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Coup de grâce CRISPR-Cas9


Avec CRISPR-Cas9, j'ai effectué un knock-out ciblé d'une région d'ADN codant pour une certaine protéine (travaillant avec des leucocytes). Ma question est la suivante : combien de temps faut-il pour que cette protéine ne soit plus détectable (par exemple via une coloration de surface + une cytométrie en flux) après que l'ADN a été manipulé ? Ou en d'autres termes : à quelle fréquence la transcription, la traduction, etc. ont-elles lieu ?


Pour répondre à votre question plusieurs paramètres dont un doit être pris en compte.

Il existe deux principaux ensembles de paramètres : gène spécifique et spécifique à la lignée cellulaire.

Paramètres liés à votre gène d'intérêt spécifique :

  • Connaissez-vous la demi-vie de l'ARN de votre gène d'intérêt ? La plupart du temps, il n'est pas connu, mais il existe plusieurs outils et ressources qui peuvent le prédire en fonction de nombreuses caractéristiques différentes telles que les longueurs et la stabilité de 3'UTR, 5'UTR, le nombre d'introns d'exons, etc. Une autre indication est si il existe déjà des personnes qui ont soit réalisé une perturbation génétique (siRNA, CRISPR, etc.) soit un test de dégradation. Dans ce cas, vous pourrez peut-être deviner quelle est la demi-vie relative de l'ARN ou de la protéine.
  • Ce qui nous amène à la demi-vie de la protéine d'intérêt. Les protéines qui sont solubles ont généralement une demi-vie plus petite que les protéines membranaires (pas nécessairement vrai, il y a des exceptions). Par exemple, faire un knock-out fonctionnel complet d'un facteur de transcription pourrait être plus facile qu'un récepteur GPCR. S'il s'agit d'une protéine membranaire, dans quel organite se localise-t-elle ? L'organite recycle-t-il beaucoup la membrane ou la cellule se divise-t-elle ? Dans ce cas, vous pourriez avoir des chances que les protéines viables présentes avant la perturbation génétique soient diluées. Dans ces exemples, vous pouvez éliminer une protéine soluble en moins de 24 à 48 heures, alors qu'une protéine membranaire très stable peut prendre 7 à 10 jours.
  • Le nombre de copies d'ARN est important ainsi que le nombre lié aux ribosomes (moins important) et leur localisation dans la cellule (moins important)
  • L'abondance de la protéine en général.

Paramètres liés à votre lignée cellulaire d'intérêt :

  • La lignée de la lignée cellulaire que vous avez sélectionnée : différentes lignées cellulaires ont des taux de transcription et de traduction globaux différents.
  • Le taux de division de la lignée cellulaire (paramètre extrêmement important) : plus la lignée cellulaire se divisera rapidement, plus les copies d'ARNm qui n'ont pas été perturbées (type sauvage) et les protéines présentes avant la perturbation génétique seront diluées entre cellules filles.
  • Nombre de copies dans la lignée cellulaire : s'il existe plusieurs copies de votre gène d'intérêt, vous devrez vous assurer que chaque copie du gène a été perturbée pour conduire à un KO fonctionnel.
  • Stabilité génomique de la lignée cellulaire : certaines lignées cellulaires comme HeLa sont bien connues pour leur instabilité génomique où une grande partie du génome peut être réarrangée, des copies perturbées peuvent être corrigées à l'aide de copies viables

Enfin et surtout, cela dépend techniquement de la manière dont vous effectuez la perturbation génétique CRISPR-Cas9 : transfection du gRNA, électroporation du Cas9 avec le gRNA, livraison à médiation lentivirale, etc. Le temps que j'ai fourni est après que tous les composants ont été livrés et sont présents en grande quantité dans le noyau.

J'espère que ça aide !


