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Opérons de code ADN anti-parallèle


Du point de vue de l'ingénierie logicielle, supposons que j'ai une chaîne de code comme ceci :

… 5'-ATAGAC-3'…

… 3'-TATCTG-5'…

Supposons que le code ci-dessus fasse partie d'un segment plus large. Maintenant, en lisant de 3' à 5', le promoteur et l'opérateur seraient quelque part avant le gène de structure sur le 2ème stand :

(Promoteur) (Opérateur)… 3'-TATCTG-5'…

Où serait-il sur le premier brin? D'après ce à quoi cela ressemble, le premier brin code pour une protéine complètement différente de celle du second stand :

… 5'-ATAGAC-3'… (Opérateur) (Promoteur)

Pourtant, les deux volets sont complémentaires.


Dans votre exemple, oui, les deux brins codent pour des protéines différentes. Cependant, biologiquement, cela ne se produit généralement pas. Je dis généralement parce que je ne veux pas l'exclure définitivement, mais je ne connais pas de cas où les deux brins à un locus donné codent pour une protéine et, là où cela se produit, il est souvent utilisé comme critère d'annotation l'un des éléments comme douteux. Parallèlement à cela, il n'y aurait pas de promoteur immédiatement 5' à l'un des brins. Même si cela se produit biologiquement, chaque brin coderait pour une protéine différente et serait un gène différent.

Dans n'importe quel gène, l'un des brins est identique au transcrit d'ARN (avant traitement et avec T au lieu de U). C'est ce qu'on appelle le brin de codage ou sens et s'étend sur 5' -> 3'. L'autre brin est utilisé comme matrice par l'ARN polymérase (RNAP) pour polymériser le transcrit d'ARN. Il s'étend sur 3' -> 5' et s'appelle le modèle ou le brin antisens.

De plus, une note sur les promoteurs : les séquences consensus des promoteurs par convention sont données sur le brin sens. Cependant, pour autant que je sache, les facteurs d'initiation de la transcription reconnaissent l'appariement des bases entre les deux brins dans le sillon principal de l'ADNdb car ils doivent se lier avant que la fusion du promoteur ne se produise. Ainsi, je ne dirais pas qu'un promoteur n'existe que sur le brin modèle.


16.2A : L'opéron trp : Un opéron répresseur

  • Contribution de Boundless
  • Microbiologie générale chez Boundless

L'opéron trp est un opéron répresseur qui est soit activé soit réprimé en fonction des niveaux de tryptophane dans l'environnement.

  • Expliquer la relation entre la structure et la fonction d'un opéron et la manière dont les répresseurs régulent l'expression des gènes

Opéron

T.M. Picknett , S. Brenner , dans Encyclopedia of Genetics , 2001

Un opéron typique comprend plusieurs types de gènes :

Gènes structuraux (S1-Sn) qui codent pour les structures primaires des protéines enzymatiques impliquées dans une voie métabolique, telle que la biosynthèse d'un acide aminé.

Le promoteur (P), une courte séquence d'ADN agissant comme point de départ, et à laquelle l'ARN polymérase se lie. Le promoteur est contrôlé par divers éléments régulateurs qui répondent aux stimuli environnementaux.

L'opérateur (O), comprenant un court segment d'ADN adjacent au promoteur, est un élément de contrôle qui se lie à une protéine régulatrice qui peut soit réprimer soit activer la transcription.


Le Concept Opéron | Code génétique

L'ADN présent dans une cellule contient des informations génétiques pour toutes les protéines requises par un organisme et peut contenir de quelques à des milliers de gènes. Tous les gènes fonctionnels ne fabriquent pas toujours des polypeptides. Bien que les différents types de cellules dans le corps d'un organisme diffèrent dans leur structure et leur fonction, leurs gènes sont identiques.

Au fur et à mesure que le développement progresse, l'activité de certains gènes augmente tandis que celle d'autres diminue ou s'arrête, i. e., les gènes sont activés et désactivés à des moments différents.

Ce processus est appelé action différentielle des gènes. Lorsque les gènes sont actifs, ils dirigent la synthèse d'enzymes et de protéines qui affectent certains traits phénotypiques. Les produits métaboliques peuvent influencer la synthèse des enzymes (feed-back ou inhibition du produit final).

Bien que la cellule puisse contenir de nombreux gènes qui produisent autant d'enzymes que leur nombre, seules les enzymes nécessaires à un moment donné sont produites. Par conséquent, le flux d'informations de l'ADN (gène) à la protéine est régulé d'une manière ou d'une autre.

Le mécanisme de régulation de l'action des gènes a été largement étudié chez certains micro-organismes tels que Escherichia coli et certains organismes supérieurs. Une hypothèse pour expliquer l'induction et la répression de la synthèse enzymatique a été proposée pour la première fois par François Jacob et Jacques Monod (1961). Pour cette contribution et d'autres brillantes, ils ont reçu le prix Nobel de médecine en 1965.

Le schéma proposé par Jacob et Monod s'appelle Operon Model et se compose des éléments suivants (Fig. 20.3). Opéron est un groupe de gènes de structure dont la transcription est régulée par l'action du gène régulateur, du gène promoteur, du gène opérateur et du gène terminateur.

Des études récentes en génétique microbienne ont clairement indiqué que tous les gènes n'agissent pas en déterminant la structure de protéines ou d'enzymes données. Certains d'entre eux régulent l'action d'autres gènes et sont appelés gènes régulateurs. La régulation peut être provoquée soit par la suppression de la synthèse des protéines, soit par l'induction du processus.

Ceux-ci sont directement concernés par la synthèse des protéines cellulaires. Les gènes de structure produisent des « RN As par transcription et déterminent la séquence d'acides aminés dans les protéines synthétisées. Comme il y a beaucoup de protéines dans les cellules, il y a autant de gènes de structure sous contrôle commun.

Chaque gène de structure peut être contrôlé indépendamment et qui transcrit une molécule d'ARNm séparée ou tous les gènes de structure sous un opéron peuvent former une longue molécule d'ARNm polycistronique ou polygénique.

Les eucaryotes n'ont qu'un seul site fonctionnel pour produire de l'ARNm monogénique, alors que, chez les procaryotes, les ARNm polygéniques sont courants. Un petit segment de molécule d'ADN dans une bactérie peut avoir plusieurs gènes de structure qui peuvent transcrire une longue molécule d'ARNm polycistronique. Cela contrôle la synthèse de nombreuses protéines.

Le gène opérateur est adjacent au premier gène de structure. Il détermine si le gène de structure doit être réprimé par la protéine répresseur, un produit du gène régulateur. Le gène opérateur est reconnu par la protéine répresseur qui se lie à l'opérateur en formant un complexe opérateur-répresseur.

Les gènes opérateurs ainsi que le groupe de gènes qui se trouvent en dessous sont appelés opérons. Les gènes opérateurs sont portés dans le chromosome et présentent également une recombinaison.

