population de plants résistants.
00:10:46.23 En fait, le niveau de résistance était corrélé avec le niveau de protéine de capside.
00:10:50.22 Plus il y a de protéines de capside, plus ils sont résistants.
00:10:53.14 Comme nous l'avons fait nos premières études, dans les années 80 et au début des années 90, notre modèle que nous avons développé, soutenu par de nombreuses données,
00:11:01.18 a indiqué que la protéine d'enveloppe, si la protéine d'enveloppe est en quantité suffisante dans la plante
00:11:07.07 et s'il pouvait s'auto-assembler pour faire ces trimers que je montre aussi ici,
00:11:11.25 et ces deux, ou celui-ci, étaient responsables de la liaison au virus lorsque le virus est entré dans la cellule.
00:11:20.04 Et en quelque sorte recapuchonné le virus et ne laissant pas l'ARN viral sortir de sa coquille.
00:11:24.29 S'il ne peut pas sortir de sa coquille, bien sûr, il ne peut pas se lier aux ribosomes, il ne peut pas démarrer le processus d'infection.
00:11:30.18 Ainsi, au cours des premières années, lorsque nous avons réalisé que la résistance à médiation par les protéines d'enveloppe,
00:11:38.04 fonctionnait en bloquant le démontage du virion et arrêtant ainsi le virus dans son élan.
00:11:43.26 L'une des façons dont nous avons montré que cela pourrait être le cas est que lorsque nous avons inoculé ces plantes transgéniques
00: 11: 49.05 avec le, qui avait la protéine d'enveloppe, avec l'ARN viral nu sans la protéine de capside,
00:11:54.06 nous pourrions vaincre la résistance.Et j'y reviendrai un peu plus tard,
00:11:57.26 parce que nous avons utilisé cette stratégie pour étudier également la réplication du virus dans les cellules.
00:12:02.08 Cela nous a donc amené à croire qu'au moins les premiers événements de blocage de la maladie virale étaient causés par un recapuchonnage du virion.
00:12:11.05 Parce que Gerald Stubbs et un grand nombre d'autres laboratoires ont travaillé sur la biologie structurale du virus
00:12:17.07 nous avions un avantage assez positif dans nos études.
00:12:21.05 Ce que nous avons dit, c'est, si virus, si interaction de protéines entre elles, les protéines de capside entre elles,
00:12:27.02 est important pour la résistance aux maladies virales, peut-être si nous bloquons la capacité de ces molécules de capside à s'assembler,
00:12:35.24 ou nous avons fait des mutations qui augmenteraient l'affinité des protéines, l'une pour l'autre,
00:12:40.22 nous augmenterions le niveau de résistance.
00:12:42.19 Et je veux vous montrer le résultat de ces études.
00:12:46.05 Maintenant, nous avons utilisé les résidus dans la structure de ce diagramme en ruban de deux molécules de capside,
00:12:55.09 nous savons comment ils interagissent, vous voyez ici deux acides aminés acides,
00:12:59.27 acide aspartique en position 77 et acide glutamique en position 50, sur deux capsides différentes.
00:13:06.00 Ceux-ci devraient être répulsifs, mais il y a un calcium qui se trouve entre les deux et neutralise ces charges négatives
00:13:14.15 et lui permet de rester ensemble. En fait, l'un des points du stade précoce de l'infection virale, le calcium est libéré,
00:13:20.26 permettant à ceux-ci de se séparer les uns des autres et libérant ainsi l'ARN viral.
00:13:25.16 Nous avons également la chance d'avoir la structure quaternaire du virion assemblé,
00:13:30.01 pour que nous sachions comment ils interagissent, les sous-unités interagissent les unes avec les autres, côte à côte et de haut en bas.
00:13:35.15 Cela a été très utile car nous avons examiné des sortes de structures moléculaires et l'effet de la structure sur la résistance.
00:13:41.03 Voici donc les résultats d'une expérience très simple.
00:13:44.14 Ce que nous avons fait, c'est faire un certain nombre de mutations dans ces acides aminés spécifiques de la protéine de capside
00:13:51.22 et ensuite remettre le gène de la protéine de capside dans le virion et demander si le virion s'assemblerait,
00: 13: 58.09 si c'était le cas, si le virus pouvait se déplacer de cellule en cellule, s'il pouvait aller de feuille en feuille,
00:14:02.25 comme je parlais lors de la dernière conférence.
00:14:05.08 Mais nous avons également mis ces protéines mutées dans des plants de tabac et créé des populations de plantes transgéniques
00:14:13.10 qui avait la protéine virale.
00:14:15.09 Nous avons créé quelque chose comme quinze lignées de plantes indépendantes pour chacune des mutations,
00:14:22.06 donc vous pouvez voir que nous avons fait beaucoup de mutants,
00:14:24.10 puis identifié parmi cette population les lignées qui ont accumulé la même quantité de protéine,
00:14:31.07 la protéine de type sauvage, ou la protéine mutante. Et puis utilisé ceux-ci dans une étude de pathologie végétale,
00:14:36.22 a simplement défié ces lignes avec un virus et les a vues tomber malades.
00:14:40.28 Donc, ce sont des lignées non transgéniques, vous pouvez voir que ces plantes sont toutes devenues malades dans un certain laps de temps.
00:14:48.22 Et plus les plantes ont l'air malades, bien sûr, plus elles contiennent de virus.
00:14:53.05 Donc, ce sont deux lignées de plantes indépendantes qui ont deux, je veux dire, deux exemples de deux lignées qui ont deux mutations différentes,
00:15:00.03 dans la protéine d'enveloppe. Et vous voyez qu'il peut y avoir un petit délai entre le début de la maladie
00:15:06.19 dans cette ligne, par rapport à cette ligne, mais il est clair qu'ils ne sont pas heureux et qu'ils montrent la maladie.
00:15:13.20 Mais maintenant, passez à cet autre groupe.
00:15:17.14 Voici un groupe de lignées transgéniques que vous pouvez voir avoir les protéines d'enveloppe mutantes,
00:15:25.01 cette ligne 3646, est la ligne historique que nous utilisons depuis de très nombreuses années.
00:15:29.00 Et vous voyez ici que ces plantes sont différentes de celles d'en haut.
00:15:35.00 En fait, ils montrent une certaine maladie, mais l'apparition de la maladie est plus tardive, elle est retardée,
00:15:40.19 et ce n'est pas aussi grave. Ensuite, il existe un autre large ensemble de mutations dans la protéine d'enveloppe
00:15:47.02 qui ne tombent pas malades ou qui tombent malades très, très tard dans le processus d'infection.
00:15:52.07 Comment ont-ils réussi à échapper à l'infection ? Quelle est la nature de ces mutations
00:15:55.26 et comment pourraient-ils retarder le processus d'infection ?
00:15:59.03 Maintenant, nous n'avons pas fait toutes les expériences dont je vais vous parler avec chacune d'elles,
00:16:03.00 nous nous sommes concentrés sur T42W, l'une des lignes que nous avons le plus étudiées, mais elle est emblématique des autres
00:16:10.00 et nous avons d'autres données qui indiquent que ce groupe agit vraiment en tant que groupe et je vais parler de ces études.
00:16:15.12 Dans ce processus, nous avons également créé des lignées cellulaires transgéniques dans la lignée cellulaire BY-2, c'est une lignée cellulaire de tabac.
00:16:24.01 Maintenant, l'importance de ces lignées cellulaires, alors, c'est que nous pourrions fabriquer des cellules individuelles, ou des protoplastes, à partir d'elles
00:16:29.13 et étudier la dynamique cellulaire unique de l'infection virale.
00:16:33.13 Et vous voyez qu'ici, dans ce cas, nous avons fait l'infection des cellules
00:16:37.19 et vous voyez qu'il y a, ils ont été inoculés au temps zéro, puis nous avons prélevé des échantillons à différents moments après l'infection
00:16:45.11 et recherché l'accumulation de protéines virales.
00:16:48.00 Donc, vous voyez que dans ce cas, ces ensembles de mutants, il n'y avait pas, il y avait réplication et accumulation
00:16:55.08 de la protéine d'enveloppe, tout comme dans la lignée cellulaire non transgénique.
00:16:59.28 Voici un autre ensemble de lignées cellulaires dans lesquelles il n'y avait aucune infection ou un très faible niveau d'infection,
00:17:06.06 comme le montre l'accumulation de protéines d'enveloppe.
00: 17: 09.22 Fondamentalement, ce sous-ensemble de lignées cellulaires, qui a montré moins d'accumulation de protéine d'enveloppe
00:17:16.10 a également montré moins d'accumulation de protéine de mouvement ou de réplicase.
00:17:20.00 Ils peuvent être divisés en deux catégories ceux où il y avait une forte susceptibilité, une forte susceptibilité,
00:17:25.29 et moins de susceptibilité, ou plus de résistance.
00:17:29.01 Pourquoi était-ce? Comment cela a-t-il fonctionné ?
00:17:30.16 Et pourquoi la protéine d'enveloppe fonctionne-t-elle différemment selon les cas ?
00:17:35.02 Donc, nous sommes retournés à la biologie cellulaire de la façon dont les complexes d'infection et de réplication du virus sont mis en place.
00:17:41.23 Comme je l'ai indiqué dans la conférence précédente, la couleur rouge représente l'emplacement de la réplicase du virus,
00:17:49.00 le vert, où se trouve la protéine de mouvement et le bleu où se trouve la protéine d'enveloppe.
00: 17: 55.18 C'est relativement tôt dans le cycle d'infection, vous pouvez voir que ces corps verts représentant certaines des usines de réplication du virus
00:18:02.23 sont de taille relativement modeste et n'ont pas fusionné, comme aux stades ultérieurs.
00:18:07.20 Mais, si c'est ce qui se passe, nous avons ensuite examiné ces différentes lignées cellulaires que nous avions produites
00:18:13.28 et nous avons parcouru tout le processus, nous pouvons tracer l'accumulation de la protéine de mouvement
00:18:20.23 en tant que stade précoce de l'infection, stade intermédiaire de l'infection et stades ultérieurs de l'infection.
00:18:26.04 Vous remarquez qu'ici, les points lacrymaux sont très petits et cela représente l'accumulation de la protéine de mouvement
00:18:33.07 en utilisant une fusion de protéine de mouvement avec une protéine fluorescente verte.
00:18:36.19 Dans ce cas, nous avons testé chacune de ces lignées cellulaires avec l'ARN du virus,
00:18:42.06 afin que nous puissions surmonter la réaction de résistance de la protéine d'enveloppe et maintenant nous ne faisons que suivre l'infection.
00:18:47.24 Donc, vous pouvez voir que ces corps grossissent,
00:18:51.02 ils deviennent vraiment plus gros, puis en bas, dans les derniers stades, les corps paraissent assez gros,
00:18:56.02 puis, via une protéolyse de la protéine de mouvement, ciblant la dégradation,
00:19:01.08 et les corps ne sont plus visibles à travers la protéine fluorescente verte.
00:19:06.11 Ils ne peuvent être vus que par microscopie électronique et localisation de la réplicase.
00:19:10.16 Nous avons donc commencé à catégoriser ces lignées cellulaires de certaines manières
00:19:15.06 et disons, progressent-ils tous du début, du milieu à la fin au même rythme ?
00:19:21.27 Ainsi, un assistant de recherche très talentueux a examiné ces lignées cellulaires à différentes heures après l'infection,
00:19:28.12 dix heures après l'inoculation, à différents moments,
00:19:32.26 et ensuite décidé s'ils étaient aux premiers stades, aux stades intermédiaires ou aux stades avancés de l'infection virale.
00:19:39.07 Et ce que vous voyez ici, c'est qu'il existe un ensemble de lignées cellulaires qui agissent toutes comme si elles n'étaient pas transgéniques.
00: 19: 47.01 Ils passent par la progression de la maladie et l'accumulation de ces corps
00:19:52.07 comme le ferait une lignée cellulaire non transgénique.
00: 19: 54.27 Il y a un autre ensemble de mutants qui sont démontrés ici qui semblent progresser à travers le cycle d'infection
00:20:02.23 de la même manière qu'une lignée cellulaire qui fabrique une protéine d'enveloppe de type sauvage.
00:20:07.15 C'est la première fois que nous notons que ce processus est différent dans cette lignée cellulaire que dans cette lignée cellulaire ici.
00:20:14.08 Remarquez comment cela passe par cette progression très rapidement.
00: 20: 18.05 Ce que cela nous a indiqué, c'est si vous contractez une infection virale dans ces cellules
00:20:21.25 en évitant la désencapsidation, ou la libération d'ARN viral, le processus d'infection peut même aller plus vite que la normale, que prévu.
00:20:29.20 Cela indiquait quelque chose de très spécial et c'est que la protéine de capside agissait, peut-être,
00:20:34.16 comme régulateur positif pendant le cycle de réplication. C'est quelque chose que nous n'avions pas découvert auparavant.
00:20:39.18 Et d'autres de ces protéines mutantes agissent également comme des régulateurs positifs,
00:20:45.21 mais en bas vous voyez un autre groupe entier de lignées cellulaires.
00: 20: 50.23 Dans ces lignées cellulaires, elles sont principalement piégées aux premiers stades de l'infection, ce stade,
00:20:58.02 ou celui juste en dessous.
00:21:00.03 Pourquoi était-ce ?
00:21:01.14 Cela indiquait que ceux-ci, pour nous, ou nous suggéraient, que ces protéines d'enveloppe mutantes
00:21:07.14 agissaient en fait comme des régulateurs négatifs, pas comme des régulateurs positifs.
00:21:11.01 Et donc nous sommes retournés à notre biologie cellulaire.
00:21:13.06 Maintenant, regardez ces deux diapositives et ce que vous voyez sur la diapositive de gauche est une cellule infectée
00:21:20.05 qui a un de ces mutants qui agit comme un régulateur négatif.
00:21:23.07 Remarquez que vous ne trouvez presque pas, il n'y a presque pas de protéine de mouvement là-bas.
00:21:27.02 Il fabrique principalement des protéines de capside et des réplicases virales, un peu de protéines de mouvement, mais pas beaucoup.
00:21:35.04 Et seulement de l'autre côté de cette diapositive se trouve la lignée cellulaire non transgénique, que vous voyez de très, très gros corps de réplication,
00:21:43.05 comme je vous l'ai montré dans la conférence précédente. Ces corps sont capables de se déplacer rapidement à l'intérieur de la cellule,
00:21:49.24 ils sont capables de se déplacer de cellule en cellule dans une feuille infectée.
00:21:52.11 Donc, voici la première indication qu'il s'agit d'un régulateur négatif d'une manière ou d'une autre,
00:21:57.13 et en bloquant la production de protéine de mouvement. Et voici l'indice :
00:22:02.13 s'il y a moins de protéines de mouvement, le virus a moins de capacité à se déplacer d'une cellule à l'autre.
00:22:07.08 Ainsi, vous pouvez voir que vous pouvez bloquer un processus qui entraîne une résistance aux maladies.
00:22:13.10 Alors, quelle est la biologie structurale de cet ensemble, qu'est-ce qui fait la structure de ce mutant conférant une résistance élevée
00:22:22.18 différent de la structure de la protéine de capside, et comment cette structure pourrait-elle affecter la fonction.
00:22:28.22 Je vous ai dit plus tôt, je vous ai montré plus tôt, que le virus est vraiment un réseau hélicoïdal d'environ 2 140 de ces molécules de protéines de capside.
00:22:39.00 Ils s'empilent tous et s'enroulent autour de l'ARN viral pour produire le virion
00:22:44.00 et ils le font pour que cela ressemble à une pile hélicoïdale.
00:22:46.24 Voici un, cette pile, cependant, fait une vue au microscope électronique qui ressemble beaucoup à ceci.
00:22:55.02 Ce sont des reconstructions cryo-EM, ou des images, de virions.
00:22:59.22 Notez que cette partie ici est notablement différente de celle-ci. Et en fait, si vous regardez la transformée de Fourier
00:23:07.05 de l'incidence de la réflexion après, vous trouvez que celui-ci est différent de celui-ci, ils sont espacés différemment.
00: 23: 15.17 Cet espacement était, cette information a ensuite été utilisée par Tom Smith au Danforth Center
00:23:20.28 pour nous aider à modéliser cette structure et ce que Tom a conclu dans sa modélisation est que cette structure est différente de celle-ci.
00:23:32.10 Essentiellement, le haut, si vous représentez cela comme le haut de la protéine et le bas de la protéine,
00:23:36.17 en haut et en bas, vous avez un arrangement A/B, A/B ici.
00:23:41.07 Mais ce qui s'est passé ici, c'est que vous avez un arrangement A/B, B/A.
00:23:45.29 Et la suggestion est que cela peut être un régulateur négatif, alors que ce n'est pas un régulateur négatif.
00:23:52.23 Fait intéressant, Gerald Stubbs, il y a près de 20 ans, dans sa vue au microscope électronique de certains de ces virions,
00:24:01.16 dans la façon dont il a fait sa science, a suggéré qu'il pourrait y avoir, certains d'entre eux se sont produits dans une infection virale naturelle.
00:24:08.14 Donc, je pense que nous suggérons que ce qui s'est passé est que les mutations que nous avons développées
00:24:13.22 créer un, changer l'incidence de ceci et de cela, et plus cela est important, plus il y a de résistance.
00:24:25.20 Nous savons que ces globs, ces assemblys, ces plates-formes, peuvent interagir avec ceux-ci.
00:24:32.29 Vous le voyez dans cette structure ici, certains d'entre eux sont A/B, A/B et certains sont A/B, B/A, co-assemblés.
00:24:42.25 C'était un modèle intéressant, ce modèle était très intéressant et important, si vous étiez un biologiste structural
00:24:49.17 ces deux images en C et en G peuvent être vues comme des images stéréo. Alors, voici le modèle.
00:24:58.06 Pendant l'infection virale, la réplicase se lie à la première partie du processus d'infection et produit l'enzyme, la réplicase.
00:25:08.01 Cette réplicase se structure alors, se lie à cette extrémité de l'ARN viral et fabrique l'ARN complémentaire.
00:25:16.16 Il va ensuite aux points sur cet ARN complémentaire où il y a des structures appropriées,
00:25:23.04 ce sont des promoteurs internes, ils sont montrés ici comme des boucles de tige,
00: 25: 27.14 et la conséquence est que cette enzyme fabrique alors ces molécules d'ARN plus petites qui agissent comme des ARN messagers
00:25:34.27 pour produire la protéine de mouvement.
00:25:37.14 D'autres ARN génomiques de ce type produisent plus de protéines de capside. En présence de la protéine de capside de type sauvage,
00:25:44.27 vous avez une amélioration de cette région promotrice et faites beaucoup plus d'ARN messagers de protéines de mouvement et de protéines d'enveloppe.
00:25:52.20 Cependant, nous pensons que, nous proposons que lorsque la protéine d'enveloppe mutante et la protéine de type sauvage se lient ensemble,
00:26:00.12 ils bloquent ce récepteur, ou ce promoteur, ou la liaison de la protéine réplicase à cette structure.
00:26:08.16 Dans tous les cas, vous obtenez beaucoup moins de protéines de mouvement. Certains ont fait, mais pas beaucoup.
00:26:12.27 En conséquence, vous n'avez pas autant de protéines de mouvement. Comme je l'ai dit dans la dernière conférence,
00:26:17.24 ces protéines de mouvement sont absolument essentielles pour déplacer ces usines de réplication virale autour de la cellule.
00:26:24.22 Voici une usine de réplication de virus qui est produite, mais elle n'a pas de protéine de mouvement.
00:26:28.09 Il ne bouge pas non plus ici à moins qu'il y ait un peu de protéine de mouvement coincée dedans.
00:26:33.23 Donc, ces usines se déplacent en raison de la disponibilité de la protéine de mouvement au bon endroit, au bon moment,
00:26:41.00 pour se lier à ceux-ci, aux mécanismes de transport, aux plasmodesmes.
00:26:46.15 Donc, c'est le modèle de la façon dont la résistance pourrait fonctionner.
00:26:49.11 Ainsi, au cours des quinze, vingt dernières années, nous avons beaucoup appris sur la résistance médiée par les protéines d'enveloppe,
00:26:55.08 comme le montrent ces vols. En les lisant, je pense, j'espère en avoir couvert et donné quelques-uns,
00:27:02.16 a couvert chacun de ces sujets et j'espère que vous pourrez comprendre où nous en sommes dans notre compréhension de la façon dont la protéine d'enveloppe peut agir comme un régulateur positif,
00:27:09.28 ou comme régulateur négatif. Maintenant, ceux d'entre nous qui s'intéressent à la structure et à la fonction des protéines
00:27:14.18 peut se réjouir de cela, car il existe des protéines virales, des protéines de capside virale
00:27:20.08 ne sont que des régulateurs positifs.
00:27:22.03 Plus nous en saurons sur ces régulateurs positifs, plus nous pourrions en apprendre davantage sur la façon de créer un régulateur négatif à partir de ce positif
00:27:29.05 et utiliser ces connaissances pour élaborer des stratégies, développer des approches pour développer la résistance aux maladies,
00:27:34.28 afin que nous puissions avoir une plus grande résistance médiée par les protéines du manteau qui est plus durable.
00:27:40.01 Je vais vous montrer un bref exemple d'application de cette technologie, maintenant âgée de vingt ans,
00:27:46.11 il s'agit d'une collaboration entre mon laboratoire et un laboratoire à Hyderabad, en Inde,
00:27:51.23 c'est l'ICRISAT, il étudie les cultures qui sont importantes dans les régions tropicales méridionales du monde
00:27:59.28 et dans le sud de l'Inde, bien sûr, c'est assez tropical, très aride, et c'est leur objectif,
00:28:06.05 ainsi que de se concentrer sur l'Afrique. Voici un exemple de maladie de l'arachide qui est vraiment très dévastatrice,
00:28:13.03 ça peut être très dévastateur et c'est transmis par un insecte appelé, je veux dire un arthropode, les thrips.
00:28:20.02 Et il transporte le pollen d'une plante à l'autre, et le pollen, à l'extérieur du pollen,
00:28:25.10 est le virus et comme l'insecte mâche les feuilles, il transmet le virus de la surface du pollen à la structure de la feuille,
00:28:32.29 dans les cellules et la maladie s'en va.
00:28:35.16 Mais c'est très dévastateur et l'impact peut être assez remarquable, comme l'indiquent certains de ces titres dans le journal.
00:28:43.18 La maladie a été identifiée pour la première fois au milieu des années 90, elle réapparaît en fonction du temps et de l'humidité,
00: 28: 54.16 et les précipitations et vous pouvez voir que cela affecte la région de l'Inde qui est en quelque sorte au milieu, vers le bas,
00:29:00.09 l'état du Maharashtra se trouve ici, à Mumbai, puis à travers le Tamilnadu.
00:29:05.29 Et ce qui était important dans notre prise de conscience, c'est que cette maladie n'affecte pas seulement les arachides, ou les arachides,
00:29:12.29 mais cela affecte aussi d'autres cultures. Et nous avons trouvé si nous pouvions avoir une stratégie qui a aidé à développer une résistance contre ce virus dans les arachides,
00:29:20.06 nous pourrions également appliquer cela dans d'autres cultures ou d'autres institutions peuvent le faire.
00:29:24.08 Donc, c'est un exemple, le virus affecte le tournesol et si vous connaissez l'agriculture indienne,
00:29:31.11 vous savez que le tournesol et les arachides sont les principales sources d'huiles végétales utilisées dans la cuisine en Inde.
00:29:38.04 Ces deux maladies ont considérablement réduit la quantité d'huile de cuisson et doivent importer de l'huile de cuisson
00:29:43.25 provenant d'autres sources, y compris l'huile de palme et l'huile de soja.
00:29:47.20 La maladie affecte également les melons et le coton, et les soucis, elle affecte également l'industrie de la floriculture.
00:29:57.25 Ce qui était vraiment intéressant pour nous, c'est que ces virus qui sont dans ces différents groupes de plantes
00:30:03.08 sont très similaires les uns aux autres dans l'ordre. Nous sommes donc très optimistes, que si nous pouvions résoudre la maladie grâce aux arachides,
00:30:09.22 nous pourrions peut-être avoir un impact sur ces autres maladies.
00:30:13.26 Ce virus est très différent du virus de la mosaïque du tabac, mais il y avait une histoire d'étude de ce virus
00:30:20.22 peu de temps après que nous ayons décrit la résistance médiée par la protéine d'enveloppe contre les tobamovirus,
00:30:27.11 TMV et mosaïque de tomate, des collègues en Europe ont posé la question de savoir si oui ou non la résistance aux protéines de l'enveloppe
00:30:35.29 fonctionnerait contre ces classes de virus, c'est un groupe de virus appelé Ilar, un groupe auquel appartiennent d'autres maladies importantes.
00:30:45.07 La structure du génome de ce virus est assez différente de celle du TMV,
00:30:48.10 il y a trois molécules d'ARN différentes emballées dans cette particule circulaire
00:30:53.04 et la protéine d'enveloppe est en fait un ARN sous-génomique qui se détache de l'ARN3.
00:30:58.14 Nous avons travaillé au développement d'une construction génétique qui a ensuite été mise à la disposition de nos collègues en Inde.
00:31:06.27 Je devrais dire qu'avant de faire le travail, nous avions une liberté totale d'opérer avec toute l'inventivité
00:31:13.21 et nous avons passé des accords avec ceux qui aident les brevets pertinents et importants sur les processus et la technologie, en soi,
00:31:21.12 que si nous réussissions, ces produits seraient publiés gratuitement,
00:31:25.10 sans redevances ni frais de licence pour les agriculteurs indiens qui en avaient besoin.
00:31:30.02 Une sorte de philosophie que nous, dans le secteur universitaire, pouvons appliquer dans diverses conditions.
00:31:38.18 Ici, les diapositives montrent que l'effet de l'infection de plants d'arachide transgéniques avec ce virus dans des conditions de serre.
00:31:47.29 Nos collègues en Inde ont développé un grand nombre de lignées transgéniques
00:31:52.01 et maintenant les évalue pour la structure génétique et pour la résistance.
00:31:56.03 Ils ont plusieurs lignes. Il s'agit d'une lignée qui a un retard d'infection, mais pas un niveau élevé de résistance aux maladies.
00:32:05.25 Ces lignées, en revanche, sont très résistantes à l'infection,
00:32:10.21 ces lignées cellulaires, ces lignées végétales ont également un niveau plus élevé de protéine d'enveloppe que celles qui sont moins résistantes.
00:32:16.08 Donc, c'est un phénomène de résistance médié par les protéines d'enveloppe, nous espérons pouvoir étendre ce travail
00:32:23.17 dans d'autres études en serre et éventuellement dans des essais sur le terrain au cours des deux prochaines années.
00:32:29.19 Donc, je suis heureux que la technologie qui a maintenant plus de vingt ans puisse réellement être utilisée dans des situations de culture,
00:32:35.04 en Inde et nous pensons également dans d'autres parties du monde.
00:32:38.24 Alors, comment ça marche pour ce virus ? C'est comme TMV ?
00:32:41.29 Ça, on ne le sait pas, ça n'a pas du tout été étudié avec le même détail, dans le cas des lignées résistantes.
00:32:49.01 Mais certains travaux qui ont été effectués par le laboratoire de Lee Gehrke et publiés plus tôt dans Science,
00: 32: 53.23 a fourni un modèle structurel de la façon dont la protéine de capside de ce virus se lie à,
00:32:59.16 ou un virus qui ressemble au virus de la strie du tabac/de la mosaïque de la luzerne, ALNV, est un virus de la luzerne,
00:33:05.28 et avec une stratégie similaire pour la réplication. Et Lee et ses collègues ont examiné la structure
00:33:11.22 du complexe de protéine d'enveloppe avec l'ARN viral et a constaté que, oui en effet,
00:33:17.07 comme nous l'avons su d'après les expériences biologiques qui ont été faites au cours des vingt dernières années,
00:33:21.18 qu'en fait, la protéine de capside se lie à l'extrémité 3' de l'ARN viral
00:33:26.05 à certaines de ces structures en boucle en épingle à cheveux et importantes pour réguler la réplication.
00:33:30.07 Le défi est que nous savons que la protéine d'enveloppe est un régulateur positif, elle est essentielle pour la réplication du virus.
00:33:36.26 Alors, comment ça marche en tant que régulateur négatif ? Que nous ne savons pas.
00:33:40.18 Qu'il crée des structures spécifiques ou des intermédiaires qui bloquent sa fonction de régulateur positif
00:33:47.04 nous ne savons tout simplement pas et nous avons besoin d'un travail continu pour comprendre comment cela fonctionne.
00:33:51.16 Je veux parler d'un virus très différent.
00:33:54.16 C'est un virus qui est un pararétrovirus. La maladie est en fait causée par la co-infection de deux virus,
00:34:01.05 un qui est sphérique, contient de l'ARN, un qui est bacilliforme.
00:34:04.20 Ces deux ensembles peuvent être transmis par l'insecte vecteur, une cicadelle verte,
00:34:10.03 et si transmis à un jeune plant de riz, c'est montré dans ce cas,
00:34:14.10 que le résultat est qu'il provoque un nanisme de la plante, il retarde sa croissance,
00:34:21.02 et accumule de grandes quantités de particules virales dans le tissu du phloème et provoque cette décoloration sévère.
00:34:28.13 Dans les cas graves, l'infection est si forte qu'elle empêche le développement au point qu'il n'y a pas de panicule
00:34:35.17 et s'il n'y a pas de panicule, il n'y a pas de graines de riz.
00:34:37.25 J'ai vu des champs en Inde où la maladie est de l'ordre de seulement, cela réduit la production, le rendement de la récolte
00:34:46.29 jusqu'à 80%. C'est périodique, cela dépend de la disponibilité de l'insecte
00:34:54.16 et s'il y a ou non des plantes infectées dans la région.
00:34:57.18 Ce virus est responsable de la fabrication des protéines qui permettent à l'insecte vecteur d'acquérir ce virus,
00:35:07.04 ainsi que ce virus. Depuis plusieurs années, nous étudions la résistance à médiation par les protéines d'enveloppe contre ce virus,
00:35:13.22 et celui-ci est un virus intéressant car il contient trois molécules de capside,
00:35:18.04 il ressemble plus à certains virus animaux qu'à tout autre virus végétal que nous connaissons.
00:35:23.10 Mais le niveau de résistance fourni par la protéine d'enveloppe, ou les protéines de capside, dans les lignées de riz transgéniques, était faible.
00:35:30.11 Cela a réduit le nombre de réplications et de maladies, mais en fait, nous avons appris que ce virus est l'agent responsable du retard de croissance.
00:35:39.09 Nous avons ensuite commencé à attaquer cela, pour en savoir plus sur le fonctionnement de ce virus.
00: 35: 43.15 Et grâce au travail d'un certain nombre de collègues exceptionnels, nous avons appris que nous avons déchiré ce virus
00:35:53.17 et apprendre comment fonctionne le promoteur et comment se déroule la réplication.
00: 35: 57.06 C'est un virus qui ne vit pas aux États-Unis et donc, toutes les expériences qui y sont liées doivent être confinées dans des environnements contrôlés
00:36:06.24 et des chambres verrouillées et ainsi de suite. Il appartient à une classe de virus appelés pararétrovirus.
00:36:11.29 Et le cycle de vie d'un pararétrovirus est très différent de celui du virus de la mosaïque du tabac.
00:36:17.14 Le virus pénètre dans la cellule et, encore une fois, dans ce cas, en se nourrissant de l'insecte,
00:36:21.19 et vous pouvez voir qu'après le démontage, l'information génétique, l'ADN double brin,
00:36:29.07 va dans le noyau de la cellule. Contrairement à d'autres pararétrovirus, celui-ci, il n'y a aucune preuve que celui-ci s'intègre dans le génome viral.
00:36:36.04 Mais ici, il forme un minichromosome et cela se traduit par le produit d'un plus grand nombre d'ADN double brin,
00: 36: 43.20 qui est transporté par un mécanisme inconnu, va dans le cytoplasme
00: 36: 47.13 où l'expression des gènes conduit à la production de protéines de capside et de protéines de mouvement, etc.
00:36:51.19 et ensuite l'assemblage de plus de particules virales.
00:36:54.22 Donc, c'est très différent du virus de la mosaïque du tabac ou d'autres virus contenant de l'ARN.
00:36:59.14 Le génome du virus est un virus à ADN double brin circulaire.
00:37:05.10 La région promotrice, qui est responsable de la création de cette transcription complète, montrée dans cette bande sombre ici,
00:37:11.15 est dans cette région. Maintenant, en étudiant cela dans les plants de riz et dans d'autres plantes,
00:37:17.15 nous avons trouvé, nous avons appris que le promoteur qui se trouve dans cette région,
00:37:20.26 lorsqu'il est lié à un gène rapporteur, montre l'expression de ce promoteur uniquement dans le tissu vasculaire.
00:37:25.29 C'est en accord avec l'observation faite par les phytopathologistes que le virus s'accumule dans les tissus vasculaires.
00:37:32.20 Dans nos études et par la suite de la région promotrice, nous sommes arrivés à identifier une région unique dans cette séquence promotrice
00:37:40.28 qui était différent des autres séquences qui avaient été décrites comme des séquences liées au promoteur.
00:37:47.13 Et nous l'avons appelé Box II, c'est à proximité du site de la protéine de liaison TATA, site de liaison.
00:37:55.15 Grâce à l'hybride simple standard et à deux types de procédures hybrides, nous avons identifié des protéines qui se lient à cette séquence promotrice.
00:38:06.04 Nous les appelons RF2a, riz facteur deux a, riz facteur deux b.
00:38:12.07 Ceux-ci peuvent former une liaison, ils peuvent se lier à cette séquence Box II dont je vous ai parlé plus tôt,
00:38:17.12 soit sous forme d'homodimères, soit sous forme d'hétérodimères. Ces deux éléments sont des activateurs de la transcription.
00:38:22.20 Nous avons caractérisé la fonction de chacun de ces domaines, riche en proline, riche en acide glutamique et ce domaine riche en glutamine,
00:38:30.28 et le domaine acide et ainsi de suite.
00:38:32.26 Voici une protéine supplémentaire, c'est RF, c'est une protéine que nous appelons RLP1.
00: 38: 40.02 C'est également une protéine bZIP, mais elle ne se lie pas uniquement au site de liaison à l'ADN
00:38:46.15, il ne peut se lier qu'en présence de RFIIa ou RFIIb.
00:38:50.10 Mais c'est un régulateur négatif.
00:38:52.26 Donc, notre modèle est que, comme vous le savez, ces domaines bZIP reconnaissent une séquence de liaison unique
00:39:00.09 et comme cette séquence est liée et remplit sa fonction,
00: 39: 03.13 et l'une des fonctions, apparemment, est que, en se liant, il peut interagir avec la protéine de liaison TATA,
00: 39: 08.18, nous avons montré qu'il existe une interaction spécifique entre le domaine de l'acide glutamique de ces protéines
00:39:14.07 et la protéine de liaison TATA qui joue probablement un rôle dans la liaison de l'holoenzyme à ce promoteur.
00:39:21.03 Une fois qu'il se lie, il produit l'ARN messager et s'en va la traduction et ensuite le processus de réplication et d'empaquetage qui sont nécessaires.
00:39:30.13 Mais la caractérisation de ces facteurs de transcription était une partie intéressante de l'exercice,
00:39:36.09 mais nous avons ensuite eu quelques idées sur la façon dont nous pourrions utiliser ces informations.
00:39:40.03 Voici une hypothèse : si la stratégie de réplication implique ces facteurs de transcription,
00:39:49.10 comment fonctionnent ces facteurs, quels sont les rôles de ces facteurs de transcription dans le développement des plantes ?
00:39:53.09 Nous avons donc mis l'accent expérimental sur l'étude du promoteur
00:39:58.23 et nous, et la surexpression des facteurs de transcription dans les lignées transgéniques.
00:40:03.09 Par exemple, voici une lignée transgénique qui a, dans laquelle nous avons réduit la quantité d'un facteur de transcription
00:40:11.06 en utilisant une construction de gène antisens. Donc, une lignée transgénique qui n'a pas l'air très heureuse, elle est rabougrie.
00:40:16.01 Il n'a pas non plus beaucoup de racines.
00:40:18.10 Mais il peut devenir trop grand avec le temps. Et finalement, il produira une petite quantité de graines.
00:40:24.28 En revanche, c'est un autre dans lequel nous avons surexprimé RFIIb, le deuxième activateur transcriptionnel.
00:40:34.09 Et vous voyez que ces plantes peuvent traverser ce processus précoce, mais elles ne continuent pas plus loin.
00:40:40.10 Ils sont rabougris. En fait, une partie de la coloration des feuilles semble intéressante,
00:40:44.02 en ce sens qu'ils manquent de certains pigments et qu'ils ont un peu de teinte rouge dessus.
00:40:50.04 C'est ce qui se passe lorsque nous surexprimons RLP1, le régulateur négatif.
00: 40: 55.11 Quand nous abattons ce gène, cette quantité de RLP1 avec une construction de gène antisens,
00:41:01.13 nous n'avons vu aucun phénotype. Nous avons vu un phénotype lorsque nous avons surexprimé la quantité de RLP1.
00:41:07.21 Maintenant, si nous comparons et contrastons les symptômes de la maladie causée par le virus,
00:41:15.19 et n'importe lequel de ces phénotypes de lignées transgéniques, il ressemble le plus à celui-ci, rabougri et légèrement décoloré.
00:41:21.29 Et nous avons commencé à avoir l'hypothèse que peut-être l'infection virale avait un effet sur le développement
00: 41: 28.01 en réaffectant, repositionnant ou réutilisant ces facteurs de transcription pour la réplication du virus
00:41:34.17 et ne permettant pas à l'hôte de faire son propre développement.
00:41:37.25 Et cela a été confirmé par cette expérience. Shunhong Dai et ses collègues ont développé des lignées transgéniques
00:41:48.06 qui surexprimait la protéine de liaison à l'ADN de l'un de ces activateurs de transcription, RF2a.
00:41:54.18 Ceux d'entre vous qui connaissent la régulation des gènes savent que lorsque vous surexprimez le domaine de liaison à l'ADN,
00:42:02.05 il agit comme un répresseur négatif dominant et il se lie aux sites de l'ADN chromosomique de l'organisme,
00:42:09.07 se lie aux sites auxquels le facteur de transcription se lierait normalement, et ne permet donc pas au facteur de transcription de s'y lier.
00:42:16.23 Maintenant, lorsque nous avons exprimé cette protéine négative dominante sous le contrôle d'un promoteur qui fonctionnerait dans tous les types de cellules,
00:42:25.14 le promoteur de l'ubiquitine, nous avons un très fort phénotype de retard de croissance.
00:42:30.07 Lorsque nous utilisons un promoteur différent, celui-ci du virus, le virus du tungro du riz,
00:42:36.11 et exagérez ce type, nous avons également eu des retards de croissance, pas aussi graves que vous l'imaginez si vous y réfléchissez.
00:42:44.06 Ce n'est pas aussi grave. Si nous surexprimons la protéine négative dominante en utilisant des promoteurs connus pour être exprimés dans le tissu vasculaire,
00:42:55.01 c'est le promoteur rétréci 1 du maïs que nous avons utilisé dans ce cas,
00:42:59.07 et cela provient d'un gène appelé phénylalanine ammonia lyase, les deux sont également des tissus vasculaires,
00:43:05.14 nous avons un retard de croissance. D'un autre côté, si nous exprimions cette protéine négative dominante dans des cellules vertes,
00:43:13.06 ce sont ceux qui ne sont pas en gros du tissu vasculaire, ce sont le tissu mésofiller dans les feuilles,
00:43:18.09 enfin, les plantes ne sont pas rabougries, et cela, encore une fois, était une validation que la fonction de ceci, des protéines qui ont ce domaine,
00:43:30.19 sont importants pour la croissance et le développement des plantes par la croissance et l'influence sur le tissu vasculaire.
00:43:36.21 N'oubliez pas que le virus infecte aussi les tissus vasculaires.
00:43:42.07 Donc, nous avons ensuite pris ces lignées cellulaires et demandé si elles étaient résistantes ou non à l'infection virale.
00:43:49.10 Et je vais vous montrer deux séries d'études. Je veux vous montrer ensuite le résultat d'une étude
00:43:55.06 qui a été fait aux Philippines par des collègues et PhilRice, un institut financé par le gouvernement.
00:44:01.18 Et ils avaient la capacité de nourrir ces plantes d'insectes, avec des insectes, qui avaient déjà été nourris de plantes infectées par le virus.
00:44:10.29 Et puis nous avons juste regardé si les plantes tombaient malades ou non,
00:44:15.14 s'ils étaient rabougris.
00:44:16.18 Et le Dr Alfonso et ses collègues ont montré que la plante était rabougrie, comme prévu,
00:44:24.01 et c'est très similaire à une variété sensible qu'ils utilisent aux Philippines.
00:44:29.03 Maintenant, la lignée de plantes pour ce pot étiqueté numéro 3 est une lignée de riz, un cultivar de riz, qui est infecté, résistant à l'infection, ou mange,
00:44:41.20 par l'insecte. Il n'est pas forcément résistant au virus en soi, mais l'insecte n'aime pas s'en nourrir,
00:44:48.01 donc il a une capacité de résistance car il n'est pas nourri par l'insecte.
00:44:53.29 Et à côté, les lignes 4 et 5 sont les lignes de plantes pour lesquelles nous avons une surexpression du facteur RF2a.
00:45:02.02 Et ceux qui ont une surexpression du facteur RF2b, et ils ressemblent beaucoup plus à cette ligne.
00:45:07.06 Ainsi, nos plantes ne sont pas devenues plus malades plus rapidement, elles avaient plutôt une certaine résistance aux maladies.
00:45:14.16 Quand nous avons pensé à ces expériences, en avons parlé au labo,
00: 45: 18.27 nous avons pensé, eh bien, peut-être que le virus utiliserait simplement plus de ces facteurs de réplication,
00:45:22.21 ou ces facteurs de transcription et se répliquent plus rapidement. Il semble que ce ne soit pas le cas.
00:45:26.27 Donc, nous devions le montrer, et avec des études supplémentaires.
00:45:30.02 Nous avons ensuite continué et avons appris à faire l'inoculation du virus, pas avec des insectes,
00:45:37.03 mais en laboratoire avec un outil spécial dont nous disposions, utilisant une agrobactérie pour arbitrer le processus d'infection.
00:45:44.08 Et bien sûr, gardez-les dans des chambres fermées à clé.
00:45:47.24 Et c'est le résultat de ces expériences que nous avons eues dans notre laboratoire
00:45:53.13 et je veux vous les montrer en contraste avec ce qui s'est passé aux Philippines.
00:45:57.12 Donc, dans cette ligne, donc, cela représente la population de trente plantes qui ont été inoculées.
00:46:04.17 Dans le cas des plantes qui sont en ligne de contrôle, vous voyez qu'après l'inoculation, en bas dans le coin inférieur,
00:46:13.04 et en traçant ceci, d'ici environ 35 ou 40 jours, les plantes cessent de croître.
00:46:20.12 Ils sont rabougris, ils cessent de grandir, comme on aurait pu s'y attendre.
00:46:24.20 Les lignes ci-dessus sont une série de commandes. Cette ligne rouge est un partenaire non inoculé, c'est la même ligne que celle-ci,
00:46:33.10 mais pas infecté, vous pouvez voir comment les plantes ont continué à pousser.
00:46:36.26 Et puis nous montrons les lignes de plantes RF2b et RF2a, et vous voyez que les lignes de plantes qui sont en bleu,
00:46:44.16 ce sont les deux lignées qui ont la surexpression de RF2a, le facteur de transcription.
00:46:52.22 Et ils poussent aussi bien, sinon légèrement mieux, que les témoins qui n'ont pas été inoculés.
00:46:57.05 De même, la population de lignées végétales RF2b est indiquée dans ce panneau.
00:47:04.01 Dans ce panneau, nous examinons l'incidence des maladies dans les populations de plantes.
00:47:09.25 Ceci a été développé par nos collègues aux Philippines. Et dans ce cas, vous avez une formule mathématique pour l'incidence de la maladie
00:47:16.22 et vous pouvez voir qu'il y a moins d'incidence de la maladie sur une période de deux mois par cette lignée de plantes,
00:47:22.04 qui a une résistance à l'insecte. Une de nos lignées végétales, deux de nos lignées végétales sont très similaires dans leur résistance
00:47:27.22 à cette gamme de modèles qu'ils utilisent comme contrôle interne.
00:47:31.29 Ici, vous voyez une bulle, indiquant que ces plantes très résistantes présentent une explosion de symptômes de maladie dans les jeunes feuilles,
00:47:41.09 mais au fur et à mesure que les plantes poussent, elles ont tendance à devenir trop grandes et l'indice de gravité de la maladie est plus faible.
00:47:46.18 Les autres lignées végétales qui contiennent l'autre facteur de transcription sont un peu différentes de celles-ci, mais beaucoup moins que le témoin.
00:47:53.14 Maintenant, l'une des possibilités que nous avons envisagées était que si nous utilisions davantage le facteur de transcription,
00:47:58.29 le virus l'utiliserait et vous vous répliqueriez davantage. Et vous auriez un virus, une maladie plus grave que dans le contrôle.
00:48:07.20 Et cela ne s'est clairement pas produit ici.
00:48:09.18 Mais nous ne savions rien des processus moléculaires donc Shunhong (Dai) et ses assistants
00:48:17.22 a travaillé pour créer des lignées cellulaires à partir de ces lignées transgéniques et non transgéniques.
00:48:22.24 Ces lignées cellulaires pourraient ensuite être inoculées avec le virus et nous pourrions étudier les courbes de croissance à cycle unique.
00:48:29.23 Maintenant, je vous rappelle que ce sont des cellules non différenciées, elles n'ont pas de phloème, elles n'ont pas de tissu vasculaire
00:48:35.21 mais ils sont dédifférenciés pour la production de ces facteurs de transcription.
00:48:41.21 En d'autres termes, nous nous attendons à ce que les facteurs de transcription soient fabriqués dans ces lignées cellulaires.
00:48:45.29 Et puis, bien sûr, le transgène que nous avons introduit dans ces cas introduirait la surproduction de RF2a,
00:48:55.08 ainsi que RF2b. Ce que nous montrons ici dans ces panneaux est l'accumulation d'ARN viral dans des cellules non transgéniques
00:49:03.06 et dans des cellules transgéniques.
00:49:05.25 Il est clair que cette bande est plus légère, il y a moins d'ARN viral dans celle-ci, dans ces deux lignées alors il y en a dans le contrôle.
00:49:13.10 C'était une surprise. Nous n'avions pas prévu que ce serait le cas.
00:49:17.25 Shunhong a poursuivi ses études et c'est vraiment un endroit pour dire si vous êtes un étudiant diplômé ou un post-doctorant
00:49:25.03 et vous avez une bonne idée, allez-y et faites-la si vous le pouvez.
00:49:27.28 Je lui ai conseillé de ne pas faire l'étude et il est allé de l'avant et vraiment à ma grande surprise,
00:49:34.22 a révélé plus de détails sur la résistance que ce que j'avais prévu.
00:49:41.15 Donc, c'est maintenant de retour en utilisant des plantes, pas des lignées cellulaires, mais des plantes.
00:49:46.09 Et ce sont des lignées de plantes qui ont été sélectionnées
00:49:49.14 et dans ce groupe il y a trente plantes individuelles qui sont, les feuilles sont prises sur trente plantes
00:49:54.20 et combinés ensemble, donc si vous comptez ici, vous pouvez imaginer combien de plantes ont été cultivées dans cette expérience.
00:50:01.15 Et vous pouvez voir sur la ligne bleu foncé que dans les cellules ou plantes non transgéniques,
00: 50: 08.21 la quantité d'ARN viral s'accumule à un niveau élevé environ vingt à vingt-cinq jours après l'inoculation
00:50:15.19 puis tombe et reste haut. Les lignées cellulaires transgéniques qui surexpriment, surproduisent la quantité de RF2a et RF2b
00:50:23.01 ont considérablement moins d'ARN viral que les témoins et que ce groupe en a beaucoup moins.
00:50:29.17 Et le virus lui-même ? Il a donc fait l'expérience de faire de la PCR directe au lieu de la RT PCR en temps réel ici.
00:50:37.04 Il a ensuite fait l'accumulation d'ARN viral et c'est vrai, c'est cette ligne, cet ensemble de lignes que vous voyez avec les barres courtes
00:50:45.08 sont très résistants, non seulement à la réplication, non seulement à l'expression des gènes, mais aussi à l'accumulation de virus.
00:50:51.01 Donc, ces lignes ne sont pas seulement belles, elles contiennent moins de virus.
00: 50: 55.11 Maintenant, cela pourrait, vous pouvez anticiper alors que ces facteurs, ces facteurs de transcription
00:51:00.17 n'affectent pas seulement la croissance et le développement de la plante,
00:51:03.21 mais ils pourraient avoir quelque chose à voir avec cette transition de la sensibilité d'une plante juvénile à la résistance de la plante plus adulte.
00:51:11.28 Maintenant, peut-être en affectant la voie de l'immunité innée ou d'autres voies qui fournissent une résistance innée à la plante
00:51:19.10 à mesure qu'il grandit. Le modèle que nous avons maintenant pour la réaction de résistance est assez différent de ce que nous avions imaginé
00:51:26.25 ou que nous avons vu dans le cas des tobamovirus, virus de la mosaïque du tabac. Dans ce cas, l'insecte se nourrit,
00: 51: 34.04 porte un virus à une jeune plante et comme un virus envahit, envahit dans le tissu du phloème, comme je l'ai dit plus tôt,
00:51:43.01 où se trouvent ces facteurs de transcription, et nous suggérons que les facteurs de transcription soient réaffectés
00: 51: 47.14 à la réplication et à l'expression génique du génome viral, entraînant ainsi un retard de croissance et une maladie
00:51:53.14 et que ce que nous avons fait est de changer cet équilibre afin que nous soyons maintenant capables de dépasser l'infection virale.
00:52:00.12 Maintenant, le dernier groupe de virus dont je veux parler très brièvement est très différent
00:52:05.00 que l'un ou l'autre des deux exemples que j'ai montrés auparavant. Il s'agit d'un groupe de virus qui sont des virus à ADN simple brin.
00:52:11.27 Ils sont importants dans les régions tropicales et subtropicales du monde, ils causent de graves maladies.
00:52:19.10 Ils sont caractérisés par une grande variation génétique
00:52:23.08 et beaucoup de croisements entre les espèces virales.
00:52:30.03 Ils se mélangent, ils se recombinent, produisent plus de pathotypes et la maladie peut être plus ou moins grave
00:52:35.26 selon le résultat du croisement génétique, ou le mélange de la génétique.
00:52:42.00 C'est une maladie causée par le manioc et il s'agit d'une lignée végétale gravement touchée, elle est clairement très rabougrie.
00:52:50.17 La plante de manioc produit de grosses racines pleines d'amidon et est une seule source de sucre, ou de carbone,
00:52:58.20 pour des centaines de millions de personnes rien qu'en Afrique.
00:53:02.02 Mais normalement, il atteindrait une hauteur de quelque part au-dessus de deux mètres,
00:53:06.21 s'il est bien nourri, s'il n'y a pas de maladies. Celui-ci est une tige très courte qui mesure peut-être moins de 20 centimètres.
00:53:17.16 Le virus qui envahit, qui cause cette maladie, est un gémeaux. Les Gémeaux gémissent car ils ont deux particules,
00: 53: 24.21 les uns sur les autres et transportés, il s'agit d'un groupe de virus appelés les virus Gemini de l'ancien monde,
00:53:32.06 ont deux composants d'ADN. Et je ne vais pas passer par la stratégie de réplication de ce virus,
00:53:37.00 c'est assez différent de ceux dont j'ai parlé plus tôt dans cette conférence.
00:53:40.13 L'une des stratégies adoptées par le Dr Fauquet et ses collègues consiste à utiliser une stratégie siRNA
00: 53: 47.02 basé sur des séquences spécifiques, déterminant quelles séquences sont sensibles aux siARN
00: 53: 52.12, puis ingénierie des plantes par transformation génétique pour créer des lignées végétales
00:53:57.12 qui peut ensuite être testé dans des serres et des chambres de croissance
00:54:00.11 et vous qu'il a pu développer des plantes résistantes aux virus qui ont une stratégie siRNA.
00:54:06.13 Maintenant, une autre stratégie qu'il a adoptée est basée sur les travaux du Dr Bruce Alberts et de ses collègues
00:54:11.19 au milieu des années 1970, quand Bruce était dans le département de biochimie de l'UCSF.
00: 54: 17.05 Et dans ce cas, nous étudiions un inovirus, un bactériophage et avons identifié une protéine de liaison à l'ADN, ce qu'on appelle G5,
00:54:26.10 et un post-doc dans notre laboratoire il y a plusieurs années a montré que la protéine G5 pouvait être produite dans E. coli
00:54:33.27 et pourrait se lier à l'ADN du virus Gemini.
00: 54: 36.21 Il a ensuite fait des expériences pour développer des lignées végétales qui surexprimeraient la protéine G5
00:54:43.02 et trouvé, étonnamment, la capacité de ralentir la réplication des virus gémeaux.
00:54:48.26 Cela a conduit, ensuite, à des études supplémentaires dans lesquelles nous avons amélioré l'expression des gènes par une variété d'outils bien connus
00: 54: 57.07 qui sont utilisées par les biologistes moléculaires et qui ont ensuite développé des plantes transgéniques qui transportent et produisent de plus grandes quantités de cette protéine G5
00:55:06.04 et avoir une certaine résistance. Maintenant, la partie intéressante de cette stratégie est que la protéine G5 ne se lie pas en fonction de la séquence.
00:55:13.00 Ce n'est pas spécifique à la séquence. Ainsi, on pourrait penser qu'il se lierait à n'importe quel ADN simple brin.
00:55:18.02 D'un côté, vous pourriez penser que la protéine affecterait la croissance et le développement des plantes.
00:55:22.05 Jusqu'à présent, nous n'avons rien vu de tout cela. Mais nous avons vu que les lignées végétales qui contiennent cette protéine sont résistantes à une variété de virus gémeaux.
00:55:31.25 Par exemple, il s'agit d'un virus de la mosaïque du manioc du Sri Lanka et qui est assez éloigné de l'Afrique
00:55:41.07 et la séquence de ce virus est assez différente des autres en Afrique.
00:55:45.08 Pourtant, l'expression de cette protéine G5 confère une résistance contre cette souche par rapport au témoin.
00:55:53.28 Il fonctionne également très bien contre une souche de la maladie de la mosaïque du manioc en Ouganda.
00:56:01.16 Et un du Kenya, comme le montrent ces diapositives.
00:56:07.03 Maintenant, cela nous donne un peu d'espoir qu'une protéine comme celle-ci aurait peut-être une résistance pantypique contre de nombreux types de virus gémeaux
00: 56: 17.19 et que le travail se poursuit et que l'état actuel de ce projet est qu'il est maintenant passé de la phase expérimentale
00:56:24.16 à celui qui, nous l'espérons, conduira au développement de matériel pouvant être testé en Afrique par nos collègues en Ouganda et au Kenya
00:56:33.10 et d'autres parties du continent.
00:56:35.17 Nous avons établi des partenariats solides dans lesquels leurs scientifiques viennent au Centre Danforth pour la recherche sur les virus gémeaux
00:56:43.02 et développer des outils biotechnologiques pour détecter le virus puis développer des lignées résistantes.
00:56:48.29 Donc, nous apprenons un peu ce que signifie être pré-commercial.
00:56:53.29 Comment faites-vous cela? Les institutions académiques ne sont pas très bonnes dans ce domaine, nous avons essayé d'apprendre du secteur privé.
00:56:59.12 Nous avons des applications en place auprès des comités institutionnels de biosécurité en Ouganda et au Kenya
00:57:08.27 avec un cultivar que nous appelons 60444. Maintenant, le problème est que 60444 est un beau modèle de laboratoire
00: 57: 15.22 et il est utilisé dans certains contextes comme variété commerciale pour la production d'amidon,
00:57:20.18 mais en fait ce n'est pas le préféré des agriculteurs et si vous avez mangé des pommes de terre, des ignames et du manioc,
00:57:28.21 vous savez que les variétés sont différentes et vous aimerez une certaine variété, mais pas une autre.
00:57:32.18 Donc, le défi est maintenant de transférer la technologie qui fonctionne apparemment dans ce cultivar modèle
00:57:37.13 dans les cultivars préférés des agriculteurs. Ainsi, nos confrères ont identifié ceux qui sont le plus préférés par les agriculteurs
00:57:43.23 et nous faisons maintenant la construction et le travail pour transformer ce matériel, les meilleures constructions génétiques, en ces variétés qui seraient utilisées par les agriculteurs.
00:57:53.14 Les directeurs du projet ici sont Claude Fauquet et Nigel Taylor.
00:57:56.25 Nigel est le spécialiste de la transformation et de la régénération des tissus et Claude le virologue des gémeaux.
00:58:03.26 Et nous avons travaillé maintenant sur ce projet, ou ils ont travaillé sur ce projet, pendant près de vingt ans,
00:58:07.18 avec, maintenant, un certain succès. Et avec de nombreux collègues venus d'Afrique et d'Amérique latine pour aider.
00:58:14.08 Mais le travail n'est pas terminé et c'est, je pense, l'avant-dernière diapositive.
00:58:19.15 Cela nous rappelle que les projets qui se déroulent dans les laboratoires sont loin des projets qui aboutissent sur le terrain.
00:58:30.03 Dans le développement de médicaments qui auraient des applications pharmaceutiques,
00:58:34.25 les universitaires transmettent normalement leurs meilleures pistes au secteur privé pour les aider à les développer à des fins commerciales.
00:58:42.19 Et c'est en grande partie le cas en biotechnologie agricole, nous savons que les grandes entreprises ont eu beaucoup de succès
00:58:48.25 dans le maïs et le soja et le canola et le coton et ainsi de suite,
00:58:53.19 mais le projet dont nous parlons ici est un projet qui a peu ou pas de valeur commerciale.
00:58:58.04 C'est une récolte importante pour ceux qui vivent avec 1 à 2 dollars par jour.
00:59:03.27 Ils peuvent acheter assez pour un dollar par jour pour se nourrir et nourrir leur famille, une famille de quatre ou cinq personnes.
00:59:09.13 Mais c'est tout ce qu'ils pourraient manger. Et donc cela a peu ou pas de valeur commerciale,
00:59:15.15 nous l'avons donc fait dans le cadre de partenariats qui ont commencé aux États-Unis et qui, nous l'espérons, se termineront dans des domaines en Afrique ou en Asie.
00:59:25.14 Mais c'est un long processus. Notre travail de base, en fait, a commencé en 1988
00:59:31.14 et ce n'est qu'en 1999 que nous avons la première lignée transgénique qui semblait prometteuse.
00:59:36.10 Mais il a échoué dans des conditions plus strictes.
00:59:40.18 Tout recommencé, reconfiguré les usines, maintenant celles-ci fonctionnent depuis un certain nombre d'années.
00:59:47.00 Nous sommes prêts pour nos premiers essais sur le terrain confinés. Ce sont des essais sur le terrain qui se déroulent dans un espace confiné
00:59:52.15 auquel personne n'a accès, qu'aucun matériel ne laisse.
00:59:55.19 Il est brûlé et détruit dans ce champ.
00:59:58.09 S'ils réussissent là-bas, cela passe à l'étape suivante des essais, dans les champs des agriculteurs.
01:00:02.26 Cela peut prendre plus de temps. Pendant que vous faites cela, dans cette réitération, vous devez travailler avec les organismes de réglementation.
01:00:09.12 N'oubliez pas que les cultures transgéniques sont réglementées différemment des plantes développées par croisement classique
01:00:16.00 ou par la reproduction par mutation, le bombardement de neutrons à haute énergie, et ainsi de suite,
01:00:20.29 casser et réarranger les chromosomes est quelque chose qui est approuvé par les processus,
01:00:26.12 mais le génie génétique à ce stade ne l'est pas, il est réglementé différemment, donc en tant qu'universitaires, nous devons apprendre comment faire cela.
01:00:32.04 C'est un processus très long et très coûteux.
01:00:35.06 Et c'est en partie ce qui limite, je pense, l'implication du secteur public,
01:00:40.18 comme les scientifiques du Danforth Center ou les scientifiques, peut-être dans votre institution, de devenir de véritables contributions à la biotechnologie agricole.
01:00:48.26 Mais cela prend du temps et cela demande du dévouement et un financement spécifique qui lui permettront de continuer.
01:00:54.11 Alors, qu'avons-nous appris et que vous ai-je dit aujourd'hui ?
01:00:57.11 J'ai essayé de décrire un certain nombre de stratégies utilisées pour développer des cultures résistantes aux maladies.
01:01:03.27 Nous avons réalisé un excellent processus de résistance aux virus.
01:01:06.16 D'autres laboratoires progressent dans le développement de résistances aux infections fongiques ou aux nématodes, aux nématodes parasites et aux bactéries.
01:01:16.23 Dans notre cas, nous nous sommes principalement concentrés sur les réactions de résistance à base de protéines,
01:01:22.09 beaucoup d'autres laboratoires travaillent sur des événements médiés par l'ARN.
01:01:25.05 Grâce à cela, nous avons beaucoup appris sur ce qui fonctionne et ce qui ne fonctionne pas.
01:01:28.15 Et comme nous l'avons fait, nous en avons appris plus sur l'hôte, plus sur le virus
01:01:33.12 et, espérons-le, avoir plus de chances de contribuer à la production de nourriture et à la nutrition,
01:01:39.22 dans le monde entier, là où les sciences végétales, les sciences fondamentales et le côté animal peuvent apporter leur contribution,
01:01:48.02 si nous nous concentrons sur l'importance de la science fondamentale et de la traduction en applications telles que celles dont j'ai parlé aujourd'hui.
01:01:54.20 J'espère que vous avez trouvé cela intéressant et si vous souhaitez me contacter, n'hésitez pas à le faire,
01:02:01.00 sur le site Web indiqué sur la première diapositive.
01:02:04.03 Merci et j'espère que vous passez une bonne journée.
01:02:06.11 Bonne chance.