Il est continu avec le gène de l'opérateur et est situé juste avant l'opérateur. La séquence nucléotidique complète de la région de contrôle chez certaines bactéries s'étend à partir du codon de terminaison (ACT sur l'ADN ou UGA sur l'ARNm) du gène de structure et induit les gènes promoteur et opérateur. La région promotrice selon Pribnow (1975) a trois éléments essentiels qui sont constants en position les uns par rapport aux autres.

(ii) une séquence de liaison ARN-polymérase, et

(iii) Un site d'initiation d'ARNm.

Le site de reconnaissance est situé à l'extérieur du site de liaison à la polymérase, c'est-à-dire la région de l'ADN protégée de l'action de la DNase. L'ARN polymérase se lie d'abord à l'ADN en formant un complexe avec la séquence de reconnaissance. Ensuite, il se lie à la séquence de liaison pour produire le complexe de pré-initiation.

Le site de liaison est constitué d'un groupe de 7 bases présentes en position constante dans les fragments protégés. Le site d'initiation de l'ARN démarre la transcription de l'ARNm sur une ou deux bases près de la séquence de liaison. La séquence de départ est située dans le fragment d'ADN protégé de l'action de la DNAse.

Ces gènes dirigent la synthèse d'une protéine qui peut être soit un répresseur actif, soit un répresseur inactif (apo-répresseur). La protéine répresseur a un site actif pour la reconnaissance de l'opérateur et l'autre site actif pour l'inducteur. Lorsque l'inducteur se lie au répresseur, il déforme la molécule de sorte que le site opérateur ne reconnaît plus le gène opérateur.

La protéine répresseur active a une affinité pour le gène opérateur. En l'absence d'une protéine inductrice, le répresseur se lie au gène opérateur et bloque le chemin de l'ARN polymérase.

Ainsi, les gènes de structure sont incapables de transcrire l'ARNm et par conséquent la synthèse des protéines ne se produit pas. En présence d'un inducteur, la protéine répresseur se lie à l'inducteur pour former un complexe inducteur-répresseur ou co-répresseur.

Le répresseur lorsqu'il est lié à un inducteur subit un changement qui le rend inefficace et par conséquent il ne peut pas se lier au gène opérateur et la synthèse protéique est possible.

Un inducteur ou effecteur est une petite molécule—un sucre, un acide aminé ou un nucléotide qui peut être lié à une protéine régulatrice ou répressive pour modifier sa capacité à interagir avec un gène opérateur ou promoteur.

Jacob et Monod ont suggéré qu'une protéine régulatrice se lie à un opérateur et inhibe l'expression de l'opéron tant que l'effecteur ou l'inducteur est absent, mais si la molécule effectrice apparaît dans l'environnement intracellulaire, elle se lie à la protéine régulatrice et tire ainsi le régulateur loin de l'opérateur.

Selon le concept de Jacob et Monod, l'opéron est un groupe de gènes structuraux contigus présentant une expression coordonnée et des sites étroitement associés. Cette définition ne présuppose aucun mécanisme particulier de régulation, négative ou positive.

Dans le cas d'un contrôle négatif de l'opéron, l'expression des éléments de contrôle est codée de telle sorte que la transcription de l'opéron se produise en l'absence de tout composant régulateur cytoplasmique (répresseur) spécifique du système particulier.

Dans le cas d'un système de contrôle positif, le codage au niveau du site de contrôle de l'initiateur empêche l'expression de l'opéron en l'absence de tout produit régulateur spécifique. L'opéron représente une unité de transcription génétique coordonnée polarisée chez les procaryotes qui est initiée et régulée sur le site de l'opérateur.

Il se compose du promoteur, de l'opérateur, d'un ou plusieurs gènes de structure codant pour des enzymes réalisant des fonctions métaboliques apparentées, et du terminateur (Fig. 21.4). La transcription de l'opéron qui aboutit finalement à un ARNm polycistronique commence au niveau du promoteur où l'ARN-polymérase se lie à l'ADN. La synthèse de l'ARNm démarre si l'opérateur est exempt de protéine répresseur (contrôle négatif).

Dans le système répressible, la protéine répresseur formée par le gène régulateur est inactive, par conséquent, elle ne bloque pas l'opérateur et la synthèse protéique a lieu. Le répresseur est activé en présence de co-répresseur et le complexe répresseur-co-répresseur rend le gène opérateur inactif. En conséquence, la synthèse des protéines ne peut pas avoir lieu.

Les gènes régulateurs produisent des macromolécules qui agissent sur les gènes opérateurs pour les activer ou les désactiver. Un seul gène régulateur peut affecter la synthèse de différentes protéines alors que le gène de structure obéit à la règle un gène-une enzyme.

Si les substances répresseurs produites par les gènes régulateurs agissent sur les gènes opérateurs, elles dépriment leur activité et alors ces derniers ne permettent pas aux gènes de structure de produire leurs ARNm. C'est ce qu'on appelle la condition d'arrêt (Fig. 21.5).

Les gènes régulateurs produisent parfois des substances inductrices. Si cette substance est présente dans le nucléoplasme, elle se combine avec la substance répresseur, ces deux substances répresseur et inducteur n'agissent pas sur les gènes opérateurs (O), elles activent les gènes opérateurs et permettent aux gènes opérateurs d'activer les gènes de structure comme indiqué ci-dessous dans la figure 21.6.

La transcription se termine à la fin de l'opéron défini par le site de terminaison où l'ARNm est libéré. Le taux de transcription dans un opéron donné est fonction de deux paramètres.

(i) La fréquence d'initiation de la transcription, et

(ii) Le taux de transcription.

Certains opérons semblent avoir des loci régulateurs supplémentaires en plus du site promoteur habituel adjacent à l'opérateur, et un promoteur supplémentaire entre les gènes de structure a été trouvé. Étant donné que le gène promoteur supplémentaire n'est pas lié à l'opérateur, une certaine transcription des derniers gènes se produit même lorsque le système est éteint.


3.4.1 ADN, gènes et chromosomes

Dans les cellules procaryotes, les molécules d'ADN sont courtes, circulaires et non associées à des protéines.

Dans le noyau des cellules eucaryotes, les molécules d'ADN sont très longues, linéaires et associées à des protéines, appelées histones. Ensemble, une molécule d'ADN et ses protéines associées forment un chromosome.

Les mitochondries et les chloroplastes des cellules eucaryotes contiennent également de l'ADN qui, comme l'ADN des procaryotes, est court, circulaire et non associé à une protéine.

Un gène est une séquence de bases d'ADN qui code pour :

  • la séquence d'acides aminés d'un polypeptide
  • un ARN fonctionnel (y compris l'ARN ribosomique et les ARNt).

Un gène occupe une position fixe, appelée locus, sur une molécule d'ADN particulière.

Une séquence de trois bases d'ADN, appelée triplet, code pour un acide aminé spécifique. Le code génétique est universel, non chevauchant et dégénéré.