  • Partie 1 : Biologie de l'infection par le virus des plantes

TOXINES

Il existe un grand nombre de toxines bactériennes qui pourraient être utilisées comme arme biologique. Ils ont des taux de mortalité élevés, sont très toxiques et sont facilement produits, comme ce serait le cas de la toxine de Clostridium botulinum. Ces toxines produisent le botulisme. Une autre toxine intéressante est la ricine (extraite de l'arbuste Ricinus communis) qui a déjà été utilisé comme arme biologique, n'a pas d'antidote et, selon le CDC, est l'un des poisons les plus puissants connus.

Grâce à la modification génétique, il a été obtenu que des bactéries telles que Escherichia coli (qui ne produisent pas ces toxines) peuvent les générer. En insérant des gènes spéciaux dans des bactéries non pathogènes, il devient plus facile de produire de grandes quantités de toxines.

NE PANIQUEZ PAS! Les nations actuelles ont de vastes programmes de prévention et de biodéfense. La recherche et la connaissance de ces micro-organismes sont les solutions à une éventuelle attaque biologique.


Fiche d'information sur les attaques biologiques : agents pathogènes humains, biotoxines et menaces agricoles

Une attaque biologique est la libération intentionnelle d'un agent pathogène (agent causant une maladie) ou d'une biotoxine (substance toxique produite par un organisme vivant) contre des humains, des plantes ou des animaux. Une attaque contre des personnes pourrait être utilisée pour causer la maladie, la mort, la peur, des perturbations sociétales et des dommages économiques. Une attaque contre les plantes et les animaux agricoles causerait principalement des dommages économiques, une perte de confiance dans l'approvisionnement alimentaire et une éventuelle perte de vies humaines. Il est utile de distinguer deux types d'agents biologiques :

  • Agents transmissibles qui se transmettent d'une personne à l'autre (par exemple, la variole, Ebola) ou d'un animal à l'autre (par exemple, la fièvre aphteuse).
  • Agents qui peuvent causer des effets indésirables chez les personnes exposées, mais qui ne rendent pas ces personnes contagieuses pour les autres (par exemple, le charbon, la toxine botulique).

Le département américain de la Sécurité intérieure et les National Academies se sont associés en 2003 pour produire des fiches d'information sur les attaques chimiques, biologiques, radiologiques et nucléaires conçues pour aider à mieux préparer les médias aux types de menaces auxquelles la nation est confrontée.

Chaque fiche d'information fournit des informations claires et concises aux médias et au public sur les caractéristiques, les dangers et les conséquences associés aux divers types d'attaques. Chaque fiche d'information a fait l'objet d'un processus rigoureux d'examen par les pairs évalué par des membres indépendants des académies nationales, dont beaucoup sont reconnus comme les meilleurs experts du pays dans leur domaine.


Fond

Tous les organismes vivants ont développé des moyens de se protéger contre les agressions abiotiques et biotiques. Par exemple, les microbes utilisent des systèmes de restriction/modification de l'ADN pour se protéger contre l'ADN étranger, ils contiennent également des systèmes pour détoxifier et/ou extruder les xénobiotiques ou les espèces réactives excessives de l'oxygène (ROS). Les organismes multicellulaires utilisent d'autres systèmes, et la participation d'un ou plusieurs niveaux d'immunité est souvent impliquée. Le mieux étudié et le plus apprécié chez les vertébrés à mâchoires est le système immunitaire acquis/adaptatif avec ses cellules B et T bien connues et ses anticorps spécifiques à l'antigène. Ce niveau d'immunité se superpose au système immunitaire inné beaucoup plus fondamental et ancien de l'évolution, qui est présent non seulement chez les mammifères mais aussi chez d'autres animaux et chez les plantes.Ce n'est qu'au cours des dernières décennies que l'importance de l'immunité innée pour la survie des organismes multicellulaires a commencé à être appréciée. Il protège les humains, les autres animaux et les plantes des milliers de microbes potentiellement nocifs rencontrés quotidiennement. Le développement de l'immunité innée chez les organismes multicellulaires a nécessité l'évolution de récepteurs de surface cellulaire qui pourraient reconnaître/lier des molécules dont la structure/le schéma chimique est généralement conservé au sein de diverses classes d'organismes étrangers mais est absent dans les molécules « soi ». Ces molécules étrangères (non-soi) conservées sont appelées motifs moléculaires associés aux microbes (MAMP), également appelés motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP), et leur présence est détectée par les membres d'une grande famille de récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR). ). Les PRR activent une ou plusieurs voies de signalisation, souvent à l'aide de corécepteurs, pour induire des réponses de défense en aval. Des exemples de MAMP comprennent le lipopolysaccharide bactérien, la flagelline, l'EF-Tu, l'ADN, les lipoprotéines, les peptidoglycanes et la chitine fongique. Plusieurs excellentes revues de MAMP sont disponibles [1–4].

En plus des agressions biotiques, les organismes doivent faire face à une variété d'agressions abiotiques telles que des dommages mécaniques ou cellulaires, ainsi qu'à des stress environnementaux tels que la sécheresse et la salinité. Certaines molécules endogènes activent le système immunitaire inné lorsqu'elles sont libérées dans l'espace extracellulaire (y compris les apoplastes végétaux) à partir de leur emplacement normal en raison de dommages (traumatismes). Ces molécules sont appelées motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP [3, 5]) . Les DAMP sont libérés passivement des cellules mourantes en raison de dommages, d'un traumatisme, d'une ischémie ou d'une nécrose induite par une infection. De plus, ils peuvent être activement sécrétés par certaines cellules immunitaires ou des cellules fortement stressées (par exemple certaines cellules cancéreuses [3]). Alors que les MAMP sont dérivés de micro-organismes et activent le système immunitaire inné, les DAMP sont dérivés de cellules hôtes et à la fois initient et perpétuent des réponses immunitaires innées. Il est généralement admis que ces défenses aident à protéger les tissus endommagés, qui sont vulnérables aux infections en raison de la perturbation des barrières physiques qui empêcheraient autrement la pénétration microbienne. Chez les mammifères, l'inflammation est une autre composante de la réponse immunitaire innée, elle aide non seulement à prévenir/supprimer l'infection, mais aussi à favoriser la guérison.

Cette revue portera sur les DAMP, en particulier ceux des plantes. Les DAMP seront comparés aux MAMP et à une classe nouvellement identifiée d'activateurs de l'immunité innée appelée Nematode-Associated Molecular Patterns (NAMP [6]) puisque les trois classes induisent plusieurs des mêmes réponses de défense et partagent certains composants de transduction du signal.

DAMPs pour animaux

Nous commençons notre discussion avec les DAMP animaux puisqu'ils ont été reconnus pour la première fois et étudiés le plus largement. Le terme DAMPs a été inventé par Seong et Matzinger en 2004 [7]. Le tableau 1 répertorie 26 DAMP, y compris les purines, les pyrimidines, l'ADN (CpG non méthylé), les lipoprotéines de basse densité oxydées, les peptides N-formyl et diverses protéines. Des récepteurs apparentés pour la plupart ont été identifiés (tableau 1). De plus, certains DAMP forment des complexes avec des molécules/interacteurs partenaires pour améliorer ou faciliter la signalisation. Parmi ceux-ci se trouve le High Mobility Group Box 1 (HMGB1), qui est l'un des premiers DAMP identifiés et les mieux caractérisés. HMGB1 est une protéine associée à la chromatine très abondante qui est présente dans toutes les cellules animales [8]. Il se compose de deux domaines de base de liaison à l'ADN, désignés par les boîtes HMG A et B, et d'une queue C-terminale très acide qui participe à des interactions intramoléculaires spécifiques [9]. Dans le noyau, HMGB1 se lie au petit sillon de l'ADN pour faciliter la condensation de l'ADN, la formation de nucléosomes et la liaison au facteur de transcription [10]. Lorsqu'il est libéré dans le milieu extracellulaire à partir de cellules nécrotiques, endommagées ou fortement stressées, il fonctionne comme un DAMP avec des activités chimio-attractantes et inductrices de cytokines [11].

Le HMGB1 extracellulaire médie une gamme de réponses biologiques en association avec plusieurs récepteurs, tels que le récepteur pour les produits finaux de glycation avancée (RAGE), le récepteur Toll-like 2 (TLR2), le TLR4, le TLR9, le récepteur de chimiokine CXC de type 4 (CXCR4), Siglec -10, et T-Cell Immunoglobulin Mucin Receptor 3 (TIM3) [11, 12]. Notamment, la formation d'hétérocomplexes spécifiques entre HMGB1 et une variété d'interacteurs, tels que l'adaptateur MD-2 ou les lipopolysaccharides ligands pro-inflammatoires et les oligodésoxynucléutides CpG, améliore ou facilite la signalisation et, dans certains cas, est essentiel pour la reconnaissance de HMGB1 par des récepteurs distincts (tableau 1) . La formation d'hétérocomplexes spécifiques semble être au moins partiellement régulée par les différents états redox de HMGB1, qui dépendent en partie d'une liaison disulfure intramoléculaire réversible formée entre les résidus cystéine 23 et 45 [12, 13]. Des études récentes ont montré que la HMGB1 réduite forme un hétérocomplexe avec CXCL12, qui favorise le recrutement de cellules inflammatoires dans les tissus endommagés grâce à la reconnaissance par le récepteur CXCR4 [14]. HMGB1 contenant des liaisons disulfure se lie spécifiquement à MD-2, ce qui facilite la reconnaissance par TLR4, conduisant à l'induction de l'activation transcriptionnelle médiée par NF-κB des cytokines pro-inflammatoires [13, 15]. HMGB1 interagit également avec plusieurs autres récepteurs, dont RAGE et TLR2, il est actuellement difficile de savoir si des états redox spécifiques sont requis pour sa reconnaissance par ces récepteurs [11]. Les diverses activités, molécules partenaires et récepteurs de HMGB1 expliquent probablement ses multiples rôles dans de nombreuses maladies humaines répandues et dévastatrices.

Nous avons récemment découvert que HMGB1 se lie à l'acide salicylique (SA), ce qui supprime à la fois l'activité chimio-attractive réduite de HMGB1 et la capacité de HMGB1 contenant des liaisons disulfure à induire l'expression de gènes de cytokines pro-inflammatoires et de COX-2 [16]. Les sites de liaison SA sur HMGB1 ont été identifiés dans les domaines HMG-box par des études RMN et confirmés par analyse mutationnelle. Une protéine HMGB1 mutée dans l'un des sites de liaison SA a conservé une activité chimio-attractive, mais a perdu la liaison et l'inhibition par SA, établissant ainsi fermement que la liaison de SA à HMGB1 supprime directement ses activités pro-inflammatoires. Des dérivés naturels et synthétiques de SA avec une puissance beaucoup plus grande pour l'inhibition de HMGB1 ont également été identifiés, fournissant ainsi la preuve de concept que de nouvelles molécules à base de SA avec une efficacité élevée sont réalisables.

DAMP de plantes

Contrairement aux animaux, beaucoup moins de DAMP ont été identifiés dans les plantes à ce jour (tableau 2). La classe la plus importante et sans doute la mieux caractérisée est celle des polypeptides/peptides produits à partir de protéines précurseurs plus grandes. Il s'agit notamment de trois familles découvertes par Ryan et ses collègues au cours de leurs études pour identifier la systemine - un terme "utilisé pour décrire les signaux de défense polypeptidiques qui sont produits par la plante en réponse à des dommages physiques et qui induisent des gènes de défense, soit localement, soit de manière systémique" [17 ]. Un polypeptide de 18 acides aminés (aa) a été isolé à partir de 60 lb de plantule de tomate et il a été démontré qu'il induisait la synthèse de protéines inhibitrices de la protéinase inductibles par les plaies [18]. Cette systemine de tomate est générée par la transformation induite par la plaie d'une prosystemine prohormone 200 aa, qui est située dans le cytoplasme des cellules du parenchyme du phloème vasculaire. La systemine induit les cellules compagnes voisines et les éléments criblés du faisceau vasculaire à synthétiser de l'acide jasmonique (JA), qui à son tour active systémiquement l'expression des gènes inhibiteurs de la protéinase [19-21].

Alors que la systemine est présente dans de nombreuses autres espèces de solanacées, notamment la pomme de terre, le poivron et la morelle [22], elle n'est pas trouvée dans le tabac. Cette découverte a incité le groupe de Ryan à rechercher un autre type de systemine. En fin de compte, deux polypeptides 18 aa riches en hydroxyproline, qui sont traités à partir d'une préproprotéine 165 aa mais ne partagent aucune homologie de séquence avec la systémine de tomate, ont été identifiés [17].

Une troisième famille de DAMP à base de peptides a été découverte chez Arabidopsis [23]. Ces 23 peptides éliciteurs de plantes aa (Peps) sont dérivés d'un précurseur de 92 aa. Deux récepteurs ont été identifiés pour ÀPepl, PEPR1 et PEPR2 [24, 25]. ÀLes peps induisent une variété de réponses immunitaires innées et une résistance accrue, et il a récemment été démontré qu'une forme de précurseur ProPep3 était libérée dans l'espace extracellulaire lors de l'infection d'Arabidopsis avec des bactéries hémi-biotrophes. Pseudomonas syringae [26]. Un maïs (Zea mays) orthologue, ZmPep1, a ensuite été identifié et montré pour améliorer la résistance aux agents pathogènes microbiens, tout comme ÀPepl [27]. Pour une discussion plus approfondie des éliciteurs de peptides endogènes, voir Yamaguchi et Huffaker [28].

Une autre classe de DAMP trouvés dans les plantes, ainsi que chez les animaux, est dérivée de la matrice extracellulaire. Chez les vertébrés, des fragments d'hyaluronane, un polysaccharide linéaire simple constitué d'acide D-glucuronique répété et de D-N-acétylglucosamine, induisent une immunité innée lorsqu'ils sont libérés par des dommages mécaniques ou des enzymes hydrolytiques [29]. Ces fragments sont perçus par les récepteurs TLR2 et TLR4 contenant des répétitions riches en leucine [29, 30]. De même, les plantes contiennent le polysaccharide pectique homogalacturonane, un polymère linéaire d'acide α-D galacturonique 1, 4-lié, qui aide à maintenir l'intégrité de la paroi cellulaire. Des fragments de ce polymère, appelés oligogalacturonides (OG), peuvent être libérés mécaniquement ou plus couramment par des enzymes hydrolytiques codées par des agents pathogènes. Les OG induisent des réponses immunitaires innées, notamment l'activation de MAPK, le dépôt de callose, la production de ROS, une élévation du Ca 2+ cytosolique et l'activation des gènes de défense [31, 32]. La kinase 1 associée à la paroi (WAK1) a été identifiée comme un récepteur probable des OG [33, 34].

L'ATP extracellulaire (eATP) comprend encore une autre classe de DAMP végétaux trouvés à la fois dans les plantes et les animaux. Malgré des décennies de preuves croissantes que l'eATP agit comme une molécule de signalisation, cette fonction a été largement écartée/discréditée, probablement en raison de la nature omniprésente de l'ATP et de son rôle central en tant que monnaie énergétique universelle dans tous les organismes vivants, des bactéries aux humains [35, 36]. Ce n'est qu'avec l'identification de ses récepteurs localisés dans la membrane plasmique, d'abord chez les animaux (voir [35]) puis chez les plantes [37], que sa fonction de signalisation a été acceptée dans les deux règnes. Chez les animaux, l'eATP agit comme un neurotransmetteur et une molécule de signalisation qui participe à la contraction musculaire, à la mort cellulaire et à l'inflammation [35]. Deux types de récepteurs sont impliqués : un récepteur P2Y couplé à la protéine G et un récepteur P2X à canal ionique ligand-dépendant. Chez les plantes, le rôle de signalisation de l'eATP a été confirmé plus récemment avec l'identification de son récepteur, ne répond pas aux nucléotides 1 (DORN1 [37]). La désignation de l'eATP en tant que plante DAMP est basée sur les observations combinées que i) la dorn1 le mutant présente une réponse transcriptionnelle supprimée non seulement à l'ATP mais aussi à la blessure, ii) la plupart des gènes induits par l'application d'eATP sont également inductibles par la blessure [36], et iii) le traitement par eATP induit des réponses immunitaires innées typiques, y compris le Ca 2+ cytosolique afflux, activation de MAPK et induction de gènes associés denses, dont certains impliqués dans la biosynthèse de l'AJ et de l'éthylène [36, 38, 39]. Cependant, on ne sait pas encore s'il contribue à la résistance aux agents pathogènes.

Nous avons récemment identifié une quatrième classe de DAMPs végétaux, la protéine Arabidopsis HMGB ÀHMGB3 [40]. Toutes les cellules eucaryotes, y compris les plantes, possèdent des protéines apparentées à HMGB1. Chez Arabidopsis, 15 gènes codent pour des protéines contenant le domaine HMG-box. Elles ont été subdivisées en quatre groupes : (i) les protéines de type HMGB, (ii) les protéines A/T-rich interaction domain (ARID)-HMG, (iii) les protéines 3xHMG qui contiennent trois boîtes HMG, et (iv) la structure -spécifique de reconnaissance protéine 1 (SSRP1) [41]. Sur la base de leur emplacement nucléaire et de leur structure de domaine, les huit protéines de type HMGB (HMGB1/2/3/4/5/6/12/14) fonctionneraient comme des protéines chromosomiques architecturales, similaires à la HMGB1 des mammifères. Notamment, ÀLes HMGB2/3/4 sont présents dans le cytoplasme ainsi que dans le noyau [41-43]. La fonction cytoplasmique de ces protéines n'est pas connue. Cependant, les sous-populations cytoplasmiques devraient avoir un meilleur accès à l'espace extracellulaire (apoplaste) après des dommages cellulaires par rapport aux ÀLes HMGB situés exclusivement dans le noyau [41-43], car ils ne sont pas liés à l'ADN et n'ont besoin que de traverser la membrane plasmique pour entrer dans l'apoplaste. Étant donné le rôle bien établi du mammifère HMGB1 en tant que prototype DAMP, la présence d'une sous-population cytoplasmique de ÀHMGB3 a soulevé la possibilité que cette protéine remplisse une fonction similaire. En effet, lors de la recombinaison ÀHMGB3 était infiltré dans les feuilles d'Arabidopsis, il présentait des activités de type DAMP similaires à celles de ÀPep1. Traitement avec l'activation de MAPK induite par une protéine, le dépôt de callose, l'expression de gènes liés à la défense et une résistance accrue à la nécrotrophie Botrytis cinerea [40].

Contrairement à la HMGB1 des mammifères, qui peut être activement sécrétée après une modification post-traductionnelle, il n'y a aucune preuve de sécrétion de ÀHMGB3. Il pénètre probablement passivement dans l'espace extracellulaire lorsque les cellules sont endommagées mécaniquement, comme par des insectes, ou lors d'une infection par des agents pathogènes nécrotrophes. En effet B. cinerea l'infection a provoqué la libération de ÀHMGB3 dans l'apoplaste dans les 24 h suivant l'inoculation. Une telle libération rapide au cours de la phase précoce de la nécrose cellulaire induite par les nécrotrophes pourrait augmenter la résistance en activant les réponses immunitaires [40].

Des analyses supplémentaires ont révélé que ÀHMGB3, comme HMGB1, lie SA, et que cette interaction, qui est médiée par les résidus Arg et Lys conservés dans ÀLa seule boîte HMG de HMGB3 inhibe son activité DAMP [40]. Cette découverte semble être en conflit avec le rôle bien connu de l'AS en tant que régulateur positif des réponses immunitaires [44-47]. Cependant, alors que les réponses de défense induites par le SA sont essentielles pour la résistance aux agents pathogènes biotrophes et hémi-biotrophes, la principale hormone responsable de l'activation des défenses contre les agents pathogènes nécrotrophes et les insectes est la JA [44, 45]. Les voies de signalisation de défense JA et SA sont généralement antagonistes [48]. Inhibition médiée par le SA ÀL'activité DAMP de HMGB3 peut donc fournir un mécanisme par lequel ces voies se croisent. Dans ce scénario, les dommages cellulaires causés par l'infection par des agents pathogènes nécrotrophes conduiraient à la libération de ÀHMGB3 dans les espaces extracellulaires, cela activerait les défenses associées au JA/éthylène pour aider à neutraliser cette menace. En revanche, l'infection par des agents pathogènes biotrophes induit la biosynthèse de SA [44, 45]. Des niveaux accrus de SA pourraient alors s'opposer à l'activation des défenses associées à la JA en supprimant ÀL'activité DAMP de HMGB3, ainsi que favoriser l'activation des défenses associées au SA qui sont plus efficaces contre ce type d'agent pathogène [40].

La découverte que l'extracellulaire ÀLe HMGB3 est un DAMP végétal dont l'activité d'induction de la réponse immunitaire est inhibée par la liaison au SA fournit la preuve entre les royaumes que les protéines HMGB fonctionnent de manière extracellulaire en tant que DAMP chez les plantes et les animaux. De plus, il met en évidence l'existence de cibles communes et de mécanismes d'action partagés pour l'AS chez les plantes et les humains. Fait intéressant, la majorité des DAMP végétaux identifiés à ce jour ont des homologues chez les animaux. Nos études ont en outre indiqué que les plantes et les animaux partagent des cibles communes de SA au-delà des HMGB [46]. Par exemple, l'enzyme glycolytique glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) chez les plantes et les humains se lie à la SA et a par conséquent une activité altérée. SA supprime les rôles de GAPDH dans la réplication du virus du rabougrissement de la tomate chez les plantes et peut avoir des effets similaires sur la réplication du virus de l'hépatite C chez l'homme [49]. Il supprime également la mort cellulaire neuronale induite par la GAPDH chez les animaux [50]. Les analyses préliminaires des cribles à haut débit suggèrent l'existence de beaucoup plus de cibles SA chez les plantes et les humains. Peut-être que la présence de plusieurs cibles de SA chez les animaux a évolué en réponse soit à l'ingestion de faibles niveaux de SA qui sont naturellement présents dans le matériel végétal, soit à la synthèse endogène de SA à partir de benzoates [46]. Des études futures seront nécessaires pour évaluer si ces nouvelles protéines végétales et animales interagissant avec le SA fonctionnent comme des DAMP.

NAMP

Les nématodes, l'un des animaux les plus abondants dans la nature, parasitent à la fois les plantes et les animaux. Plusieurs études ont indiqué que les plantes pouvaient percevoir l'infection par les nématodes [51-53], mais l'identité du signal perçu dérivé des nématodes était inconnue. Nous avons récemment identifié un groupe de molécules de signalisation de défense issues de plusieurs genres de nématodes phytoparasites, dont les nématodes à galles et à kystes [6]. Il s'agit d'une famille de phéromones de nématodes conservées au cours de l'évolution appelées ascarosides. Ascr#18, l'ascaroside le plus abondant chez les nématodes phytoparasites, induit des réponses immunitaires innées caractéristiques, notamment l'activation de i) MAPK, ii) des gènes de défense et iii) des voies de signalisation de défense SA et JA, ainsi qu'une résistance accrue à pathogènes viraux, bactériens, fongiques et oomycètes et nématodes à galles chez plusieurs espèces de plantes dicotylédones et monocotylédones.


Vaccins viraux candidats récents produits dans les plantes

Vaccins contre le virus de l'hépatite B

Les vaccins contre le virus de l'hépatite B (VHB) sont l'une des grandes réussites vaccinales des temps modernes : depuis l'identification du virus dans les années 1960, il a fallu moins de 20 ans pour qu'un vaccin sous-unitaire soit mis sur le marché. Cependant, cela se présentait sous la forme de particules sous-virales de 22 nm purifiées à partir du sérum de porteurs humains du VHB, et bien que très efficace, était coûteuse à produire et d'un approvisionnement limité - pour ne rien dire du risque toujours présent associé à un produit sanguin. isolés de porteurs du VHB qui peuvent être porteurs d'un certain nombre d'autres virus non encore détectés. Ce fut donc un triomphe de la biologie moléculaire moderne lorsqu'un vaccin à particules de type virus (VLP) très similaire dérivé de l'expression de l'antigène de petite surface du VHB (S-HBsAg) a été développé en 1984 [12]. Alors qu'au départ, cela était encore cher - 40 $ US/dose, avec trois doses intramusculaires nécessaires - les prix ont baissé de manière très significative, au point que plus de 110 pays immunisent désormais systématiquement les nourrissons dans le cadre du Programme élargi de vaccination (PEV) [ 13]. Les vaccins recombinants sont très efficaces et sûrs et ont contribué à établir la norme pour les introductions ultérieures, comme les vaccins recombinants contre le virus du papillome humain (VPH) à base de VLP.