Chez les eucaryotes, une grande partie de l'ADN nucléaire ne code pas pour les polypeptides. Il existe, par exemple, des répétitions multiples non codantes de séquences de bases entre les gènes. Même au sein d'un gène, seules certaines séquences, appelées exons, codent pour des séquences d'acides aminés. Au sein du gène, ces exons sont séparés par une ou plusieurs séquences non codantes, appelées introns.


Régulation de la transcription chez les procaryotes

David P. Clark , . Michelle R. McGehee , dans Molecular Biology (troisième édition) , 2019

4.1 Le modèle opéron de régulation des gènes

Un opéron est un groupe de gènes qui sont transcrits ensemble pour donner une seule molécule d'ARN messager (ARNm), qui code donc pour plusieurs protéines ( Fig. 16.11 ). Tel ARNm polycistronique se trouve généralement chez les procaryotes. Les gènes d'un opéron sont souvent liés fonctionnellement, il est donc logique de les réguler en tant que groupe. Par exemple, un opéron peut coder pour plusieurs enzymes qui participent à la même voie biochimique. Certains opérons n'ont qu'un seul gène, la plupart en ont deux à une demi-douzaine et quelques-uns en ont plus.

Figure 16.11. Transcription d'un opéron pour donner un ARNm polycistronique

Plusieurs gènes de structure sont situés côte à côte et sont transcrits en une seule longueur d'ARNm. Au cours de la traduction, plusieurs protéines, généralement fonctionnellement liées, sont fabriquées à l'aide de l'ARNm unique.

Les opérons sont des groupes de gènes contrôlés comme une unité.

Le modèle d'opéron pour réguler les gènes bactériens a été proposé pour la première fois par François Jacob et Jaques Monod en utilisant les gènes du lactose régulés négativement de E. coli par exemple. Depuis lors, un grand nombre de gènes bactériens, y compris ceux avec des activateurs ainsi que ceux avec des répresseurs, ont été adaptés à ce modèle ou à des variantes de celui-ci. Les opérons sont très rares chez les eucaryotes, mais existent ( Encadré 16.01 )). L'opéron lactose, comme de nombreux opérons bactériens, est contrôlé à deux niveaux. Réglementation spécifique fait référence à la régulation en réponse à des facteurs spécifiques à un opéron particulier, en l'occurrence la disponibilité du sucre lactose. Réglementation mondiale , discuté plus loin, est la régulation en réponse à des conditions plus générales, telles que l'approvisionnement global en carbone et en énergie de la cellule .

Comme indiqué précédemment, un opéron est un groupe de gènes transcrits à partir du même promoteur pour donner un seul ARNm portant plusieurs séquences codantes (ARNm polycistronique). Cependant, les eucaryotes ne traduisent que la première séquence codante sur un ARNm. Par conséquent, les eucaryotes ne peuvent pas utiliser l'ARNm polycistronique pour exprimer plusieurs gènes. Compte tenu de cette situation, on a longtemps supposé que les génomes eucaryotes ne contiendraient pas d'opérons.

Malgré cela, de véritables opérons (pas simplement des gènes regroupés) se trouvent dans quelques organismes eucaryotes, bien qu'ils soient rares. La plupart du temps, seuls quelques opérons sont présents dans un organisme donné. Par exemple, la mouche des fruits, Drosophile, a environ 30 opérons. Cependant, les eucaryotes occasionnels possèdent un nombre élevé d'opérons. L'exemple le plus connu est le ver, Caenorhabditis elegans, qui a environ 15 % de son génome (environ 2 600 gènes) d'environ 20 000 gènes regroupés en environ 1 000 opérons.

Le problème pour les eucaryotes est de savoir comment traiter l'ARNm polycistronique qui résulte de la transcription d'un opéron. Peut-être sans surprise, le trans-épissage de l'ARNm vient à la rescousse. (Pour plus de détails sur le trans-épissage, voir le chapitre 12, Traitement de l'ARN, section 6.4.) L'ARNm polycistronique est converti en un ensemble d'ARNm monocistroniques, un pour chaque séquence codante (Fig. 16.12). Une queue poly(A) est d'abord ajoutée à l'extrémité 3' de chaque séquence codante, ce qui entraîne une séparation de toutes les séquences codantes plus en aval. Une molécule d'ARN courte distincte fournit une séquence leader qui est trans-épissée devant chaque séquence codante (à l'exception de celle à l'extrémité 5' de l'opéron). Les introns sont épissés en même temps. Le mécanisme illustré pour C. elegans n'est pas universelle bien qu'elle soit probablement la plus courante. D'autres eucaryotes présentent parfois des variations dans la façon dont ils traitent l'ARN polycistronique.

Les lac L'opéron comprend des gènes pour l'absorption et le métabolisme du lactose.

Le lactose ou lac l'opéron se compose de trois gènes de structure, lacZ, de dentelle, et la CA, ainsi qu'une région régulatrice en amont ( Fig. 16.13 ). Les lacZ le gène de structure code -galactosidase , l'enzyme qui dégrade le lactose. Les de dentelle le gène code perméase de lactose (une protéine de transport) et la CA code pour la lactose acétylase, dont le rôle n'est pas connu (elle n'est pas nécessaire à la croissance sur lactose par E. coli). Les lac l'opéron est régulé par le LacI protéine répresseur, qui est codée par le lacI gène. Celui-ci se situe en amont de lacZYA et est transcrit dans le sens inverse.

Graphique 16.13 . Composantes du lac Opéron

Les lac l'opéron se compose de trois gènes de structure, lacZYA, tous transcrits à partir d'un seul promoteur, désigné lacP. Le promoteur est régulé par fixation du répresseur chez l'opérateur, lacO, et de la protéine Crp au site Crp. Notez qu'en réalité, l'opérateur chevauche en partie à la fois le promoteur et le gène de structure. Le seul lac L'ARNm est traduit pour produire les protéines LacZ, LacY et LacA. Les lacI gène qui code pour le répresseur LacI possède son propre promoteur et est transcrit dans le sens opposé au lacZYA opéron.

La région amont de la lac L'opéron contient une séquence de reconnaissance pour la protéine répresseur, connue sous le nom de opérateur (lacO dans la figure 16.13 ). Si aucun inducteur n'est présent, la protéine LacI se lie à l'opérateur. Cela bloque le mouvement de l'ARN polymérase au niveau du promoteur. Lorsque le lactose est présent, il induit la lac opéron. L'inducteur réel n'est pas le lactose lui-même, mais allo-lactose , un isomère du lactose qui est fabriqué à partir du lactose par la -galactosidase ( Encadré 16.02 ). AlloLe -lactose se lie au répresseur LacI, qui change de forme de sorte qu'il ne peut pas se lier à l'ADN. L'ARN polymérase est maintenant capable d'avancer à partir du promoteur et de transcrire le lac opéron ( Fig. 16.14 ). La protéine LacI existe sous forme de tétramère qui peut, en fait, lier trois sites de reconnaissance d'ADN différents dans la région du promoteur. Cela se traduira par une boucle de l'ADN - discuté plus tard. (Contrairement à de nombreuses protéines allostériques, la protéine LacI n'alterne pas entre les formes monomère et tétramère, mais existe sous forme de tétramère de stabilité inhabituelle dans toutes les conditions physiologiques.)