Cependant, il y a encore de la place pour des améliorations dans les vaccins contre le VHB, à la fois en termes de coût des marchandises et de teneur en antigène spécifique. Un désir croissant dans le monde pour une livraison de vaccin « sans aiguille », par exemple, nécessiterait une production moins chère de plus grandes quantités d'antigène pour la livraison orale, ce que les modalités de production actuelles ne seraient pas en mesure de satisfaire. Les problèmes de non-réponse de certains groupes de personnes aux vaccins actuels ont également nécessité le développement de produits de troisième génération, contenant les antigènes de surface moyens (M-HBsAg) et/ou larges (L-HBsAg), qui contiennent le préS1 fortement immunogène. et/ou les domaines preS2.Cependant, ces vaccins sont plus chers et moins facilement disponibles [11]. En conséquence, la production végétale de vaccins contre le VHB à base d'AgHBs se poursuit depuis plus de 20 ans, avec une variété de produits en cours de test préclinique de l'administration orale de produits transgéniques à base de pomme de terre pendant presque aussi longtemps [14], avec un essai préclinique d'un produit administré par voie orale en 2001 [15], et un essai clinique chez l'homme en 2005 [16].

Cependant, l'administration orale d'HBsAg dans du matériel végétal transgénique ne s'est pas avérée particulièrement efficace, l'immunogénicité étant généralement faible [7]. Cela a effectivement conduit à la réduction générale des efforts de vaccin transgénique-plante-comme [9]. Il est intéressant à cet égard que malgré le concept de « vaccination via la banane » qui ait été médiatisé dans la presse populaire depuis les années 1990 (par exemple : http://www.theguardian.com/science/2000/sep/08/gm.infectiousdiseases ), ce n'est qu'en 2005 que l'HBsAg a été exprimé pour la première fois dans des bananes transgéniques en Inde, bien qu'à un rendement relativement faible [17]. Une revue récente a proposé une combinaison d'approches, avec une vaccination parentérale avec de l'HBsAg purifié d'origine végétale suivie d'un rappel oral avec un antigène moins bien purifié sous forme de comprimés ou de gélules comprimés semblent ajouter du poids à la proposition [19].

Le rendement végétal le plus élevé en HBsAg conventionnel (=S ou petit) a été obtenu grâce à l'utilisation de vecteurs MagnICON d'ADNc déconstruits à base de virus de la mosaïque du tabac (Icon Genetics, Halle, Allemagne) : il était d'environ 300 mg/kg de poids humide dans Nicotiana benthamiana, et la protéine recombinante était de pleine longueur, formait des dimères à liaison disulfure, présentait le déterminant antigénique "a" déterminé par la conformation et s'assemblait correctement en VLP. Fait intéressant, l'agroinfiltration sous vide de plantes entières a conduit à un meilleur produit, tel que déterminé par la présence du déterminant «a» [20].

L'expression végétale d'antigènes du VHB autres que le S HBsAg standard a été tentée ces dernières années par un certain nombre de groupes. Le groupe de l'Arizona Biodesign Institute, qui a été le pionnier d'une grande partie de la bioagriculture de vaccins contre le VHB, a montré en 2004 que la forme S de l'HBsAg pouvait être utilisée via une expression transitoire médiée par l'agroinfiltration en tant que partenaire de fusion utile, avec des fusions N-terminales allant jusqu'à 239 acides aminés étant tolérés sans altération de sa capacité de formation de particules ou de propriétés antigéniques majeures [21]. Ils ont suivi cela avec la démonstration que la protéine intermédiaire HBsAg (protéine M) - avec la région pré-S2 hautement immunogène de 55 acides aminés fusionnée à l'extrémité N-terminale de la protéine S - pouvait être produite avec succès dans les plantes et induit des réponses immunitaires humorales plus fortes. que la protéine S lorsqu'elle est injectée chez la souris [22]. Le même groupe a utilisé des vecteurs MagnICON pour exprimer plus de 2 g/kg de poids humide de plantes d'HBcAg hautement immunogène et formant des VLP, l'antigène « core » [23] : l'HBc a un potentiel considérable à la fois comme vaccin thérapeutique et comme véhicule de présentation pour d'autres peptides, dont la région préS du VHB [11]. Un article ultérieur du groupe du Biodesign Institute a détaillé l'utilisation d'un système de vecteur basé sur le mastrevirus ssDNA Bean yellow dwarf (examiné ici [24]) pour produire 800 mg/kg de HBcAg dans N benthamiane[25].

On peut dire sans risque de se tromper que le potentiel de production de vaccins contre le VHB dans les plantes a été bien réalisé : alors que les vaccins entièrement comestibles/administrés par voie orale peuvent rester une chimère, des niveaux de production d'antigènes pour l'AgHBs et l'AgHBc ont été atteints qui sont quelques-uns des le plus élevé pour toutes les molécules produites par les plantes, et les produits se sont avérés antigéniquement appropriés et hautement immunogènes.

Vaccins contre l'hépatite C

Entre 130 et 150 millions de personnes dans le monde sont chroniquement infectées par le virus de l'hépatite C (VHC), et environ 350 000 personnes meurent chaque année d'une maladie du foie liée au VHC [26]. Alors qu'une proportion importante des personnes infectées élimineront naturellement leurs infections, la majorité développera des infections chroniques - avec un risque de cirrhose du foie de 15 à 30 % dans les 20 ans. Le seul traitement actuellement disponible est celui des antiviraux, le régime le plus courant étant la thérapie antivirale combinée avec l'interféron et la ribavirine, qui sont efficaces contre tous les génotypes viraux. De nouveaux médicaments deviennent disponibles, comme le très prometteur sofosbuvir [27], cependant, les vaccins seront le seul moyen efficace de prévenir l'infection.

La production végétale de vaccins candidats contre le VHC a une histoire assez longue, étant donné que le virus n'a été décrit qu'en 1989 [28],[29]. Il est intéressant de noter que les premiers produits ont tous été conçus comme des vaccins thérapeutiques : en 2000, Nemchinov et ses collègues ont décrit l'utilisation d'un vecteur dérivé du virus de la mosaïque du tabac (TMV) dans N benthamiane pour exprimer un peptide synthétique dérivé de la région hypervariable 1 (HVR1) appelé R9, un épitope neutralisant potentiel du VHC dérivé de la protéine d'enveloppe E2, fusionné à l'extrémité C-terminale de la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). Le HVR1/CTB d'origine végétale a réagi avec les sérums immuns d'individus infectés par quatre des principaux génotypes du VHC, et les souris immunisées par voie intranasale avec un extrait brut de plante ont produit des anticorps anti-HVR1 qui se lient spécifiquement aux VLP du VHC [30]. Cela a été suivi d'une succession de rapports sur l'expression végétale de molécules de protéine d'enveloppe de virus végétal chimérique contenant le même épitope (R9) : ceux-ci comprenaient l'utilisation du virus de la mosaïque du concombre (CMV) CP, avec une immunoréactivité de sérums de patients chroniquement infectés avec le virus recombinant CP [31] conduisant à l'utilisation de R9-CMV purifié pour provoquer des réponses in vivo chez le lapin, et des réponses cellulaires in vitro telles que mesurées par la production d'interféron gamma pour les lymphocytes de patients humains [32],[33]. Par la suite, le même groupe a montré que les particules de R9-CMV purifiées étaient stables dans des conditions gastriques et intestinales simulées et pouvaient déclencher une réponse immunitaire humorale chez des lapins nourris avec des plants de laitue infectés par R9-CMV [34].

L'épitope R9 a également été exprimé sous forme de produit de fusion avec le CP du virus de la mosaïque de la luzerne (AMV), via la transfection de plantes transgéniques pour les ARN 1 et 2 de l'AMV avec l'ARN3 recombinant codant pour CP : le R9/ALMV-CP a réagi avec le monoclonal spécifique de HVR1. anticorps et sérums immuns d'individus infectés par le VHC [35].

Dans une autre approche, l'utilisation d'un épitope dérivé de E2 en tant que fusion C-terminale produite par la plante au virus de la mosaïque de la papaye (PMV) CP a conduit à la formation de VLP en forme de tige flexibles qui ont été activement internalisées dans les cellules présentatrices d'antigènes dérivées de la moelle osseuse (APC ). Les souris C3H/HeJ injectées deux fois avec les VLP ont présenté une réponse humorale de plus de 120 jours contre l'épitope CP et E2, avec la production d'IgG1, IgG2a, IgG2b et IgG3 suggérant une réponse mixte Th1/Th2 [36].

Un autre développement récent intéressant a été le dépôt d'une demande de brevet USPTO sur la production végétale de la protéine E2 entière, car apparemment cela n'a pas été particulièrement réussi en raison d'un mauvais repliement. Le brevet couvre l'agro-infection d'un N. benthamiana cellule exprimant la protéine E2 recombinante avec l'une ou les deux des chaperons moléculaires calnexine et calréticuline, car cela conduit à une amélioration du rendement en protéine E2 recombinante [37]. Cela s'ajoute à ce qui semble être une expression réussie, bien qu'à faible niveau, de la protéine E1 du VHC dans les plantes [38].

Il semble que la production végétale de vaccins thérapeutiques candidats contre le VHC soit assez bien couverte, cependant, l'espace des vaccins prophylactiques est beaucoup moins bien étudié : espérons que cela changera avec l'optimisation de la production végétale de la protéine E2 complète comme détaillé ci-dessus.

Vaccins contre le virus de la grippe

La grippe saisonnière humaine est actuellement principalement causée par des virus de deux genres distincts de Virus de la grippe: il s'agit de trois virus Influenza A (H1N1, H1N1pdm09 et H3N2), et de deux lignées de virus Influenza B (Yamagata et Victoria). Les taux d'attaque annuels dans le monde sont estimés entre 5 et 10 % chez les adultes et 20 à 30 % chez les enfants, avec environ 3 à 5 millions de cas de maladie grave et environ 250 000 à 500 000 décès [39],[40]. La technologie conventionnelle de vaccin fractionné à virus entier inactivé à base d'œufs de poule a une capacité de production en 2011 de 1,42 milliard de doses de vaccin trivalent, et un niveau de production de 620 millions de doses - bien qu'avec une période d'introduction de six mois chaque année [ 41]. Celle-ci n'est manifestement pas à même de faire face aux pandémies, quand

« … l'approvisionnement potentiel en vaccins tomberait de plusieurs milliards de doses en deçà de la quantité nécessaire pour protéger la population mondiale » [42].

Il convient de noter que ce rapport a été publié trois ans seulement avant la pandémie de 2009 – et était prophétique dans ses prédictions de pénuries de vaccins et de l'intervalle trop long entre l'identification de l'agent pandémique et la disponibilité des vaccins. Le rapport a poursuivi en disant:

Un vaccin ne peut être développé avec certitude qu'après l'émergence du virus pandémique.

La capacité mondiale actuelle de fabrication de vaccins antigrippaux est limitée.

Deux doses peuvent être nécessaires pour un vaccin pandémique en raison de l'absence d'immunité préexistante. Cela pourrait retarder davantage la mise en place de la protection et ajouter des défis opérationnels à la livraison.

Une teneur élevée en antigène peut être nécessaire, cela limiterait le nombre total de doses pouvant être mises à disposition avec la technologie actuelle basée sur les œufs pour les vaccins inactivés. [c'est moi qui souligne]

La population cible de la vaccination pourrait être l'ensemble de la population mondiale de plus de six milliards, ce qui nécessiterait des ressources complètes pour répondre aux demandes opérationnelles et logistiques dans de nombreux pays.

En ce qui concerne le dernier point, il convient de noter qu'en 2001, alors que la capacité de production de vaccins antigrippaux dans l'hémisphère nord était évaluée à 1 069 millions de doses, avec une production réelle de 534 millions de doses, la capacité de l'hémisphère sud était de 352 millions de doses, avec une production de seulement 86 millions [41]. Ainsi, la fourniture de vaccins pandémiques pour le « Sud global » serait - et était en fait, en 2009 [43] - gravement insuffisante avec la technologie actuelle. Je suis redevable à l'un des arbitres de cette revue pour l'observation qu'« il est important que tous les œufs ne soient pas littéralement placés dans le même panier – ou que tous les vaccins soient mis dans des œufs ».

Heureusement, alors, les vaccins antigrippaux ont été la principale réussite des antigènes exprimés par les plantes, en grande partie en raison de deux facteurs majeurs : premièrement, la protéine hémagglutinine (HA) est le principal déterminant de la neutralisation, et le seul composant essentiel d'un vaccin deuxièmement. , il semble bien s'exprimer dans les plantes, et se replier correctement. Le facteur peut-être le plus important de l'expression végétale de HA, cependant, est le fait que l'expression de celle-ci seule est suffisante pour la formation efficace à un rendement élevé de VLP hautement immunogènes, qui bourgeonnent à partir de la membrane externe de la cellule végétale [44]. Ceci est particulièrement pertinent pour le développement de vaccins antigrippaux à la lumière du fait que les VLP contenant de l'HA produites dans des cellules d'insectes provoquent des réponses immunitaires de neutralisation croisée plus larges que le virus de la grippe inactivé par le virion entier ou l'HA recombinant [45]. Ces propriétés ont été exploitées par un certain nombre de groupes dans des travaux rapportés en détail ailleurs [46]-[48] en conséquence, cette revue sera limitée aux développements récents d'un intérêt particulier pour le développement de vaccins humains pandémiques et saisonniers.

La technologie à base de plantes se prête très bien aux vaccins « orphelins » ou « de niche », en raison de ce qui est en fait une évolutivité infinie de la production. Il est également très bien adapté à la fabrication de vaccins à « réponse rapide », tels que ceux dirigés contre la grippe pandémique et les agents bioterroristes : pour cette raison, la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) des États-Unis a lancé en 2005 une fabrication accélérée de produits pharmaceutiques (AMP). programme qui comprenait une enquête sur l'adéquation des usines en tant que plate-forme de fabrication à cet effet. En 2009, en réponse à la pandémie du virus H1N1 de la « grippe porcine », ils ont lancé l'effort « L'Ange bleu », qui était :

« ... un effort accéléré et intégré pour mettre en œuvre des interventions efficaces contre la grippe pandémique »

Une partie de cela impliquait l'utilisation de 100 millions de dollars américains pour financer un défi pour quatre entreprises afin de démontrer leur capacité à utiliser des plantes pour produire 100 millions de doses de vaccin antigrippal par mois. Il s'agit du Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology au Delaware, du Kentucky Bioprocessing à Owensboro, du consortium Project GreenVax avec des partenaires du système de l'Université Texas A&M et du G-Con du Texas, et de Medicago USA en Caroline du Nord [49]. En juillet 2012, Medicago Inc. avait produit, dans le cadre d'une étape de « feu rapide », plus de 10 millions de doses d'un vaccin candidat contre la grippe H1N1 VLP en un mois, selon les bonnes pratiques de fabrication actuelles appropriées à la phase 1 (cGMP ) [50].

Les derniers développements des concurrents dans ce défi comprennent des essais cliniques précliniques et humains d'un certain nombre de produits à base de HA. Le premier était celui du vaccin candidat-vaccin VLP H5N1 A/Indonesia/5/05 HA de Medicago, qui constituait « ... Dans les travaux précliniques rapportés dans cet article, deux faibles doses de VLP d'origine végétale avec adjuvant d'alun Alhydrogel® (1,8 g) chez les furets ont empêché la pathologie et réduit les charges virales après une provocation létale hétérotypique (A/Vietnam/1203/04 H5N1 clade 1 virus) . Il est intéressant de noter que cette protection s'est produite malgré le fait que les titres d'HAI contre le virus d'épreuve A/Vietnam/1203/04 n'étaient détectables que chez 75 à 87,5 % des furets exposés : cela a incité le commentaire selon lequel les corrélats de la protection contre l'infection par le virus bien compris, et que les VLP stimulent probablement des réponses immunitaires innées non observées pour les vaccins conventionnels.

L'essai humain des VLP H5 HA a été réalisé chez des adultes en bonne santé âgés de 18 à 60 ans qui ont reçu 2 doses à 21 jours d'intervalle de 5, 10 ou 20 mg de vaccin H5 VLP avec adjuvant d'alun ou d'un placebo (alun). L'immunogénicité a été évaluée à l'aide de tests d'inhibition de l'hémagglutination (HAI), d'hémolyse radiale simple (SRH) et de microneutralisation (MN) : les résultats des trois tests étaient fortement corrélés, avec des réponses dose-réponse claires avec toutes les mesures d'immunogénicité. Près de 96 % de ceux des groupes recevant 2 × 10 ou 2 × 20 g ont présenté des réponses MN détectables, indiquant une immunogénicité prometteuse. Selon eux, « ces données sont particulièrement encourageantes à la lumière du fait que les vaccins H5N1 fractionnés traditionnels à base d'œufs n'ont montré qu'une immunogénicité modeste chez l'homme à des doses aussi élevées que 45 mg avec ou sans alun comme adjuvant ».

Un aspect particulièrement encourageant de cette étude était leur test des réponses glycanes spécifiques aux plantes dans le groupe d'étude. L'un des prétendus dangers potentiels des vaccins à base de plantes est la possibilité qu'ils puissent exacerber des allergies préexistantes aux N-glycanes végétaux, voire provoquer de telles réponses de novo [51]. Dans une négation claire de ce potentiel pour ce vaccin, cette étude n'a trouvé aucune IgE aux glycanes spécifiques aux plantes chez aucun des 48 sujets, et aucune différence statistique significative dans l'augmentation des IgG aux glycanes des plantes entre les groupes placebo et vaccin. Le fait que cela puisse être important dans les vaccins antigrippaux fabriqués dans différents systèmes d'expression est démontré par la preuve que la glycosylation de l'A/California/04/09 HA recombinante fabriquée dans les cellules d'insectes et les plantes est différente, avec des glycanes de type mannose élevés dans les HA exprimés dans les plantes, et glycoformes de type complexe pour le HA exprimé par les insectes [52]. Une preuve supplémentaire que la glycosylation de H5 HA peut affecter l'immunogénicité comprend le fait que si les titres d'anticorps sont plus élevés avec le HA dérivé de cellules d'insectes Sf9, la neutralisation et les titres d'HAI sont beaucoup plus élevés avec le HA produit par des cellules de mammifères CHO [53] - bien que cela ne semble pas avoir été un problème avec les VLP H5 HA produites par les plantes.

Une illustration de la vitesse et de l'évolutivité de l'expression transitoire dans N benthamiane pour la réponse d'urgence aux nouvelles épidémies de virus de la grippe a été montré récemment par Medicago Inc., qui a produit des grammes de vaccin H7N9 à base de plantes de qualité cGMP, en tant que VLP HA uniquement, en réponse à l'épidémie chez l'homme de ce virus de la grippe très grave en Chine en 2013. Les premiers lots de vaccins n'étaient disponibles que 19 jours après que la société eut accédé à la séquence d'ADNc du gène H7 HA, et aussi peu que 3 g dans une dose du vaccin H7 VLP administré avec ou sans adjuvant GLA (glucopyranosyl lipide A) titres d'anticorps chez la souris [54].

En 2012, les comptes rendus des essais de phase 1 des produits dérivés de l'HA H1N1pdm (A/California/04/09) et HPAI H5N1 (A/Indonesia/05/05) ont été publiés par des chercheurs de ce qui est maintenant le Centre Fraunhofer. for Molecular Biotechnology dans le Delaware, États-Unis (http://www.fraunhofer.org/MolecularBiotechnology), après avoir prouvé qu'ils pouvaient utiliser un système d'expression transitoire basé sur le TMV pour produire les deux protéines [48]. Les séquences HA recombinantes comprenaient toutes deux des séquences de rétention KDEL ER et de purification d'affinité 6xHis à leurs extrémités C-terminales et ont été purifiées à l'aide de tampons contenant des détergents, de Ni-Sepharose et de colonnes de chromatographie d'interaction hydrophobe et d'échange d'anions, à des échelles allant jusqu'à 50 kg de N benthamiane biomasse sous cGMP. Des études d'immunogénicité chez la souris ont démontré que l'injection intramusculaire (IM) de 1 g de H1 HA ou de 5 g de protéine H5 HA adsorbée sur 0,3 % d'Alhydrogel comme adjuvant a provoqué des réponses en anticorps sériques HAI avec des titres ≥ 1:40 chez au moins 67 % des souris vaccinées, avec une amélioration significative de l'immunogénicité et une économie de dose conséquente offerte par l'utilisation de l'adjuvant. Chez le lapin, deux doses IM de 45 µg de H1 HA plus Alhydrogel ont induit des titres d'HAI 1:40 chez 100 % des animaux, tandis que deux doses de 90 µg de H5 HA ont été nécessaires pour les mêmes titres chez 80 % des lapins. Les résultats chez les furets étaient similaires, avec des réponses plus faibles au H5 HA. Les conclusions de cette étude étaient que les deux antigènes étaient sûrs et immunogènes, et adaptés aux essais humains.

Contrairement aux résultats précliniques, cependant, les tests du vaccin H5 HA chez des volontaires humains n'ont montré aucune amélioration de l'immunogénicité par Alhydrogel : des doses de 15 et 45 g avec l'adjuvant Alhydrogel, et à une dose de 90 μg avec et sans Alhydrogel, ont été administrées en deux -dose à trois semaines d'intervalle, les réponses les plus élevées ont été observées dans le groupe 90 g sans adjuvant [55].

L'antigène vaccinal H1 HA a été testé avec des sérums issus de volontaires humains vaccinés avec un vaccin pdmH1N1 classique avec adjuvant AS03 afin d'évaluer son potentiel vaccinal [56]. Il a été fortement reconnu par les anticorps sériques et les cellules sécrétant des anticorps provenant des vaccins. De plus, il y avait une bonne corrélation entre les résultats obtenus en utilisant l'antigène d'origine végétale et l'antigène vaccinal conventionnel à la fois par ELISPOT et par des tests de coloration intracellulaire des cytokines. La conclusion était que le candidat H1 HA avait un bon potentiel vaccinal, mais avait besoin d'un bon adjuvant pour une utilisation dans un essai clinique.Cela a été fait récemment [57], dans une première étude de phase 1 chez l'homme avec H1 HA administré deux fois à des doses de 15, 45 et 90 g avec et sans Alhydrogel, chez des adultes en bonne santé âgés de 18 à 50 ans. Les taux de séroconversion les plus élevés, mesurés par les tests HAI (78 %) et le virus MN (100 %), ont été observés dans le groupe vacciné à 90 g sans adjuvant après la deuxième dose de vaccin.