Graphique 16.14 . Règlement particulier du lac Opéron

Lorsque LacI se lie au site opérateur, aucune transcription n'a lieu. La présence de l'inducteur peut éliminer LacI de l'opérateur, permettant à l'ARN polymérase d'avancer et de transcrire l'opéron. L'inducteur peut être allo- le lactose, dérivé du lactose ou d'un composé artificiel, tel que l'IPTG.

L'IPTG est un inducteur artificiel de l'opéron lactose.

En laboratoire, le composé IPTG (isopropylthiogalactoside) est souvent utilisé pour induire la lac opéron ( Fig. 16.15 ). Ce composé artificiel est connu comme un inducteur gratuit car les produits des gènes qu'il induit ne le métabolisent pas. Dans ce cas particulier, bien que l'IPTG induise la lacZYA gènes, il n'est pas dégradé par la -galactosidase, l'enzyme qui dégrade le lactose. Par conséquent, l'IPTG continue d'induire la lac opéron à long terme, alors que les inducteurs naturels n'induisent que pendant une courte période avant d'être décomposés.

Graphique 16.15 . Lactose et dérivés de galactose apparentés

(A) L'enzyme β-galactosidase divise le lactose en galactose plus glucose. La β-galactosidase peut également interconvertir le lactose avec son isomère, allo-le lactose, qui est le véritable inducteur de la lac opéron. (B) Les structures de l'inducteur gratuit, IPTG, et du substrat naturel le plus probable pour la -galactosidase, le glycéryl-galactoside, sont également présentées.

L'opéron lactose n'est pas vraiment typique

Bien que les gènes de l'opéron lactose aient été les premiers dont la régulation a été caractérisée en détail, et bien qu'ils soient souvent cités comme exemple typique, ils sont aberrants à plusieurs égards. Curieusement, le lactose lui-même n'est pas l'inducteur. Le lactose, qui se compose de glucose lié au galactose, est converti en allo- le lactose, un isomère dans lequel les deux mêmes sucres sont liés différemment. Cette transformation est effectuée par la -galactosidase, qui sépare normalement le lactose, mais produit une petite quantité de allo-lactose comme réaction secondaire. Il est allo-lactose qui se lie réellement à la protéine LacI et agit comme un inducteur.

Le lactose est présent dans le lait consommé par les bébés et les enfants, mais l'alimentation des adultes en contient souvent très peu. De plus, le lactose est presque entièrement absorbé dans l'intestin grêle, donc dans la nature E. coli, qui vit dans le gros intestin, n'obtiendra jamais de lactose. En réalité, les gènes du lactose sont probablement destinés à digérer le glycéryl-galactoside, un composé issu de la dégradation des lipides des cellules animales. Celui-ci est libéré dans le gros intestin lorsque les cellules qui le tapissent se détachent et se désintègrent. Le glycéryl-galactoside est à la fois un véritable inducteur, qui se lie à la protéine LacI, et un substrat de la -galactosidase, qui la scinde en glycérol plus galactose.

De plus, le segment d'ADN contenant les gènes du lactose est absent de Salmonelle et plusieurs autres bactéries de la famille entérique qui sont des proches parents de E. coli. Il semble probable que ce segment d'ADN soit un nouveau venu dans le E. coli génome et provenait à l'origine d'une source extérieure aux bactéries entériques.

Quant à la lactose acétylase déroutante, elle peut être un mécanisme de protection au cas où le lactose ou d'autres galactosides s'accumuleraient à des niveaux dangereux. Les dérivés acétylés sont sélectivement excrétés par les mêmes perméases multirésistantes qui expulsent les autres molécules toxiques de la cellule.

Rétrospectivement, c'était à la fois fortuit et chanceux que Jacob et Monod aient choisi un gène plutôt anormal plutôt qu'un gène typique. Le règlement de la lac l'opéron est plus simple que celui de nombreux gènes qui sont plus pleinement intégrés dans le métabolisme central de E. coli.


Biologie 171

À la fin de cette section, vous serez en mesure d'effectuer les opérations suivantes :

  • Décrire les étapes impliquées dans la régulation des gènes procaryotes
  • Expliquer les rôles des activateurs, des inducteurs et des répresseurs dans la régulation des gènes

L'ADN des procaryotes est organisé en un chromosome circulaire, superenroulé dans la région nucléoïde du cytoplasme cellulaire. Les protéines nécessaires à une fonction spécifique ou impliquées dans la même voie biochimique sont codées ensemble dans des blocs appelés opérons. Par exemple, tous les gènes nécessaires pour utiliser le lactose comme source d'énergie sont codés les uns à côté des autres dans le lactose (ou lac) et transcrit en un seul ARNm.

Dans les cellules procaryotes, il existe trois types de molécules régulatrices qui peuvent affecter l'expression des opérons : les répresseurs, les activateurs et les inducteurs. Les répresseurs et les activateurs sont des protéines produites dans la cellule. Les répresseurs et les activateurs régulent l'expression des gènes en se liant à des sites d'ADN spécifiques adjacent aux gènes qu'ils contrôlent. En général, les activateurs se lient au site promoteur, tandis que les répresseurs se lient aux régions opérateur. Les répresseurs empêchent la transcription d'un gène en réponse à un stimulus externe, tandis que les activateurs augmentent la transcription d'un gène en réponse à un stimulus externe. Les inducteurs sont de petites molécules qui peuvent être produites par la cellule ou qui se trouvent dans l'environnement de la cellule. Les inducteurs activent ou répriment la transcription en fonction des besoins de la cellule et de la disponibilité du substrat.

Les trp Opéron : un opéron répressible

Des bactéries telles que Escherichia coli ont besoin d'acides aminés pour survivre et sont capables d'en synthétiser beaucoup. Le tryptophane est l'un de ces acides aminés qui E. coli peut soit ingérer à partir de l'environnement, soit synthétiser à l'aide d'enzymes codées par cinq gènes. Ces cinq gènes sont côte à côte dans ce qu'on appelle le tryptophane (trp) opéron ((Figure)). Les gènes sont transcrits en un seul ARNm, qui est ensuite traduit pour produire les cinq enzymes. Si le tryptophane est présent dans l'environnement, alors E. coli n'a pas besoin de le synthétiser et le trp l'opéron est désactivé. Cependant, lorsque la disponibilité du tryptophane est faible, le commutateur contrôlant l'opéron est activé, l'ARNm est transcrit, les protéines enzymatiques sont traduites et le tryptophane est synthétisé.