Ainsi, les résultats de ces deux candidats vaccins monomériques HA fabriqués à partir de plantes sont similaires, des doses élevées étant nécessaires pour obtenir des réponses appropriées, et - contrairement à l'essai Medicago - aucun effet évident de l'utilisation de l'adjuvant Alhydrogel. On peut également se demander si les antigènes vaccinaux contenant des balises 6xHis seraient autorisés dans un produit final.

Un autre produit de ce groupe, cependant, est plus prometteur : il s'agit d'un HA trimère soluble modifié (H1N1pdm) avec un motif de trimérisation hétérologue, qui a induit des anticorps sériques actifs dans les tests HAI ainsi qu'une immunité protectrice chez les souris soumises à une provocation virale létale. Comme on pouvait s'y attendre, les doses efficaces de l'HA trimérique étaient bien inférieures à celles requises précédemment pour l'HA monomérique décrit ci-dessus [58]. Une exploration plus poussée de l'amélioration de l'immunogénicité de l'AH monomère H1N1pdm était également prometteuse : cela impliquait de doubler l'adjuvant de l'antigène avec des nanoparticules de silice (SiO2) et le candidat adjuvant muqueux bis-(3′,5′)-cyclique dimère guanosine monophosphate (c-di-GMP) [59]. Les souris ont été vaccinées par voie intratrachéale, ce qui a entraîné des réponses immunitaires humorales systémiques et l'induction d'une forte réponse immunitaire de la muqueuse avec des cellules T amorcées par l'antigène dans les poumons.

Alors que la bioagriculture est souvent présentée comme étant idéale pour la production de vaccins et d'autres produits pharmaceutiques pour le monde en développement, il y a très peu de publications réellement publiées par les pays en développement sur l'utilisation de la technologie à leurs propres fins. Un exemple d'objet provient de mon propre laboratoire en Afrique du Sud, où nous avons exploré les perspectives de fabrication de vaccins contre la grippe pandémique d'intervention d'urgence [43]. Nous avons réussi à fabriquer des vaccins sous-unitaires candidats à haut rendement via une expression transitoire médiée par l'agroinfiltration dans N benthamiane à partir d'une version complète (jusqu'à 130 mg/kg FW) et d'une version soluble (jusqu'à 675 mg/kg FW) de l'HA H5N1 A/Viet Nam/1194/2004, via une optimisation de l'utilisation des codons humains du HA, et a montré que bien que les deux protéines induisent des titres utilisables d'anticorps chez les souris et les poulets par des tests HAI, la protéine de longueur totale était significativement meilleure. Des travaux ultérieurs ont montré que le H5 HA complet pouvait être extrait sous forme de VLP semi-pures de l'espace apoplastique de non macérés. N benthamiane feuilles par infiltration de tampon et centrifugation douce de feuilles coupées enroulées en lanières (H Inderthal, II Hitzeroth et EP Rybicki, non publié) (Figure 1).

Micrographie électronique à transmission de particules pseudo-virales composées d'hémagglutinine (HA) d'Influenzavirus A H5N1 et de lipides végétaux, produites par l'expression transitoire de l'HA H5 via l'agroinfiltration de Nicotiana benthamiana feuilles avec recombinant Agrobacterium tumefaciens . La HA pleine longueur a été produite en utilisant le vecteur pTra-ERH modifié pour la sécrétion apoplastique, comme décrit par Mortimer et al. [43]. Les particules ont été éluées par centrifugation douce à partir de feuilles qui avaient été infiltrées sous vide avec une solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4, puis coupées en bandes et enroulées pour insertion dans des tubes à centrifuger.

Un certain nombre d'autres candidats vaccins antigrippaux d'origine végétale en sont à des stades de développement précoces, mais sont prometteurs : ils comprennent la protéine HA attachée à un certain nombre de molécules partenaires différentes, ainsi que des candidats « vaccins universels » basés sur le M2e hautement conservé ou Domaine ectopique de la protéine du canal ionique M2.

La conjugaison chimique de monomères végétaux H1N1 A/Californie/07/09 HA à la surface des virions du virus de la mosaïque du tabac (TMV) a produit un vaccin qui a provoqué une puissante réponse en anticorps telle que mesurée par HAI, et a permis d'économiser la dose chez la souris, avec une dose unique de 15 g IM étant suffisante pour protéger toutes les souris testées, si elle est administrée avec de l'alun (Alhydrogel) ou un adjuvant à base d'huile de squalène dans l'eau (Addavax) [60]. Le porteur du TMV est également unique en ce qu'il exploite l'absorption des cellules dendritiques (DC) et l'activation ultérieure pour stimuler une présentation efficace de l'antigène, ce qui influence la qualité de la réponse immunitaire protectrice ultérieure. L'utilisation du TMV comme vecteur d'antigène permet un rappel répété sans perte d'activation immunitaire vers l'antigène partenaire, même lorsque des anticorps anti-TMV étaient déjà présents : en effet, une exposition préalable au TMV a potentialisé la réponse à l'HA. Ce groupe a pu produire 500 g de protéine HA monomère à l'échelle pilote en moins d'un mois – une bonne publicité pour le potentiel de cette technologie pour une capacité vaccinale d'intervention d'urgence.

Une autre approche intéressante consistait à faire une fusion de polypeptide de type élastine avec un H5N1 HA soluble et stabilisé formant un trimère (ELPylated H5 HA ou H5-ELP): la production a été améliorée par ELPylation, et les molécules ont pu être facilement purifiées par la transition inverse caractéristique technique de cycle, et a suscité des anticorps neutralisants chez la souris qui se sont liés aux VLP H5 HA produites par les plantes et au virus inactivé produit par les œufs [61].

La production d'autres antigènes du virus de la grippe a été limitée, la seule autre protéine étudiée dans une certaine mesure étant le peptide M2e, ou domaine ectopique de la protéine du canal ionique M2 : cela a un potentiel considérable en tant que candidat vaccin universel, car il est hautement conservé entre tous les virus de la grippe A. L'insertion d'un M2e2–24 peptide à deux emplacements différents dans la protéine L1 formant des VLP du papillomavirus humain de type 16 a été rapporté [62], tout comme l'utilisation de la présentation en surface sur un potexvirus filamenteux formant des VLP CP [63], bien que sans évaluation préclinique. Cependant, une enquête plus récente qui utilisait la présentation en surface sur des virions TMV était plus remarquable en ce que les peptides synthétiques M2e dérivés d'un virus H1N1 insérés entre les résidus CP TMV U1 155 et 156 étaient bien présentés sur les virions. Les vaccins candidats ont provoqué des titres d'anticorps élevés chez les souris immunisées par IM et étaient 100 % protecteurs contre 5 DL50 de virus de provocation homologue (A/PR/8/34) et 70 % de provocation hétérologue (A/Californie/04/2009) [ 64].

Alors que les virus grippaux d'origine végétale en général, et les vaccins à base d'HA en particulier semblent être des produits à fort potentiel, il reste encore des pistes à explorer, telles que l'expression et le test de la neuraminidase (NA), de la protéine matricielle (M1) et nucléoprotéines (NP), qui peuvent toutes jouer un rôle dans l'immunité et la guérison des infections virales grippales, et qui pourraient constituer des ajouts précieux à l'arsenal de vaccins antigrippaux fabriqués à partir de plantes.

Vaccins contre le papillomavirus

Les vaccins contre le virus du papillome humain (VPH) basés sur des VLP fabriqués par expression recombinante et assemblage de la principale protéine de capside L1 sont les derniers vaccins viraux à succès, avec des ventes annuelles de Gardasil à base de levure de Merck et de vaccins à base de VLP Cervarix fabriqués à partir de cellules d'insectes de GSK fermer à ou plus de 1 milliard de dollars US en 2012 [65]. Gardasil cible les deux HPV les plus répandus dans 70 % des cas de cancer du col de l'utérus – HPV-16 et HPV-18 – ainsi que les deux virus causant les verrues génitales les plus courants, les HPV -6 et -11, tandis que Cervarix ne contient que des HPV − 16 et -18. Alors que l'impact mondial de la maladie cible se fait sentir dans le monde en développement – ​​en 2001, les femmes des pays en développement représentaient

85 % des deux cas annuels de cancer du col de l'utérus (

500 000 cas dans le monde) et les décès annuels dus au cancer du col (

300 000 dans le monde) [66] – le principal marché des vaccins se trouve dans le monde développé, en grande partie en raison de leur coût. Bien que cela change dans une certaine mesure, avec un certain nombre de gouvernements négociant des appels d'offres favorables pour la fourniture de vaccins contre le VPH pour les programmes du PEV, cela reste un problème - et la sortie imminente de produits de nouvelle génération avec une couverture plus large - des mélanges de plusieurs types de VPH L1 , ou les vaccins chimériques L1 incluant tout ou partie de la protéine mineure de la capside L2, ou les vaccins à base de L2 - ne feront rien pour résoudre ce problème [67],[68].

Un autre problème, encore non résolu par les vaccins disponibles, est la vaccination thérapeutique pour les personnes déjà infectées par des VPH à haut risque ou qui ont des verrues génitales sévères : ni Gardasil ni Cervarix n'ont d'effet sur les infections établies, et la nouvelle couverture plus large VLP- vaccins à base de vaccins s'ils provoquent les réponses en anticorps très humorales observées jusqu'à présent [68]. Les vaccins expérimentaux basés sur les oncogènes HPV à haut risque E6 et E7 se sont toutefois montrés prometteurs dans les modèles animaux, étant donné que la majeure partie du fardeau des maladies du col de l'utérus ainsi que du cancer se trouve dans les pays en développement [69], le problème du coût et du petit marché la taille sera à nouveau un problème si des vaccins homologués sont mis au point.

La production à base de plantes de vaccins contre le virus du papillome humain a une histoire assez longue, qui a été bien examinée jusqu'en 2010 pour tous les vaccins anti-HPV [10], et 2013 spécifiquement pour les VLP [9]. En bref, les premiers jalons importants dans l'agriculture de vaccins prophylactiques contre le papillomavirus sont la preuve que le HPV-16 ou le HPV-11 L1 transgéniquement exprimé peut s'assembler en VLPS immunogène, bien qu'à faible rendement [70]-[73] preuves de l'efficacité d'une plante -Fabriqué un vaccin basé sur le virus du papillome du lapin (CRPV) L1 [74] et des peptides du papillomavirus oral du lapin ou du CRPV L2 affichés en surface sur des vaccins rTMV [75] des rendements très élevés de HPV-16 L1 et de VLP via une expression transitoire induite par l'agroinfiltration [76 ] ou par expression transplastomique (chloroplaste) [77]. Une approche intéressante a été montrée dans une étude qui a utilisé des plantes transplastomiques pour exprimer un HPV-16 L1 muté de manière à ne former que des capsomères pentamères plutôt que des particules, fusionnées au Escherichia coli La sous-unité B de l'entérotoxine thermolabile (LTB) comme adjuvant intégré [78]. La protéine résultante s'est accumulée à 2% de la protéine soluble totale (TSP) et avait tous les épitopes et l'activité biochimique corrects des deux molécules mères, indiquant qu'elle pourrait être un candidat vaccin viable.

L'une des rares études à examiner les HPV L1 non génitaux était une étude de l'expression végétale de la L1 du HPV-8, un papillomavirus cutané à haut risque associé à l'épidermodysplasie verruciforme et au cancer de la peau sans mélanome chez les personnes immunodéprimées [79]. La protéine exprimée a formé des VLP in planta, bien qu'à un rendement relativement faible - et seulement si le signal de localisation nucléaire C-terminal 22aa a été supprimé. Ceci est similaire à ce qui a été trouvé pour HPV-11 L1 [73], et contrairement aux résultats pour HPV-16, où l'élimination a réduit le rendement [76]. Dans seulement la troisième étude de l'expression de la L1 d'un papillomavirus non humain, des niveaux raisonnablement élevés de protéines (183 mg/ml de biomasse) ont été atteints pour l'expression transitoire médiée par l'agroinfiltration de Bovine papillomavirus type 1 L1 [80]. La protéine a formé des VLP, bien que seulement T = 1 particules de 30 nm plutôt que la structure native de 50 nm T = 7, qui étaient néanmoins hautement immunogènes chez le lapin.

La seule expression documentée de la protéine capside mineure du papillomavirus L2 provenait de notre laboratoire (rapportée dans [81]) : il s'agissait du HPV-16 L2, optimisé pour le codon humain et exprimé à des niveaux de

30 mg/kg - ce que nous avons noté à l'époque pourrait être utile, car la protéine est présente dans les virions à un rapport maximum de 1 molécule L2 par capsomère L1, et compte tenu des rendements L1 qui sont

10 à 20 fois plus élevée, la co-expression des protéines pourrait entraîner une formation efficace de VLP L1 + L2.

Des vaccins thérapeutiques candidats basés sur l'oncoprotéine E7 du VPH-16 ont également été étudiés en détail : la première expression de la protéine dans les plantes - expression transitoire dans N benthamiane via un vecteur recombinant dérivé du virus X de la pomme de terre - était accompagnée d'une preuve d'efficacité dans un modèle murin, avec une protection contre le développement tumoral causé par la lignée cellulaire C3 exprimant le HPV-16 E7 accompagnée de fortes réponses cytotoxiques des cellules T [82] . Le même groupe a ensuite montré une expression améliorée de 5 fois de E7 en ciblant la protéine sur la voie de sécrétion [83]. Les propriétés potentiellement immunitaires de N benthamiane les extraits indiqués dans des travaux antérieurs ont été explorés plus avant, avec la preuve d'une activité immunomodulatrice sur les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains (MDDC) [84]. Peut-être en réponse aux préoccupations concernant l'utilisation d'une oncoprotéine non modifiée comme vaccin, ils ont conçu des mutations qui ont aboli l'interaction avec les protéines gouvernant le cycle cellulaire (E7GGG) et ont montré qu'un produit de fusion produit par une plante avec le bêta-1,3-1, 4-glucanase (LicKM) de Clostridium thermocellum a suscité la même réponse protectrice [85],[86]. L'intensification expérimentale de la production de cette protéine de fusion en tant que vaccin thérapeutique a été réalisée avec un rendement final de 50 % (à 100 mg/kg de biomasse) de protéine à une pureté de 99 %, au moyen de la chromatographie d'affinité aux ions métalliques et de la filtration sur gel [87] .

Une fusion intéressante de vaccins anti-HPV prophylactiques et potentiellement thérapeutiques a été une étude de la faisabilité de la production de VLP HPV-16 chimériques avec L1 fusionné à une chaîne d'épitopes de lymphocytes T cytotoxiques à partir de protéines HPV 16 E6 et E7, dans des plants de tomates transgéniques (Lycopersicon esculentum) [88]. Alors que les niveaux d'expression étaient faibles, les VLP se sont formées in planta et ont provoqué à la fois des réponses d'anticorps neutralisants anti-L1 et des CTL anti-E6/E7. Un développement de ce travail a été l'utilisation des VLP chimériques fabriquées dans des plants de tomates pour la détection d'anticorps spécifiques au HPV-16 chez des patients présentant des lésions intraépithéliales cervicales de grade 1 (CIN 1) [89], soulignant l'utilisation potentielle de produits à base de plantes. comme réactifs bon marché.

Les nouveaux développements dans le domaine des vaccins principalement prophylactiques ou à base de VLP se limitent à quelques études, impliquant en grande partie des molécules chimériques L1 ou des fusions de L1 avec d'autres partenaires. Cependant, une variante intéressante récente de l'approche VLP classique du VPH L1 était celle dans laquelle le VPH-16 L1 était co-exprimé avec E. coli LTB dans le tabac doublement transgénique (N tabac) plantes à rendement raisonnable (

0,3 % de TSP) et des extraits ont été utilisés pour immuniser des souris par voie orale (4x sur 52 jours) [90]. L'association avec la LTB a considérablement augmenté les réponses IgA de la muqueuse intestinale à L1 ainsi que la prolifération des cellules spléniques spécifiques à L1 et l'expression de l'IFN-γ et de l'IL-4 dans les cellules T CD4+ et les surnageants de cellules spléniques.

Une étude de molécules chimériques HPV-16 L1 de notre groupe [91] a étudié des épitopes d'anticorps neutralisants dérivés de HPV-16 L2 comprenant des résidus d'acides aminés 108-120, 56-81 ou 17-36 substitués dans l'hélice C-terminale 4 (h4 ) de la région L1, à partir de l'acide aminé 414, suite à la preuve qu'ils étaient les plus efficaces en termes d'obtention d'un spectre plus large d'anticorps neutralisants contre les HPV à haut risque [92]-[95]. Suite à une expérience précédente avec L1, nous avons utilisé un gène L1 optimisé pour l'utilisation des codons humains avec des inserts optimisés de manière similaire, exprimés de manière transitoire dans N benthamiane via l'agroinfiltration, et ciblée pour l'importation dans les chloroplastes. Toutes les chimères étaient très fortement exprimées, avec des rendements allant jusqu'à 1,2 g/kg de tissu végétal. La chimère L1 contenant les acides aminés L2 108-120 (L1:L2108–120) était le candidat le plus retenu en ce sens qu'il s'est assemblé en petits VLP (

30 nm) et a suscité des réponses anti-L1 et anti-L2 chez des souris immunisées par IM, et des sérums immuns ont neutralisé les pseudovirions homologues HPV-16 et hétérologues HPV-52. Les autres L1 chimériques n'ont pas formé de particules distinctes et ont provoqué des réponses immunitaires humorales significativement plus faibles pour la même dose de protéine. Le L1:L2108–120 la formation de particules était en contraste avec l'expression précédente répétée de ceci et des autres chimères dans les cellules d'insectes, où seuls des agrégats lâches de capsomères ont été formés pour L1:L2108–120[95],[96].

Une autre enquête sur le potentiel de la L2108–120 épitope a été réalisé en utilisant une fusion du peptide à l'extrémité N-terminale de la protéine d'enveloppe du virus de la pomme de terre (PVX CP) pour l'affichage en surface, exprimé via un vecteur PVX recombinant dans N benthamiane: des niveaux d'expression allant jusqu'à 170 mg/kg de biomasse ont été obtenus, et la protéine chimérique a provoqué l'anti-L2108–120–anticorps réactifs après injection SC ou administration de tatouage [97].

Les vaccins à base d'E7 ont continué à être étudiés, avec un certain nombre d'approches donnant des résultats prometteurs. Une approche croisée utile mélangeant des vaccins potentiellement prophylactiques et thérapeutiques était celle du même groupe qui a développé la chimère HPV-16 L1 avec une chaîne d'épitopes de cellules T de HPV 16 E6 et E7 fusionnés à son extrémité C [98]. Ces travailleurs ont immunisé des souris C57BL/6 avec l'antigène et ont pu démontrer des anticorps IgG anti-L1 persistants pendant plus de 12 mois, avec une bonne activité neutralisante. Il y avait également une protection efficace à long terme contre la croissance tumorale induite par les provocations de cellules tumorales TC-1 exprimant HPV-16 E6/E7, et une réduction tumorale significative (57 %) chez les animaux présentant des tumeurs établies ayant reçu une vaccination thérapeutique.

Dans une autre utilisation des fusions PVX CP, cette fois avec la protéine E7GGG mentionnée précédemment [99], il a été montré que tandis que les fusions N- et C-terminales avec PVX CP formaient de longues VLP filamenteuses lorsqu'elles étaient exprimées en E. coli, et l'expression dans N benthamiane était à des niveaux élevés, ces derniers n'ont apparemment pas formé de VLP. Une autre modalité de production pour E7GGG a été étudiée sous la forme de transplastomique Chlamydomonas reinhardtii, une algue unicellulaire bien caractérisée [100]. E7GGG a été exprimé seul ou sous forme de protéine de fusion His6 ou FLAG, à des niveaux de 0,12 % de TSP. Une purification par affinité a été effectuée pour les deux formes marquées, et des souris C57BL/6 ont été vaccinées SC avec C reinhardtii extrait ou protéine purifiée mélangée à l'adjuvant QuilA. Des IgG anti-E7 spécifiques et une prolifération de cellules T spécifiques de E7 ont été montrées chez des souris vaccinées avec l'un ou l'autre inoculum, et une protection tumorale a été montrée après provocation avec la lignée cellulaire tumorale TC-1 exprimant E7. Les auteurs notent qu'il s'agissait de la première expression réussie d'un dérivé E7 soluble dans les plantes, car auparavant la protéine devait être exprimée sous forme de produit de fusion afin d'obtenir un rendement utilisable.

Un autre article récent qui a exploré l'expression de E7 dans le tabac transplastomique a déterminé que le ciblage de la protéine au moyen d'un peptide de transit vers la lumière thylakoïde - un compartiment interne du chloroplaste avec un potentiel redox différent du stroma, entre autres caractéristiques - a augmenté la production de plus de 80 -pli [101]. Cependant, ces auteurs n'ont pas inactivé le potentiel oncogène de la protéine, ce qui signifie qu'elle n'a actuellement de valeur qu'à titre d'illustration d'une technique utile d'amélioration du rendement.

Notre groupe a récemment exploré le potentiel d'une nouvelle construction génétique dérivée du HPV-16 E7 - un HPV-16 E7 mélangé synthétique (16E7SH) qui a perdu ses propriétés de transformation, mais conserve tous les épitopes CTL naturels - pour l'expression dans les plantes comme un candidat vaccin thérapeutique [102]. Le gène E7SH a déjà été utilisé avec succès comme vaccin à ADN dans un modèle de tumeur murine, provoquant de puissantes réponses immunitaires cellulaires et humorales, y compris la protection et la régression tumorale [103].Nous avons fusionné le gène par traduction à un codant pour le peptide Zera®, un domaine d'auto-assemblage de la protéine de stockage des graines de gamma-zéine de maïs qui induit l'accumulation de protéines recombinantes dans des corps protéiques (PB) au sein du réticulum endoplasmique dans une variété d'expression eucaryote systèmes [104]. Cela permet généralement la stabilisation des protéines recombinantes, ainsi qu'une accumulation améliorée et une purification beaucoup plus facile. Alors que l'E7SH seul n'a été exprimé qu'à un faible niveau par l'expression transitoire médiée par l'agroinfiltration dans N benthamiane, une expression de haut niveau de E7SH-Zera a été obtenue, avec un maximum de 1,1 g/kg de biomasse, et les corps protéiques résultants ont pu être facilement purifiés. Des réponses immunitaires comparables au vaccin à ADN E7SH ont été démontrées chez la souris, avec des réponses immunitaires humorales et à médiation cellulaire spécifiques, et une régression tumorale significative chez les souris vaccinées avec des tumeurs préexistantes. Fait intéressant, le simple mélange de PB uniquement Zera et de 16E7SH a également amélioré les réponses immunitaires, indiquant une activité adjuvante indépendante pour le composant Zera®. De plus, l'utilisation du gène E7SH-Zera comme vaccin à ADN a également entraîné une augmentation des taux d'IFN-γ dans les splénocytes de souris par rapport aux souris inoculées avec le gène 16E7SH, une tendance qui a également été observée pour les tests Granzyme B ELISPOT ainsi que pour le chrome. tests de libération. Nous pensons avoir démontré l'efficacité dans un modèle de tumeur murine d'un nouveau candidat vaccin thérapeutique contre le VPH, qui devrait être facile et peu coûteux à produire et à purifier. Pour poursuivre le développement de ce vaccin, une amorce de vaccin à ADN suivie d'un rappel de protéines correspondantes pourrait être idéale afin d'améliorer encore l'immunogénicité.

Les perspectives globales de production végétale de vaccins prophylactiques et thérapeutiques contre les infections et les maladies à HPV semblent prometteuses : des candidats vaccins de référence à base de VLP peuvent être fabriqués à haut rendement via une expression transitoire, tout comme l'efficacité des candidats vaccins thérapeutiques viables a été démontrée chez l'animal. modèles pour les deux types de vaccins Les premières recherches en pipeline semblent montrer la faisabilité de fabriquer des vaccins à double usage qui peuvent à la fois prévenir l'infection et accélérer la guérison de l'infection.

Vaccins contre le VIH

Il n'est guère nécessaire de réitérer le besoin de vaccins contre les virus de l'immunodéficience humaine (VIH) en général, ou du VIH-1 prédominant en particulier, il est également peu nécessaire, face à une pléthore de littérature, de détailler les approches pour , ou des problèmes inhérents au développement desdits vaccins [105],[106]. Comme on pouvait s'y attendre, les vaccins contre le VIH ont été une cible précoce pour les études d'expression végétale, avec une variété de cibles : en effet, la protéine de capside p24 du VIH-1 a été exprimée avec succès dans le tabac transgénique, bien qu'à faible rendement (0,35 % de TSP), tant il y a 2002 [107] l'adéquation du maïs transgénique en tant que plate-forme de production pour l'administration orale de vaccins contre le VIH dans des extraits de graines a été testée en utilisant la glycoprotéine de surface majeure gp130 [108] une nouvelle molécule dérivée de gp41 incorporant une fusion CTB en tant qu'agent de polymérisation et adjuvant a été produit via une expression médiée par l'agroinfiltration dans N benthamiane[109] et il a été démontré qu'il produisait des anticorps anti-région proximale de la membrane (MPR) muqueux et sériques chez la souris après une immunisation de rappel systémique de la muqueuse primaire [110] un monomère Tat a été produit dans les épinards via le rTMV comme vaccin oral potentiel [111] des épitopes dérivés du VIH-1 Gag et Env ont été fusionnés à HBsAg et exprimés sous forme de VLP dans des tomates transgéniques [112] divers antigènes dérivés de Gag (p24, p41, p55) ont été produits dans du tabac transgénique et via rTMV dans N benthamiane pour l'étude de leur utilité en tant qu'immunogènes inducteurs de CTL par notre groupe [113] HIV-1 Nef a été produit dans N benthamiane en utilisant un système d'expression transitoire médié par l'agroinfiltration [114]. Le domaine a été examiné en détail récemment [115], donc cet examen sera une discussion limitée sur les avancées majeures et les travaux plus récents.

Alors que des antigènes nombreux et variés ont été produits dans divers types de plantes en utilisant une variété de systèmes d'expression, il y a eu peu d'enquêtes systématiques sur les antigènes considérés comme essentiels à la production de vaccins contre le VIH - c'est-à-dire Gag et Env de pleine longueur - et aucune étude clinique essais de tout produit vaccinal candidat, bien que les MAb anti-VIH produits à partir de plantes soient passés à l'essai de phase 1 [116]. L'expression la plus réussie de la polyprotéine précurseur Pr 55 Gag complète à ce jour a été réalisée avec le sous-type B HIV-1 Gag dans le tabac transplastomique, avec des rendements de

VLP de 100 nm de diamètre jusqu'à 400 mg/kg de biomasse [117]. C'était près de 10 000 fois plus que le meilleur précédent de notre groupe, avec des VLP produites dans du tabac transgénique [81], et représente un rendement viable pour un produit avec un potentiel vaccinal sérieux : des preuves récentes que l'absence de progression vers le SIDA est liée aux fortes réponses CTL à Gag [118]-[120] renforce le besoin de vaccins qui peuvent cibler de telles réponses, et les VLP Pr 55 Gag sont de puissants éliciteurs de CTL, en particulier lorsqu'elles sont utilisées comme un boost protéique d'une amorce hétérologue dans des modèles de primates [ 121],[122]. Un article récent détaille comment l'antigène p24 du VIH-1 s'exprime transgéniquement dans Arabidopsis thaliana ou Daucus carota ont montré un effet d'amorçage chez les souris nourries avec du matériel végétal entier, provoquant des réponses immunitaires humorales détectées sous forme d'IgG sériques spécifiques anti-p24 après un rappel de protéine p24 purifiée par voie intramusculaire [123]. Il est intéressant de noter que les analyses d'antigène dose-dépendantes utilisant des transgéniques A. thaliana ont montré que les faibles doses d'antigène p24 étaient supérieures aux doses élevées.

Un nouveau multiantigène du VIH fabriqué à partir de plantes qui utilise les VLP est «… des particules enveloppées… constituées de Gag et d'une forme déconstruite de gp41 comprenant les domaines externes proximaux, transmembranaires et cytoplasmiques (dgp41) » [124]. Cela combine les qualités prouvées des VLP de Gag en tant qu'immunogène puissant auto-adjuvant induisant une réponse humorale et cellulaire avec une protéine d'enveloppe comprenant la région externe proximale de la membrane (MPER) du VIH gp41, qui est importante dans les processus d'infection et dans l'obtention d'anti- Anticorps VIH. Les deux gag et gp41 les gènes ont été largement déconstruits en termes d'élimination des sites de méthylation potentiels et des sites d'épissage et de polyadénylation cryptiques, et l'utilisation des codons végétaux a été optimisée. Gag a été exprimé de manière constitutive en transgénique N benthamiane plantes sous contrôle du promoteur CaMV 35S, à des niveaux de

22 mg/kg de biomasse. Les plantes transgéniques ont ensuite été infiltrées avec Agrobacterium transformé avec un vecteur de réplication MagnICON déconstruit exprimant la protéine d'enveloppe dgp41 qui a été ciblée sur l'apoplaste au moyen d'un peptide signal d'alpha-amylase d'orge. La coexpression a permis une accumulation >2 fois plus importante des deux protéines, avec dgp41 atteignant

9 mg/kg. La centrifugation en gradient de densité d'iodixanol a indiqué que les protéines coexprimées cosédimentaient dans une fraction plus dense que pour pgp41 lorsqu'elles étaient exprimées seules, et de la même manière que les fractions Gag-only qui étaient connues pour contenir des VLP - et en effet, caractéristiques

Des VLP enveloppées de 100 nm de diamètre ont été observées dans des extraits et in situ dans des sections de feuilles de plantes, et il a pu être montré qu'il bourgeonnait dans le milieu à partir de cellules co-transfectées protoplastées. Je pense que ces auteurs n'exagèrent pas dans leur affirmation selon laquelle "Ces résultats donnent une impulsion supplémentaire au cheminement vers un vaccin sous-unitaire largement efficace et peu coûteux contre le VIH-1", étant donné que leur candidat vaccin comprend à la fois l'ensemble de Gag et un Env populaire. -antigène cible dérivé.

L'expression d'Env de pleine longueur ou même de gp120 dans les plantes a été une cible insaisissable : il n'y a qu'un seul compte rendu publié de l'expression d'Env du VIH-1 d'origine végétale, et malgré le grand succès, ce n'était qu'en complément à la démonstration d'une production transitoire rapide et de haut niveau d'anticorps monoclonaux fonctionnels anti-VIH largement neutralisants [125]. L'Env était l'enveloppe VIH 89,6.P gp140ΔCFI développée par le Vaccine Research Centre, NIH, et était exprimée à la fois dans le SR1 transgénique stable N tabac et transitoirement par agroinfiltration dans N benthamiane, en tant que formes natives et marquées par KDEL, pour la rétention ou la sécrétion de RE et la glycosylation différentielle qui en résulte. Le gp140 a été exprimé avec succès - à

80 mg/kg de biomasse – et purifiée par homogénéisation et clarification des feuilles, suivies de Galanthus nivalis affinité sur colonne de lectine agglutinine (GNA) et chromatographie échangeuse d'ions DEAE. Comme prévu, les formes de gp140 retenues et sécrétées par le RE étaient glycosylées de manière différentielle, la première ne contenant que des glycanes OMT (pas de glycanes complexes), et la dernière avec seulement de faibles pourcentages de N-glycanes de type complexe. Ce faible pourcentage de glycanes complexes est similaire aux glycanes riches en mannose sur Env du VIH-1 associé au virion, qui diffère du pourcentage plus élevé de glycanes complexes sur Env produits dans les lignées cellulaires de mammifères. L'Env d'origine végétale s'est également lié à des MAb spécifiques du VIH-1 produits soit dans des cellules CHO, soit également produits dans des plantes, ce qui n'indique aucune différence significative entre celui-ci et l'Env produit par des cellules de mammifère. Il s'agit de la première preuve convaincante de la production d'une molécule Env pertinente pour le vaccin contre le VIH dans les plantes, qui, avec les preuves des VLP à base de Gag comprenant des dérivés Env des travaux précédents, indique que de véritables VLP du VIH pourraient être produites dans les systèmes végétaux. .

Une autre modalité de production liée à Env dans les plantes qui pourrait présenter un intérêt commercial pour le VIH ainsi que pour d'autres virus humains et animaux est révélée dans un brevet déposé par Medicago Inc. : il détaille l'utilisation de constructions chimériques d'« ectodomaines » de protéines de surface trimériques du virus enveloppé - telles que les rétrovirus, les rhabdovirus, les herpès, les corona, les paramyxo, les pox et les filovirus - fusionnées à un domaine transmembranaire de la protéine HA du virus de la grippe et à une queue cytoplasmique, afin de produire des VLP similaires à HA uniquement Les VLP mentionnés précédemment [126]. Leur construction HIV Env était une fusion de diverses parties du ConS ΔCFI gp145 - un Env modifié dépourvu du site de clivage gp120-gp41, le peptide de fusion, une région immunodominante dans gp41 et le domaine de queue cytoplasmique (CT) [127] - et le domaines transmembranaires (TM) et CT de la partie HA2 de la molécule HA H3 ou H5. Selon les termes du brevet, « bien que la protéine Env du VIH native s'accumule mal dans les plantes, une protéine Env du VIH chimérique, fusionnée à un domaine transmembranaire (TM) et à une queue cytoplasmique (CT) de la grippe HA s'accumule à un niveau élevé et se transforme en VIH. VLP en l'absence de protéine de noyau ou de matrice, dans les plantes ». Cela pourrait fournir une source véritablement nouvelle d'antigènes Env du VIH d'immunogénicité améliorée, en particulier pour une utilisation comme vaccin de rappel pour les régimes de vaccination hétérologues.

Vaccin contre le virus de la fièvre catarrhale du mouton

L'une des réussites les plus passionnantes de la bioagriculture vétérinaire ces dernières années est sans aucun doute la preuve de l'efficacité d'un vaccin végétal à base de VLP contre le virus de la fièvre catarrhale du mouton (BTV), un orbivirus contenant de l'ARNdb à plusieurs composants dans la famille Réoviridae[128]. Ce projet faisait partie de l'initiative EU FP7 Plant Production of Vaccines (PlaProVa) (http://www.plaprova.eu/), dont les activités liées aux vaccins à base de VLP sont en partie rapportées ici [129]. La fièvre catarrhale du mouton est un problème relativement récent chez les moutons et les chèvres en Europe du Nord [130], et est presque certainement le résultat du changement climatique affectant la répartition des moucherons Culicoides qui la transmettent [131]. Les vaccins sont considérés comme un élément essentiel de la lutte contre la maladie : cependant, contrairement au cas dans les zones endémiques telles que l'Afrique du Sud où des vaccins vivants atténués sont utilisés en routine, les inquiétudes concernant la sécurité des vaccins et l'émergence possible de nouvelles souches de virus en raison du réassortiment génomique avec des virus vivants souches vaccinales, ont entraîné une poussée pour le développement de vaccins à protéines recombinantes uniquement [132].

Il a été établi que l'expression recombinante des protéines BTV dans les systèmes de culture de cellules d'insectes et d'autres animaux entraîne la formation de diverses structures : l'expression de VP3 seule produit des particules de type subcore (SCLP) VP3 et VP7 produisent ensemble des particules de type noyau (CLP ) l'expression de ceux-ci plus VP5 et VP2 produit des VLP authentiques [133],[134]. S'appuyant sur les preuves que ces VLP sont protectrices chez les moutons exposés à un virus vivant [135], le groupe PlaProVa a étudié s'il était possible de faire la même chose en utilisant des antigènes produits par les plantes. Les constructions génétiques étaient basées sur la souche Netherlands NET2006/04 de BTV-8, et les séquences des gènes VP2, VP3, VP5 et VP7 ont été Nicotiana utilisation des codons optimisée. Les gènes ont été clonés pour l'expression dans pEAQ-HT, un vecteur d'expression contenant la séquence HT dérivée du virus de la mosaïque du niébé (CPMV) ou hypertrans translationnelle amplificatrice de l'ARN2 [136]. Fait intéressant, l'infiltration de N benthamiane les plantes avec VP3 et VP5 seules produisaient des symptômes nécrotiques si ceux-ci étaient combinés avec les autres protéines, aucune nécrose n'a été observée. Un simple criblage d'extraits clarifiés par ultracentrifugation en gradient de densité a montré que l'expression de VP3 seul, ou de VP3 + VP7, ou des quatre ensemble, a entraîné la co-sédimentation des protéines du virion sous forme d'agrégats à haut PM. Certains problèmes de stoechiométrie résultant d'une surexpression relative de VP3 - une suraccumulation de SCLP - ont été résolus en utilisant des vecteurs exprimant plus d'une protéine : VP2 et VP5 ont été exprimés via un double vecteur HT, avec VP3 et VP7 ensemble sur un autre vecteur avec L'expression de VP3 étant désaccordée par l'utilisation d'un UTR 5' ne contenant pas de HT. Cela a eu pour résultat de réguler à la baisse la formation de CLP et un changement significatif de l'équilibre vers la formation de VLP. Le rendement total en protéines BTV-8 par l'utilisation de ces vecteurs était de 200 mg par kg de biomasse, le rendement final des VLP purifiés par gradient était

70 mg par kg – ce qui est gratifiant, étant donné une dose de vaccin (voir ci-dessous) de 50 g de VLP/dose.

Le test des antigènes d'origine végétale a été réalisé chez le mouton : l'immunogénicité a été évaluée en injectant à deux moutons 20 µg de VLP mélangées 1:1 (v/v) avec de l'adjuvant incomplet de Freund, et un rappel à 21 et 42 jours. Le sérum recueilli 18 jours après le premier rappel était positif pour les anticorps anti-BTV à l'aide d'un kit de test ELISA commercial, et le sérum du jour 56 de l'hémorragie finale a réagi avec les quatre protéines structurelles dans les transferts western, avec la plus forte réactivité envers le déterminant majeur de l'immunogénicité (VP2) et le plus protéine structurale abondante (VP7). L'efficacité a été testée en injectant à quatre groupes de cinq moutons 50 g de VLP ou 200 μg de CLP mélangés 1:1 (v/v) avec l'adjuvant Montanide ISA70 VG, ou 5 × 10 4 TCID50/mL de BTV-8 vivant atténué commercial et rappel au jour 28. Les animaux ont été soumis à une provocation avec 1 mL de sang de mouton infecté contenant du BTV-8 vivant au jour 63, et les réactions cliniques ont été surveillées pendant 2 semaines. Les VLP produites par les plantes avaient un profil d'efficacité protectrice identique, tel qu'évalué par l'indice de réaction clinique (IRC), à celui du vaccin vivant atténué BTV-8, tandis que les CLP produites par les plantes étaient faiblement protectrices. Les sérums des VLP et du groupe vaccin vivant atténué ont montré des titres de neutralisation sériques élevés après le jour 28, cependant, les VLP n'ont induit des taux d'anticorps élevés qu'après l'injection de rappel, tandis que les anticorps neutralisants ont été induits par le vaccin atténué dès 7 jours après la vaccination. Les CLP produits par les plantes offraient une protection partielle contre la provocation par des virus vivants, similaire aux CLP produits par les cellules d'insectes.

Les résultats de cette enquête sont significatifs pour la bioagriculture et la vaccinologie en particulier pour un certain nombre de raisons. Tout d'abord, en tant que conclusion générale, il a montré qu'il est possible de produire raisonnablement facilement un complexe multiprotéique avec une stoechiométrie variable : une telle approche pourrait également être appliquée à d'autres virus complexes, tels que le virus de la peste équine, le rotavirus humain ou les picornavirus. comme le poliovirus ou le virus de la fièvre aphteuse. Deuxièmement, et pour le BTV en particulier, la capacité de produire des niveaux élevés de VLP correctement assemblées et protectrices chez le mouton est une preuve de concept et d'efficacité précieuse pour un vaccin contre une maladie émergente importante. De plus, le délai de quelques jours pour la production après la préparation de l'inoculum d'agroinfiltration signifie qu'il est possible de répondre rapidement et potentiellement localement aux foyers de maladie émergente.

Vaccins à double usage ou « Une seule santé »

La « One Health Initiative » (http://www.onehealthinitiative.com/) est une « … stratégie mondiale pour étendre les collaborations et les communications interdisciplinaires dans tous les aspects des soins de santé pour les humains, les animaux et l'environnement », qu'elle espère atteindre par, entre autres, « Efforts conjoints pour le développement et l'évaluation de nouvelles méthodes de diagnostic, de médicaments et de vaccins pour la prévention et le contrôle des maladies à travers les espèces ». Il existe un certain nombre de cibles vaccinales virales évidentes pour cette initiative : il s'agit de tous les virus zoonotiques qui affectent le bétail domestique et d'élevage pour lesquels il existe soit des vaccins ou des traitements humains insatisfaisants, soit aucun vaccin humain, et à fort impact récemment émergents virus sans vaccins pour les animaux ou les humains. Un bon exemple dans la première catégorie serait les exemples de virus de la rage pour la seconde seraient des agents tels que les coronavirus (CoV) du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS), le virus du Nil occidental (WNV) et Ebola et filovirus de Marburg. Thomas Monath a également récemment défini un « paradigme pour une seule santé » [137] qui spécifie trois cadres pour le développement et l'utilisation de vaccins pour contrôler les zoonoses :

Les vaccins du cadre I ciblent les hôtes humains et animaux sans issue.

Les vaccins du cadre II ciblent les infections [principalement transmises par des arthropodes] des animaux domestiques comme moyen de prévenir la propagation aux humains.

Les vaccins du Cadre III ciblent les réservoirs d'animaux sauvages.

Son exemple pour les vaccins du cadre 1 serait le virus du Nil occidental pour le cadre II, le virus de la rage, la fièvre de la vallée du Rift, l'encéphalite équine vénézuélienne et les virus Hendra pour le cadre III, des agents ciblés sur les réservoirs tels que la rage des appâts oraux.

Compte tenu de l'évidence des cibles, il est surprenant que très peu d'entre elles aient été explorées pour leur potentiel en tant que vaccins à base de plantes. La rage est l'une d'entre elles, et relativement tôt : une chimère du virus de la mosaïque de la luzerne CP et des épitopes dérivés de la glycoprotéine G et de la nucléoprotéine a été exprimée avec succès dans les plantes via deux systèmes différents basés sur des virus végétaux. Des extraits injectés par voie parentérale protégeaient les souris de l'épreuve, et des volontaires humains qui avaient ingéré du matériel végétal contenant de la rCP produisaient des anticorps neutralisant le virus de la rage [138]. Un gène de protéine G synthétique de pleine longueur - avec un peptide signal de sécrétion végétale et un signal de rétention du RE - s'est avéré raisonnablement bien s'exprimer (0,4 % de TSP) dans le tabac transgénique, et la protéine purifiée a suscité une protection complète contre une provocation intracérébrale virulente chez les sujets immunisés par voie intrapéritonéale. souris [139].