Les trp L'opéron comprend trois régions importantes : la région codante, la trp l'opérateur et le trp promoteur. La région codante comprend les gènes des cinq enzymes de biosynthèse du tryptophane. Juste avant la région codante se trouve le site de démarrage de la transcription. La séquence promotrice, à laquelle l'ARN polymérase se lie pour initier la transcription, est avant ou « en amont » du site de démarrage de la transcription. Entre le promoteur et le site d'initiation de la transcription se trouve la région de l'opérateur.

Les trp L'opérateur contient le code ADN auquel le trp la protéine répresseur peut se lier. Cependant, le répresseur seul ne peut pas se lier à l'opérateur. Lorsque le tryptophane est présent dans la cellule, deux molécules de tryptophane se lient au trp répresseur, qui change la forme de la protéine répresseur en une forme qui peut se lier au trp opérateur. La liaison du complexe tryptophane-répresseur au niveau de l'opérateur empêche physiquement l'ARN polymérase de se lier au promoteur et de transcrire les gènes en aval.

Lorsque le tryptophane n'est pas présent dans la cellule, le répresseur par lui-même ne se lie pas à l'opérateur, la polymérase peut transcrire les gènes enzymatiques et le tryptophane est synthétisé. Parce que la protéine répresseur se lie activement à l'opérateur pour maintenir les gènes éteints, le trp on dit que l'opéron est régulé négativement et les protéines qui se lient à l'opérateur pour faire taire trp expression sont des régulateurs négatifs.

Apprenez-en plus en regardant l'opéron Trp (vidéo).

Catabolite Activator Protein (CAP) : un activateur transcriptionnel

Tout comme le trp L'opéron est régulé négativement par les molécules de tryptophane, il existe des protéines qui se lient aux séquences promotrices qui agissent comme des régulateurs positifs pour activer les gènes et les activer. Par exemple, lorsque le glucose est rare, E. coli les bactéries peuvent se tourner vers d'autres sources de sucre comme combustible. Pour ce faire, de nouveaux gènes pour traiter ces sucres alternatifs doivent être transcrits. Lorsque les niveaux de glucose chutent, l'AMP cyclique (AMPc) commence à s'accumuler dans la cellule. La molécule d'AMPc est une molécule de signalisation qui est impliquée dans le métabolisme du glucose et de l'énergie dans E. coli. L'accumulation d'AMPc se lie à la protéine activatrice du catabolite régulateur positif (CAP), une protéine qui se lie aux promoteurs des opérons qui contrôlent le traitement des sucres alternatifs. Lorsque l'AMPc se lie au CAP, le complexe se lie alors à la région promotrice des gènes qui sont nécessaires pour utiliser les sources de sucre alternatives ((Figure)). Dans ces opérons, un site de liaison à la CAP est situé en amont du site de liaison à l'ARN-polymérase dans le promoteur. La liaison au CAP stabilise la liaison de l'ARN polymérase à la région promotrice et augmente la transcription des gènes codant pour les protéines associées.


Les lac Opéron : un opéron inductible

Le troisième type de régulation génique dans les cellules procaryotes se produit par opérons inductibles, qui ont des protéines qui se lient pour activer ou réprimer la transcription en fonction de l'environnement local et des besoins de la cellule. Les lac l'opéron est un opéron inductible typique. Comme mentionné précédemment, E. coli est capable d'utiliser d'autres sucres comme sources d'énergie lorsque les concentrations de glucose sont faibles. Une de ces sources de sucre est le lactose. Les lac L'opéron code les gènes nécessaires pour acquérir et traiter le lactose de l'environnement local. Le gène Z du lac L'opéron code pour la bêta-galactosidase, qui décompose le lactose en glucose et galactose.

Cependant, pour le lac pour activer l'opéron, deux conditions doivent être remplies. Premièrement, le niveau de glucose doit être très bas ou inexistant. Deuxièmement, le lactose doit être présent. Ce n'est que lorsque le glucose est absent et que le lactose est présent que le lac l'opéron soit transcrit ((Figure)). En l'absence de glucose, la liaison de la protéine CAP rend la transcription de la lac opéron plus efficace. Lorsque le lactose est présent, il se lie au lac répresseur et change de forme afin qu'il ne puisse pas se lier au lac opérateur pour empêcher la transcription. Cette combinaison de conditions est logique pour la cellule, car ce serait un gaspillage énergétique de synthétiser les enzymes pour traiter le lactose si le glucose était abondant ou si le lactose n'était pas disponible.


Question : Dans E. coli, les trp l'opéron est activé par défaut, tandis que le lac l'opéron est désactivé. Pourquoi pensez-vous que ce soit le cas?

Si du glucose est présent, alors CAP ne parvient pas à se lier à la séquence promotrice pour activer la transcription. Si le lactose est absent, le répresseur se lie à l'opérateur pour empêcher la transcription. Si l'une de ces conditions est remplie, la transcription reste désactivée. Ce n'est que lorsque le glucose est absent et que le lactose est présent que le lac opéron transcrit ((Figure)).

Signaux qui induisent ou répriment la transcription du lac Opéron
Glucose CAP lie Lactose Le répresseur se lie Transcription
+ + Non
+ + Certains
+ + Non
+ + Oui

Résumé de la section

La régulation de l'expression des gènes dans les cellules procaryotes se produit au niveau transcriptionnel. Il existe deux principaux types de protéines qui contrôlent la transcription procaryote : les répresseurs et les activateurs. Les répresseurs se lient à une région opérateur pour bloquer l'action de l'ARN polymérase. Les activateurs se lient au promoteur pour améliorer la liaison de l'ARN polymérase. Les molécules inductrices peuvent augmenter la transcription soit en inactivant les répresseurs, soit en activant les protéines activatrices. Dans le trp opéron, le trp le répresseur est lui-même activé en se liant au tryptophane. Par conséquent, si le tryptophane n'est pas nécessaire, le répresseur est lié à l'opérateur et la transcription reste désactivée. Les lac L'opéron est activé par la CAP (catabolite activator protein), qui se lie au promoteur pour stabiliser la liaison à l'ARN polymérase. Le CAP est lui-même activé par l'AMPc, dont la concentration augmente au fur et à mesure que la concentration de glucose diminue. Cependant, le lac l'opéron nécessite également la présence de lactose pour que la transcription se produise. Le lactose inactive le lac répresseur, et empêche la protéine répresseur de se lier au lac opérateur. Avec le répresseur inactivé, la transcription peut se poursuivre. Par conséquent, le glucose doit être absent et le lactose doit être présent pour une transcription efficace de la lac opéron.

Connexions artistiques

(Figure) Dans E. coli, les trp l'opéron est activé par défaut, tandis que le lac l'opéron est désactivé. Pourquoi pensez-vous que c'est le cas?

(Figure) Le tryptophane est un acide aminé essentiel à la fabrication des protéines, la cellule a donc toujours besoin d'en avoir sous la main. Cependant, si beaucoup de tryptophane est présent, c'est du gaspillage d'en faire plus, et l'expression de la trp récepteur est réprimé. Le lactose, un sucre présent dans le lait, n'est pas toujours disponible. Cela n'a aucun sens de fabriquer les enzymes nécessaires pour digérer une source d'énergie qui n'est pas disponible, donc le lac l'opéron n'est activé que lorsque du lactose est présent.

Réponse libre

Décrire comment la transcription dans les cellules procaryotes peut être altérée par une stimulation externe telle qu'un excès de lactose dans l'environnement.

Les stimuli environnementaux peuvent augmenter ou induire la transcription dans les cellules procaryotes. Dans cet exemple, le lactose dans l'environnement va induire la transcription de la lac opéron, mais seulement si le glucose n'est pas disponible dans l'environnement.

Quelle est la différence entre un opéron répressible et inductible ?

Un opéron répressible utilise une protéine liée à la région promotrice d'un gène pour maintenir le gène réprimé ou silencieux. Ce répresseur doit être activement éliminé afin de transcrire le gène. Un opéron inductible est soit activé soit réprimé en fonction des besoins de la cellule et de ce qui est disponible dans l'environnement local.

Glossaire


La structure de l'ARN

Il y a un deuxième acide nucléique dans toutes les cellules appelé acide ribonucléique, ou ARN. Comme l'ADN, l'ARN est un polymère de nucléotides. Each of the nucleotides in RNA is made up of a nitrogenous base, a five-carbon sugar, and a phosphate group. In the case of RNA, the five-carbon sugar is ribose, not deoxyribose. Ribose has a hydroxyl group at the 2' carbon, unlike deoxyribose, which has only a hydrogen atom (Figure 9.1.4).

Figure 9.1.4: The difference between the ribose found in RNA and the deoxyribose found in DNA is that ribose has a hydroxyl group at the 2' carbon.

RNA nucleotides contain the nitrogenous bases adenine, cytosine, and guanine. However, they do not contain thymine, which is instead replaced by uracil, symbolized by a &ldquoU.&rdquo RNA exists as a single-stranded molecule rather than a double-stranded helix. Molecular biologists have named several kinds of RNA on the basis of their function. These include messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA)&mdashmolecules that are involved in the production of proteins from the DNA code.


What is a Cistron?

Cistron is another term used to refer to a structural gene. Cistron is a section of DNA that carries genetic instruction to make a protein. Therefore, cistron encodes for a protein. Cistron transcribes into an mRNA and then translates into a protein. This two-step complex process is known as gene expression. The name “cistron” was given in early bacterial genetics since it was originally defined experimentally as a genetic complementation unit by using the cis/trans test. The term cistron was coined by Seymour Benzer.

Figure 02: Cistron

Prokaryotic operons are polycistronic. It means an operon has several cistrons or genes. A cistron has introns (noncoding sequences) and exons (coding sequences). The number of introns and number of exons, as well as the length of those sequences, vary among the genes. Hence, genes have different sizes. Moreover, genes have a unique position on a chromosome.


RESULTS AND DISCUSSION

Efficient fluorescent recognition of the parallel TBA quadruplex by ThT

We studied the interactions between ThT and TBA in the free state through UV, fluorescence, CD and molecular docking experiments, and the results indicated that ThT was capable of inducing TBA to form the parallel quadruplexes with strong enhancement in fluorescence in the absence of cations.

ThT dye displayed its characteristic absorption profile with maximum at 414 nm when diluted in pH 7.2 Tris-buffer (Supplementary Figure S1). Upon the addition of unfolded TBA, obvious bathochromic shifts (from 414 to 436 nm) and hyperchromic effects were observed, which were similar to the results of titration of TBA with human telomeric sequence 22AG ( 30). The strong binding between ThT and TBA was further studied by monitoring the fluorescence intensity of ThT (Figure 1a). When excited at the isosbestic points (∼420 nm), 5 μM ThT presented very weak emission at 487 nm in Tris-buffer, and a dramatic fluorescence enhancement was obtained after the increased addition of TBA (up to 1 μM), indicating the selective fluorescence recognition of TBA by ThT in the absence of cations.

(a) Fluorescence titration of ThT (5 μM) with various concentrations of TBA, λex = 420 nm. The arrow from bottom to top represents increments of TBA from 0 to 1 μM. (b) CD titration spectra of TBA (3 μM) with ThT in the absence of any metal ions. The arrow from bottom to top indicates increments in r value from 0 to 80. (r = [ThT]/[TBA]).

(a) Fluorescence titration of ThT (5 μM) with various concentrations of TBA, λex = 420 nm. The arrow from bottom to top represents increments of TBA from 0 to 1 μM. (b) CD titration spectra of TBA (3 μM) with ThT in the absence of any metal ions. The arrow from bottom to top indicates increments in r value from 0 to 80. (r = [ThT]/[TBA]).

The induced circular dichroism (ICD) spectra (Figure 1b) exhibited that unfolded TBA had weak positive bands around 255 and 285 nm, as well as weak trough near 265 nm in the absence of metal ions. Upon titration with ThT, a positive band at ∼265 nm as well as a negative band at ∼240 nm appeared gradually, indicating the formation of parallel G4 structures ( 43).

We further confirmed the formation of intermolecular parallel quadruplexes of TBA induced by ThT through FRET experiments (Supplementary Scheme S1). In this assay, Cy3 (λex = 544 nm, λem = 566 nm) and Cy5 (λex = 649 nm, λem = 667 nm) were used as the donor and acceptor fluorophores to label the 5′ terminus of TBA or TBA2G. When TBA folded into anti-parallel G-quadruplexes in the presence of K + , the two fluorophores, Cy3 and Cy5, were separated from each other. But when it folded into intermolecular parallel G-quadruplexes, it would be possible for the two fluorophores to be adjacent to each other and then carry out FRET.

We titrated the mixed solution of labeled TBA (Cy3-TBA: Cy5-TBA = 1:1) with ThT under the excitation of 544 nm light. Upon the addition of ThT, the emission maximum of Cy3 at 566 nm decreased, and the emission maximum of Cy5 at 667 nm increased simultaneously (Supplementary Figure S2a), which indicated the formation of intermolecular quadruplexes. The results of control experiments displayed that there was no increase at 667 nm when titrating the mixture of Cy3-TBA and Cy5-TBA with K + , which was due to the formation of parallel TBA quadruplexes (Supplementary Figure S2b). And ThT was also capable of quenching the fluorescence of Cy3, but did not increase the intensity of emission around 667 nm (Supplementary Figure S2c). Besides, as the modified sequence TBA2G has been reported to form the intermolecular parallel quadruplexes in the presence of K + ( 43), the phenomenon of FRET could also be observed when titrating the labeled TBA2G (Cy3-TBA2G: Cy5-TBA2G = 1:1) with K + (Supplementary Figure S2d). Therefore, it is reasonable for us to conclude that ThT was capable of inducing TBA to form intermolecular parallel quadruplexes.