Le développement d'un vaccin oral efficace contre la rage a également été rapporté, avec des doses uniques de 50 g de glycoprotéine G de la souche Vnukovo de la rage dans des graines de maïs transgéniques contenant l'antigène à 1% de TSP, protégeant toutes les souris vaccinées d'une infection mortelle par le virus de la rage des chauves-souris vampires. 140]. Des tests supplémentaires de ce vaccin ont été effectués sur des moutons : des grains de maïs contenant différentes doses de protéine G (0,5, 1, 1,5 et 2 mg) ont été administrés en une seule dose par voie orale, et des doses de 2 mg ont induit un degré de protection comparable à celle conférée par le vaccin commercial injecté [141]. Les auteurs déclarent que « … il s'agit de la première étude dans laquelle un vaccin comestible administré par voie orale a montré une efficacité dans un modèle polygastrique », ce qui constitue un jalon important en vaccinologie vétérinaire et potentiellement One Health.

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo transmis par les tiques (CCHFV) et le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (RVFV) transmis par les moustiques bunyavirus. Le CCHFV a une distribution plus large, y compris l'Afrique, l'Asie, l'Europe méridionale et orientale et le Moyen-Orient [142], tandis que le RVFV est largement limité à l'Afrique subsaharienne. Cependant, les deux virus sont considérés comme ayant un potentiel émergent, le RVFV en particulier étant considéré comme ayant le potentiel de se propager en Europe, en Asie et dans les Amériques [143]. Bien que des vaccins vivants atténués soient disponibles pour le virus RVFV, ceux-ci sont considérés comme ayant des effets secondaires importants, il n'existe aucun vaccin accepté pour l'un ou l'autre virus pour une utilisation générale chez l'homme.

Une étude récente a étudié l'expression des deux glycoprotéines d'enveloppe de CCHFV riches en épitopes neutralisants Gc et Gn dans des cultures de racines velues et dans des feuilles dérivées de plants de tabac transgéniques [144]. Les protéines se sont accumulées à des niveaux de 1,8 mg/kg de biomasse dans les racines velues et de 1,4 mg/kg dans les feuilles. Des groupes séparés de souris ont été nourris avec des feuilles ou des racines transgéniques, ou nourris avec du matériel végétal et injectés par SC avec les protéines fabriquées par les plantes, ou vaccinés avec un vaccin CCHFV atténué comme témoin positif. Les souris de tous les groupes immunisés présentaient une augmentation constante des anticorps IgG et IgA anti-Gc et Gn dans le sérum et les selles, respectivement. Cependant, les souris du groupe nourries et stimulées par voie parentérale ont présenté une augmentation significative des IgG anti-CCHFV (titre de 1/32 000 par rapport à 1/256 pour la seule injection orale) après un seul rappel. De plus, les protéines Gc et Gn purifiées par les plantes ont réagi avec des immunoglobulines humaines dans le sérum d'un patient qui s'était rétabli d'une infection par le CCHFV. Le potentiel de production de protéines recombinantes dans les plantes en tant que vaccin contre le CCHFV semble évident, bien que les rendements semblent faibles pour la production de routine.

La production d'antigènes du virus de la fièvre de la Vallée du Rift chez les plantes est beaucoup moins bien étudiée : il existe une thèse de doctorat qui rapporte l'expression d'une construction Gn tronquée ou d'ectodomaine soluble et du gène de la nucléoprotéine (N) dans Arabidopsis thaliana[145]. Cette étude a choisi ces deux antigènes car Gn est le plus efficace pour déclencher des anticorps neutralisants des deux glycoprotéines d'enveloppe et l'ectodomaine Gn recombinant (tGn) est connu pour être protecteur, et l'antigène N déclenche des anticorps non neutralisants mais aussi un fort système immunitaire cellulaire. réponse qui est partiellement protectrice. La protéine N s'est accumulée à des niveaux élevés tandis que la protéine Gn tronquée ne s'est pas accumulée à des niveaux détectables par western blot. Nourrir des groupes de souris avec du matériel végétal transgénique trois fois (0, 2 et 4 semaines) contenant du tGn ou

70 g de protéine N pour 4 souris ont entraîné une séroconversion après la deuxième alimentation pour les deux antigènes, avec des titres plus élevés (10 3 – 10 4 ) pour N par rapport au tGn (10 2 – 10 3 ). Bien que ces résultats soient très préliminaires en ce qui concerne un vaccin, ils indiquent la faisabilité d'abord, d'utiliser un antigène transgénique ou produit de manière transitoire dans des tissus végétaux comme vaccin oral chez les animaux, et deuxièmement, de produire un antigène pour des processus de purification complète ou partielle qui pourrait aboutir à un vaccin humain.

Anticorps thérapeutiques anti-viraux

Une revue récente utile détaille comment les produits d'anticorps à base de plantes peuvent « … fournir un coût initial inférieur, un délai plus court pour l'approvisionnement clinique et commercial, et un coût inférieur des marchandises (COG)… [et] des améliorations de la pharmacocinétique, de l'innocuité et de l'efficacité » [146] . À titre d'exemple, un aspect important de la prévention de la rage est la thérapie, étant donné les nombreuses personnes dans les pays en développement qui se font mordre par des animaux suspectés de rage chaque année - et un développement majeur dans ce domaine est la production d'anticorps puissants neutralisant la rage dans les plantes, étant donné la situation actuelle de pénurie et de qualité variable des sérums produits principalement par des chevaux. Un consortium de chercheurs comprenant des Sud-Africains a récemment décrit l'ingénierie et la production de transgéniques N tabac plantes d'une version IgG humanisée du MAb E559 murin largement neutralisant, et de la version murine [147]. La purification par chromatographie d'affinité sur la protéine d'agarose A/G a donné 1,8 mg/kg de biomasse (0,04 % de TSP) pour le Mab chimérique et 1,2 mg/kg de biomasse (0,03 % de TSP) pour l'Ab murin. Les deux anticorps se sont assemblés correctement et étaient équivalents aux MAb produits par hybridome pour neutraliser un panel de lyssavirus comprenant tous les virus du phylogroupe I RABV classique, virus Duvenhage, lyssavirus de chauve-souris européen de types 1 et 2 et lyssavirus de chauve-souris australien, bien qu'aucune neutralisation n'ait été observée. pour les virus du phylogroupe II Lagos bat virus et Mokola virus. L'efficacité de la prophylaxie post-exposition de l'Ac humanisé a été testée chez des hamsters auxquels on avait injecté une dose mortelle de la souche virale CVS-11 : l'anticorps produit par la plante était apparemment plus efficace que l'immunoglobuline antirabique humaine commerciale (HRIG Rabigam), en ce sens la survie pour les deux groupes de traitement était de >50 % après 14 jours, et de zéro et 11 % pour les groupes HRIG et Ab plant, respectivement, après 28 jours.

La production d'anticorps anti-virus Ebola a également été récemment explorée dans les plantes : cela pourrait pourtant devenir un élément important de l'arsenal de prévention des maladies chez les personnels de santé, étant donné qu'à l'heure où nous écrivons ces lignes, une épidémie de fièvre hémorragique Ebola incontrôlée faisait toujours rage dans les L'Afrique de l'Ouest (http://www.who.int/csr/don/archive/disease/ebola/en/), s'était étendue de la Guinée à la Sierra Leone, au Libéria, au Nigeria, à l'Espagne et aux États-Unis (http://www .promedmail.org/direct.php?id=2823539), et l'utilisation de solutions expérimentales n'était pas seulement suggérée [148], mais était mise en pratique.

En arrière-plan, l'utilisation d'un système d'expression transitoire basé sur les géminivirus à haut rendement dans N benthamiane particulièrement adapté à l'expression simultanée de plusieurs protéines avait auparavant permis l'expression d'un MAb (6DB) connu pour protéger les animaux de l'infection par le virus Ebola, à des taux de 0,5 g/kg de biomasse [149]. Le même groupe a également utilisé le même système de vecteur (décrit en détail ici [24]) dans la laitue pour produire des MAb potentiellement thérapeutiques contre les virus Ebola et West Nile [150].

Une enquête plus complète a été rapportée récemment, à la fois sur la production végétale de Mab et la prophylaxie post-exposition de l'infection par le virus Ebola chez les macaques rhésus [151]. Trois MAb chimériques humains et souris spécifiques d'Ebola (h-13 F6, c13C6 et c6D8, ces deux derniers étant tous deux neutralisants) ont été produits en totalité. N benthamiane plantes par agro-infiltration de vecteurs viraux dérivés de magnICON TMV. Un mélange des trois MAb - appelé MB-003 - administré en une dose unique de 16,7 mg/kg par Mab 1 heure après l'infection suivie de doses aux jours 4 et 8, a protégé 3 des 3 macaques d'une provocation létale avec 1 000 pfu du virus Ebola. Les chercheurs ont par la suite montré une protection significative avec un traitement au MB-003 administré 24 ou 48 heures après l'infection, avec quatre des six singes testés survivants, contre aucun chez deux témoins. Tous les animaux survivants traités avec MB-003 ont présenté une virémie insignifiante, voire aucune, et des symptômes cliniques négligeables par rapport aux animaux témoins. Une découverte importante a été que les MAb produits par les plantes étaient trois fois plus puissants que les équivalents produits par les cellules CHO – un cas clair de production végétale conduisant à des « biobetters ». Un suivi de ce travail a étudié l'efficacité du traitement avec MB-003 après confirmation de l'infection chez les macaques rhésus, « selon un protocole de diagnostic pour l'autorisation d'utilisation d'urgence de la Food and Drug Administration des États-Unis » [152]. Dans cette expérience, 43 % des animaux traités ont survécu, alors que tous les témoins testés ici et précédemment avec le même protocole de provocation sont morts de l'infection.

Un article publié lors de l'épidémie d'Ebola [153] a détaillé l'utilisation thérapeutique chez les macaques rhésus d'un cocktail d'AcM anti-Ebola appelé ZMapp. Ceci est décrit comme un successeur de MB-003, incorporant des composants du cocktail ZMAb développé par le Laboratoire national de microbiologie de l'Agence de la santé publique du Canada et un autre mélange d'anticorps, et a été développé par Mapp Biopharmaceutical de San Diego avec Defyrus de Toronto et fabriqué par Kentucky BioProcessing. Le cocktail s'est avéré capable de sauver 100% des macaques lorsqu'il a été administré jusqu'à 5 jours après la provocation par un virus vivant. Il est à noter que la maladie avancée chez de nombreux animaux - indiquée par des enzymes hépatiques élevées, des hémorragies des muqueuses et des pétéchies généralisées - a été inversée, conduisant à un rétablissement complet. ZMapp s'est également avéré se lier aux virions de la variante guinéenne d'Ebola impliquée dans la présente épidémie. Les auteurs affirment que « ZMapp dépasse l'efficacité de toute autre thérapie décrite jusqu'à présent, et les résultats justifient le développement ultérieur de ce cocktail à usage clinique ».

Dans les nouvelles reçues lors de l'examen de cet article qui peuvent justifier ce point de vue, un rapport cité comme provenant de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses indique que deux travailleurs de la santé américains qui ont contracté Ebola au Libéria ont été traités avec ZMapp [154]. Bien qu'il ait été administré jusqu'à neuf jours après l'infection dans un cas, il semble avoir été efficace [155]. Dans des développements ultérieurs, la thérapie a également été administrée à cinq autres personnes, dont deux sont décédées. Le gouvernement américain négociait au moment de la rédaction de cet article pour produire de grandes quantités de ZMapp comme thérapie de première intention [156],[157]. Pour illustrer le problème de mise à l'échelle auquel sont confrontés les fabricants, dans l'essai sur le macaque mentionné ci-dessus [151], les animaux ont reçu trois doses de ZMapp à 50 mg/kg par voie intraveineuse à 3 jours d'intervalle. Pour un humain adulte de 70 kg recevant la même dose, cela signifierait un total de 10,5 (3 × 3,5) grammes de ZMapp : en supposant un rendement purifié optimal de chacun des trois MAb individuellement à 100 mg/kg de biomasse végétale, cela signifierait 105 kg de N benthamiane serait nécessaire pour doser une seule personne de manière optimale. Alors que la bioagriculture peut être la technologie la plus évolutive pour produire des MAb et d'autres produits thérapeutiques, ce type d'échelle nécessite des ressources bien plus importantes que celles qui existent actuellement.

Une nouvelle application de la même technologie a également été utilisée pour produire un complexe immun Ebola (EIC) dans N benthamiane, consistant en la glycoprotéine d'enveloppe d'Ebola GP1 fusionnée à l'extrémité C-terminale de la chaîne lourde de l'AcM 6D8 humanisé, qui se lie à un épitope linéaire sur GP1. La co-expression médiée par le vecteur Geminivirus de la fusion GP1-HC et de la chaîne légère 6D8 a produit une immunoglobuline assemblée, qui a été purifiée par chromatographie d'affinité sur protéine G. Les molécules résultantes se sont liées au facteur du complément C1q, indiquant la formation de complexes immuns. L'immunisation sous-cutanée de souris avec un EIC purifié a provoqué une production élevée d'anticorps anti-GP1, comparable à l'utilisation de VLP GP1 [158]. Il s'agit du premier compte rendu publié d'un vaccin candidat contre le virus Ebola à être produit dans des plantes.

Perspectives d'avenir pour les vaccins d'origine végétale

Les perspectives d'une utilisation croissante des plantes pour la fabrication de produits pharmaceutiques en général semblent de plus en plus brillantes, en particulier avec l'approbation et l'homologation récentes de la glucocérébrosidase, l'enzyme thérapeutique de la maladie de Gaucher produite par les cellules de carotte de Protalix, commercialisée sous le nom d'ELELYSO™ (taliglucerase alfa) (http:/ /www.protalix.com/products/elelyso-taliglucerase-alfa.asp). Ce produit a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis pour injection en mai 2012 pour le traitement substitutif à long terme chez les adultes ayant un diagnostic confirmé de maladie de Gaucher de type 1. Bien qu'il soit commercialisé comme un biosimilaire à l'enzyme produite par les cellules de mammifères, il s'agit en fait d'un biomeilleur, étant donné qu'il est naturellement mannosylé - ce qui facilite l'absorption par les macrophages, par exemple - contrairement au produit conventionnel, qui doit être chimiquement modifié. D'autres produits biologiques tels que les MAb thérapeutiques à utiliser comme agents anti-VIH dans les microbicides sont également très proches de l'enregistrement – ​​et l'expérience récente avec les MAb anti-Ebola pourrait bien accélérer le processus.

Cependant, si les perspectives des vaccins animaux en général et éventuellement des vaccins thérapeutiques humains semblent également favorables, compte tenu d'un nombre croissant de preuves d'efficacité dans ce domaine, pour les vaccins humains prophylactiques en particulier, elles ne sont pas aussi brillantes - à court terme, du moins. La longueur et la rigueur du processus de développement et d'essais cliniques des vaccins prophylactiques humains par rapport aux vaccins thérapeutiques animaux et humains sont un énorme obstacle à la production commerciale de nouveaux vaccins issus de l'agriculture biologique, tout comme l'investissement enraciné dans la technologie conventionnelle par Big Pharma. Il se peut que la technologie trouve une niche en marge de la vaccinologie conventionnelle, où il existe un besoin de production à petite échelle de vaccins contre les maladies orphelines ou de réponses rapides aux flambées de maladies virales liées au bioterrorisme ou émergentes. Un domaine dans lequel les vaccins issus de l'agriculture biologique pourraient bientôt percer pourrait être celui des vaccins à réponse rapide aux nouvelles épidémies de virus de la grippe : la capacité d'une telle réponse a déjà été démontrée (voir ci-dessus), il reste à la mettre à l'épreuve dans un scénario réel. Une fois que cela se produit, il est plus probable que la technologie soit utilisée pour d'autres agents, tels que les virus MERS-CoV, RVFV et West Nile et Chikungunya, pour lesquels les principes «Une seule santé» sont importants.


Les virus des plantes attaquent-ils les animaux ? exemples? - La biologie

Du plus petit insecte au plus grand mammifère, la plupart des animaux se nourrissent de plantes. Ces animaux sont appelés herbivores. Au début, vous pouvez penser que les plantes restent là et se font manger. Ils ne peuvent certainement pas se lever et s'enfuir ! Cependant, les plantes ont de nombreuses défenses pour les aider à survivre.

Deux types de défenses

  • Constitutif - Une défense constitutive est celle qui est toujours présente dans la plante. La plupart des défenses des plantes sont constitutives.
  • Induite - Une défense induite est une défense temporaire qui vise à se défendre contre une zone de la plante où elle a été attaquée ou blessée.

Tout comme nous, les plantes peuvent contracter des maladies qui peuvent les rendre malades et mourir. Afin d'empêcher les agents pathogènes et les petites bactéries de pénétrer à l'intérieur, les plantes ont des parois cellulaires rigides. Ils ont également une cuticule cireuse à l'extérieur de leurs feuilles qui les protège.

Les plantes doivent aussi se défendre contre les insectes. De nombreux arbres et buissons ont une écorce épaisse sur leurs branches et leurs tiges qui garde les insectes à l'extérieur. L'écorce a de nombreuses couches et l'extérieur de l'écorce est mort et dur. Cela empêche tous les insectes, sauf les plus déterminés, de percer le tronc de l'arbre.

Certaines plantes utilisent des épines pour se protéger d'être mangées par des animaux plus gros. Les épines peuvent piquer et déranger suffisamment un animal pour le faire passer à une autre plante. Quelques exemples d'épines incluent les épines sur la tige d'un rosier et les épines sur un cactus. Certains types d'épines de cactus peuvent être particulièrement dangereux car ils ont des barbes qui collent à la peau et ne sont pas faciles à enlever.

Les plantes développent souvent des produits chimiques qui agissent comme des poisons rendant un animal malade ou même le tuant. Au fil du temps, les animaux apprennent à ne pas manger les plantes vénéneuses. Certaines plantes vénéneuses courantes comprennent les bulbes de jonquilles, l'herbe à puce, la glycine, la digitale et les chrysanthèmes.

Parfois, les plantes sont capables de détecter quand elles sont attaquées par certains insectes. Ils émettront des produits chimiques qui attirent les prédateurs vers les animaux qui les attaquent.

Une façon d'éviter d'être mangé est d'avoir mauvais goût. De nombreuses plantes utilisent des produits chimiques pour leur donner un goût amer. Si une plante plus savoureuse se trouve à proximité, l'animal passera à autre chose.

Certaines plantes ont en fait renversé la vapeur sur les insectes et non seulement se défendent contre eux, mais les mangent. Un exemple est le piège à mouches venus qui a un piège qui ressemble à des feuilles. Si une mouche, ou un autre insecte, arrive sur ses feuilles, elle fermera rapidement le piège et libérera ensuite des enzymes pour digérer l'insecte.


Résumé

Les plantes ont évolué dans un environnement riche en micro-organismes désireux de capitaliser sur les capacités de biosynthèse et de production d'énergie des plantes. Il existe environ 450 espèces de virus phytopathogènes, qui provoquent diverses maladies. Cependant, les plantes n'ont pas été passives face à ces agressions, mais ont développé des mécanismes de défense élaborés et efficaces pour prévenir ou limiter les dommages dus à l'infection virale. Les gènes de résistance des plantes confèrent une résistance à divers agents pathogènes, y compris les virus. La réponse de défense qui est initiée après la détection d'un virus spécifique est stéréotypée, et les caractéristiques cellulaires et physiologiques qui lui sont associées ont été bien caractérisées. Récemment, le silençage de l'ARN a pris de l'importance en tant que voie cellulaire importante pour la défense contre les acides nucléiques étrangers, y compris les virus. Ces voies fonctionnent de concert pour assurer une protection efficace contre l'infection virale chez les plantes.


Agents pathogènes végétaux et animaux

En ce qui concerne les animaux d'élevage, seul un petit nombre de maladies virales sont capables d'infliger des dommages économiques majeurs. Les exemples incluent la fièvre aphteuse chez les bovins et les porcs, la peste porcine classique et la peste porcine africaine chez les porcs, et la grippe aviaire et la maladie de Newcastle chez les volailles. Certaines maladies du bétail sont « zoonotiques », ce qui signifie qu'elles provoquent des maladies chez les humains ainsi que chez les animaux, notamment la fièvre charbonneuse, la tularémie, la brucellose, la grippe aviaire et la fièvre de la vallée du Rift, causées par un virus transmis par les moustiques. 2

L'Organisation mondiale de la santé animale classe cinq agents pathogènes non endémiques du bétail dans la « Liste A » en raison de la gravité des maladies qu'ils produisent, de leur facilité de dissémination et de leur niveau élevé de transmissibilité : fièvre aphteuse, fièvre catarrhale du mouton, fièvre de la vallée du Rift, bovin l'encéphalite spongiforme (« maladie de la vache folle ») et la grippe aviaire. Un deuxième groupe d'agents pathogènes de la « Liste B » sont modérément faciles à disséminer et provoquent des maladies modérées avec un faible taux de mortalité. . En 2011, un agent pathogène majeur du bétail, la peste bovine, a été éradiqué dans le monde entier, une réalisation majeure de la santé animale internationale. 3

Les attaques terroristes contre les cultures ou le bétail pourraient être menées avec une variété d'agents nocifs, notamment des virus, des bactéries, des champignons, des nématodes et des insectes nuisibles.Les maladies les plus graves des plantes sont causées par des agents pathogènes fongiques, tels que le charbon du blé, la pyriculariose du riz, le mildiou du maïs et la carie karnal du blé. Les spores fongiques peuvent être cultivées en grande quantité, sont stables dans différentes conditions météorologiques et sont naturellement transmises par l'air. Ces agents réduisent considérablement les rendements du maïs, du riz et du blé. De petites quantités d'agents pathogènes fongiques pourraient se propager à de vastes étendues de terres cultivées, et leur longue période d'incubation les rend difficiles à détecter à un stade précoce 2 .