Moreover, the extent of quadruplex stabilization in the presence of ThT was assessed from the melting temperature (Tm), which was evaluated from the CD heat-denaturation profiles. The melting curves of the parallel quadruplex were monitored at 265 nm. In the absence of metal ions, TBA was in the unfolded state and no stable structure could be monitored. When mixed with various equiv of ThT, TBA was induced to form a parallel quadruplex and became more stable with the increased addition of ThT. The melting curves of TBA (15, 30 and 45 μM, respectively) with various equiv of ThT (r = 10, 15, 20, 30 and 40, respectively) were shown in Supplementary Figure S3, and three fitting lines were obtained from plotting Tm against the concentration ratio ‘r’ (Supplementary Figure S3d), the simultaneous increase of TBA concentration and Tm confirmed the intermolecular character of G4 folding. Overall, these results indicated that ThT could induce TBA to fold into a parallel quadruplex in pH 7.2 Tris-buffer or lithium cacodylate buffer. For water solution, ThT could also induce TBA to form a parallel quadruplex ultimately with strong fluorescence emission (data were shown in Supplementary Figure S4). Therefore, it is reasonable to conclude that the selective fluorescent recognition of TBA by ThT was attributable to the strong interactions between ThT and the parallel TBA quadruplex.

We further examined the fluorescence intensity provided by the reaction of ThT with the anti-parallel TBA quadruplex, which had been reported to form in the presence of K + or Sr 2+ ( 41, 42). For both TBA alone and the mixture of TBA and ThT, a peak at ∼295 nm as well as a trough at ∼265 nm (anti-parallel folding) appeared with addition of K + (Supplementary Figure S5a and b), indicating that K + could not only induce TBA to form the anti-parallel conformation, but also transform the pre-folded parallel quadruplex into anti-parallel quadruplex. The fluorescence spectra displayed a remarkable decrease in the emission intensity with the increase of K + (Supplementary Figure S5c), which was believed to be due to the structure transition of TBA from the parallel to anti-parallel quadruplex. In this respect, ThT could be used as a specific fluorescence probe for the parallel TBA quadruplex.

Scheme 1 showed the results as mentioned above between the changes in ThT fluorescence and the structural conversion of TBA, which was mediated by the addition of Sr 2+ and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The ICD spectra results (Supplementary Figure S6) exhibited that Sr 2+ induced TBA to form the anti-parallel quadruplex with a peak at ∼300 nm and a trough at ∼275 nm, which was in agreement with the reported results ( 42). Meanwhile, the addition of EDTA would release pre-folded anti-parallel quadruplex through removing Sr 2+ from the folded structure. Therefore, ThT, Sr 2+ and EDTA were used to mediate the topological structure of TBA. When titrating the mixture of TBA and 50 equiv of ThT with Sr 2+ , a positive band at ∼300 nm appeared and grew gradually (Figure 2a), whereas the positive band near 275 nm decreased and became a negative band, indicating that Sr 2+ could also transform the pre-folded parallel quadruplex into the anti-parallel quadruplex, and then led to the dramatic decrease in the emission intensity of ThT (Figure 2b). However, when EDTA was subsequently added into this solution, the structure of the anti-parallel quadruplex was destroyed (Figure 2c) and the emission intensity of ThT recovered due to the regeneration of the parallel quadruplex (Figure 2d). Therefore, a cycling phenomenon could be obtained through adding Sr 2+ and EDTA alternately into the mixture of TBA and ThT, which was exhibited in Scheme 1 and Figure 2c and d.

(a) CD titration of TBA (3 μM) with various concentrations of Sr 2+ in the presence of ThT (150 μM). The arrows indicate increments in r′ value from 0 to 300. (r′ = [Sr 2+ ]/[TBA]). (b) Fluorescence titration of TBA (1 μM) and ThT (5 μM) with Sr 2+ . The arrow from top to bottom indicates the addition of Sr 2+ from 0 to 1 mM. The bottom black spectrum curve is the background signal of ThT. ??ex = 420 nm. (c and d) Cycling of the Sr 2+ -mediated structural conversion of TBA monitored by CD (c) and fluorescence (d) in the presence of ThT.

(a) CD titration of TBA (3 μM) with various concentrations of Sr 2+ in the presence of ThT (150 μM). The arrows indicate increments in r′ value from 0 to 300. (r′ = [Sr 2+ ]/[TBA]). (b) Fluorescence titration of TBA (1 μM) and ThT (5 μM) with Sr 2+ . The arrow from top to bottom indicates the addition of Sr 2+ from 0 to 1 mM. The bottom black spectrum curve is the background signal of ThT. ??ex = 420 nm. (c and d) Cycling of the Sr 2+ -mediated structural conversion of TBA monitored by CD (c) and fluorescence (d) in the presence of ThT.

Structural conversion between the parallel and anti-parallel TBA quadruplexes mediated by ThT and Sr 2+ . (a) ThT induces TBA to form the parallel quadruplex and produces strong fluorescence emission. (b) The transformation of the parallel quadruplex into anti-parallel quadruplex upon addition of Sr 2+ , along with a remarkable decrease in the emission intensity of ThT. (c) Regeneration of the parallel TBA quadruplex and the strong fluorescence signal by ThT upon the removal of Sr 2+ through EDTA.

Structural conversion between the parallel and anti-parallel TBA quadruplexes mediated by ThT and Sr 2+ . (a) ThT induces TBA to form the parallel quadruplex and produces strong fluorescence emission. (b) The transformation of the parallel quadruplex into anti-parallel quadruplex upon addition of Sr 2+ , along with a remarkable decrease in the emission intensity of ThT. (c) Regeneration of the parallel TBA quadruplex and the strong fluorescence signal by ThT upon the removal of Sr 2+ through EDTA.

Binding mechanism

The binding mechanism between ThT and the parallel or anti-parallel quadruplex of TBA were studied by ICD spectra and molecular docking simulation experiments to further explain the differences in ThT fluorescence intensity. As reported by Jyotirmayee Mohanty et al., when ThT bound to G4 DNAs, the binding mode between ThT and G4 could be analyzed from the absorption region of ThT (350 ∼ 500 nm) in ThT-TBA ICD spectra ( 30), that is, a positive ICD signal in the wavelength range of 350 ∼ 500 nm could be taken as an indicator of the groove binding to G4 structures ( 30, 50), while a negative ICD band in the same region could be presumed as an intercalation mode ( 51). In our study, when ThT was added to TBA solutions in the absence of cations, the ICD spectra (Figure 3a) displayed that in the formation of parallel quadruplex (seen from the region below 350 nm), a strong negative band around 415 nm as well as a weak positive band near 460 nm appeared in response to the addition of ThT, indicating that ThT bound to the parallel quadruplex of TBA mainly in the mode of intercalation, and then gave rise to much stronger emission enhancement. In another case, when titrating TBA with ThT in the presence of enough K + , the folded anti-parallel quadruplex of TBA kept unchanged (seen from the region below 350 nm of Figure 3b), whereas a moderate positive ICD band appeared around 450 nm, indicating a typical groove binding mode of ThT to the anti-parallel quadruplex structures.

CD spectra recorded for TBA (3 μM) upon addition of various concentrations of ThT in the absence (a) and presence (b) of K + (10 mM) in 10 mM Tris-buffer, pH 7.2. The arrows indicate increments in r value from 0 to 30. r = [ThT]/[TBA].

CD spectra recorded for TBA (3 μM) upon addition of various concentrations of ThT in the absence (a) and presence (b) of K + (10 mM) in 10 mM Tris-buffer, pH 7.2. The arrows indicate increments in r value from 0 to 30. r = [ThT]/[TBA].

As no information on the crystal structure of parallel TBA quadruplex could be obtained from PDB now, the molecular docking simulation was carried out to further understand the interactions between the chair-like intramolecular anti-parallel TBA quadruplex (PDB ID: 1HAO) and energetically optimized ThT, using the program suite Auto Dock 4.2.0 ( 52–54) and SYBYL. The binding mode with the lowest binding energy and the most favorable conformation (Figure 4a) showed that ThT bound to the anti-parallel quadruplex only in the groove region composed by G5, G6, G10 et G11 of TBA, with a strong hydrogen bond between G6 and the atom S of ThT (Figure 4b), which was in agreement with the results of ICD spectra.

The interactions between the anti-parallel quadruplex (PDB: 1HAO) and ThT (a and b) or NMM (c and d) visualized by molecular docking simulation. DNA and ThT are represented as cartoon sticks and spheres. C, gray N, blue S, yellow O, red. Green dotted lines represent the hydrogen bonding between bases and ThT/NMM, and yellow cylinders represent π∼π interactions between bases and NMM. (a) Side view of the anti-parallel TBA quadruplex with ThT. (b) The interactions of ThT with two quartets in the region of groove binding. (c) Side view of the anti-parallel TBA quadruplex with NMM. (d) The interaction of NMM with the bottom quartet as well as two T loops.

The interactions between the anti-parallel quadruplex (PDB: 1HAO) and ThT (a and b) or NMM (c and d) visualized by molecular docking simulation. DNA and ThT are represented as cartoon sticks and spheres. C, gray N, blue S, yellow O, red. Green dotted lines represent the hydrogen bonding between bases and ThT/NMM, and yellow cylinders represent π∼π interactions between bases and NMM. (a) Side view of the anti-parallel TBA quadruplex with ThT. (b) The interactions of ThT with two quartets in the region of groove binding. (c) Side view of the anti-parallel TBA quadruplex with NMM. (d) The interaction of NMM with the bottom quartet as well as two T loops.

As the fluorescence of ThT was strongly influenced by its conformational and electronic properties, and the changes in ThT emission intensity were mainly associated with the angle between the two conjugated aromatic rings of ThT, benzothiazole and dimethylaminobenzene ( 34–36). It is reasonable to presume that, compared with the groove binding mode, the intercalation mode was beneficial to immobilizing ThT at a right angle and preserve the excited state, resulting in the great emission enhancement.

Specific fluorescent recognition of the anti-parallel TBA quadruplex by NMM

In our work, we found that NMM displayed efficient fluorescent recognition of the anti-parallel TBA quadruplex, but did not show a high affinity with the parallel G4 conformation, which was folded in the presence of ThT alone. The results of ICD spectra and fluorescent titration experiments displayed that neither new ICD spectra of TBA nor emission enhancement of NMM could be observed when TBA reacted with NMM (Supplementary Figure S7a and b), indicating that NMM could not induce free TBA to form any kind of G4 in the absence of cations. However, when K + or Sr 2+ ions were subsequently added into the mixture of NMM and TBA, TBA was induced to form the anti-parallel quadruplex and then was recognized by NMM with great emission enhancement in the region of 600 ∼700 nm (Supplementary Figure S7c and d).

To gain further insight into the selective binding of NMM toward the anti-parallel TBA quadruplex, the molecular docking simulation was also used to dock energetically optimized NMM and the anti-parallel TBA quadruplex 1HAO. The most optimal binding mode (Figure 4c) demonstrated that NMM stacked at the bottom quartet of the anti-parallel TBA qudruplex in a non-planer form, and bound to the region of two T loops of G4. As displayed in Figure 4d, there were two hydrogen bonds between G5 or T3 and the carboxyl group of NMM, which was indicated by green dotted lines. Moreover, there were strong π∼π interactions between T4 or T13 and NMM ( 55), as well as weak π∼π interactions between NMM and G14 ( 56), which were indicated by yellow cylinders. In this case, it is judicious to presume that the efficient fluorescent recognition of the anti-parallel TBA quadruplex by NMM was mainly attributed to the binding of the two T loops. While in the parallel quadruplex of TBA, the two T loops were separated from each other, and thus made it hard for NMM to bind with the parallel G4.

The specificity of the two probes toward TBA quadruplexes with different topologies

The former study demonstrated that the emission enhancement of ThT or NMM was only obtained in the presence of responding parallel or anti-parallel TBA quadruplex, respectively. As ThT and NMM have close excitation peak wavelengths (420 nm for ThT and 399 nm for NMM), and well-separated emission wavelengths (487 nm for ThT and 610 nm for NMM), we mixed the two compounds together to evaluate their specificity toward the parallel or anti-parallel quadruplex, which was mediated by metal ions or thrombin. When the mixture of 5 μM ThT and 10 μM NMM were excited with light of 410 nm, the fluorescence spectra displayed a very weak emission profile around 487 nm as well as the region of 600 ∼ 700 nm for ThT and NMM, respectively (Figure 5). However, gradual addition of TBA (up to 4 μM) increased the fluorescence intensity of ThT, while had almost no effect on the emission intensity of NMM, which could be explained by the formation of the parallel TBA quadruplex induced by ThT and the strong affinity between them. Furthermore, when various concentrations of Sr 2+ or K + were subsequently added into this sample, the parallel quadruplex of TBA was transformed into the anti-parallel conformation, resulting in the decrease in ThT fluorescence intensity as well as great enhancement in NMM emission, due to the release of ThT and the binding of NMM to the anti-parallel TBA quadruplexes (Supplementary Figure S8).

Fluorescence spectra of the mixture of 5 μM ThT and 10 μM NMM upon titration with TBA. The arrow from bottom to top represents increments of TBA from 0 to 4 μM. (λex = 410 nm).


Voir la vidéo: La traduction partie 2: les particularités du code génétique redondance, codons stop,.. (Décembre 2021).