Contenu

Les premières études en Caenorhabditis elegans [1] et Drosophila melanogaster [2] [3] ont vu des criblages à grande échelle et systématiques de perte de fonction (LOF) effectués par mutagenèse à saturation, démontrant le potentiel de cette approche pour caractériser les voies génétiques et identifier les gènes dotés de fonctions uniques et essentielles. La technique de mutagenèse par saturation a ensuite été appliquée à d'autres organismes, par exemple le poisson zèbre [4] [5] et les souris. [6] [7]

Des approches ciblées pour le knockdown de gènes ont émergé dans les années 1980 avec des techniques telles que la recombinaison homologue, [8] [9] les ribozymes trans-clivants, [10] [11] et les technologies antisens. [12] [13]

En l'an 2000, la technologie d'interférence ARN (ARNi) était devenue une technique rapide, simple et peu coûteuse pour la suppression ciblée de gènes, et était couramment utilisée pour étudier in vivo fonction des gènes dans C. elegans. [14] [15] [16] [17] En effet, en l'espace de quelques années seulement après sa découverte par le Feu et al. (1998), [18] presque tous les

19 000 gènes dans C. elegans avait été analysé à l'aide d'un knockdown basé sur l'ARNi. [19]

La production de bibliothèques d'ARNi a facilité l'application de cette technologie à l'échelle du génome, et les méthodes basées sur l'ARNi sont devenues l'approche prédominante pour les écrans knockdown à l'échelle du génome. [ citation requise ]

Néanmoins, les approches basées sur l'ARNi pour les écrans knockdown à l'échelle du génome ont leurs limites. D'une part, les effets hors cible élevés causent des problèmes d'observations faussement positives. [20] [21] De plus, parce que l'ARNi réduit l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel en ciblant l'ARN, les écrans basés sur l'ARNi n'entraînent qu'une suppression partielle et à court terme des gènes. Alors qu'un knock-down partiel peut être souhaitable dans certaines situations, une technologie avec une efficacité de ciblage améliorée et moins d'effets hors cible était nécessaire. [ citation requise ]

Depuis l'identification initiale en tant que système immunitaire adaptatif procaryote, [22] le système de répétitions palindromes courtes régulièrement espacées (CRISPR)/Cas9 bactérien de type II est devenu un outil simple et efficace pour générer des mutations LOF ciblées. [23] Il a été appliqué avec succès pour éditer des génomes humains et a commencé à remplacer l'ARNi comme outil dominant dans les études sur les mammifères. [24] Dans le contexte des écrans knock-out à l'échelle du génome, des études récentes ont démontré que les écrans CRISPR/Cas9 sont capables d'obtenir une déplétion protéique très efficace et complète et de surmonter les problèmes hors cible observés avec les écrans ARNi. [25] [26] En résumé, l'émergence récente de CRISPR-Cas9 a considérablement augmenté notre capacité à effectuer des écrans LOF à grande échelle. La polyvalence et la programmabilité de Cas9, associées au faible bruit, à l'efficacité de knock-out élevée et aux effets hors cible minimes, ont fait de CRISPR la plate-forme de choix pour de nombreux chercheurs engagés dans le ciblage et l'édition de gènes. [24] [27]

CRISPR/Cas9 Perte de fonction Modifier

Le système CRISPR/Cas9 de répétitions de palindromes courts régulièrement espacés en cluster est une technologie d'édition de gènes qui peut introduire des cassures double brin (DSB) à un locus génomique cible. En utilisant un seul ARN guide (sgRNA), l'endonucléase Cas9 peut être délivrée à une séquence d'ADN spécifique où elle clive la chaîne nucléotidique. [28] La spécificité du sgRNA est déterminée par une séquence de 20 nt, homologue au locus génomique d'intérêt, et la liaison à Cas9 est médiée par une région d'échafaudage constante du sgRNA. Le site cible souhaité doit être immédiatement suivi (5’ à 3’) par un motif adjacent de protospacer (PAM) conservé à 3 nucléotides. [29] [30] Afin de réparer les DSB, la cellule peut utiliser la jonction d'extrémité non homologue fortement sujette aux erreurs, ou la recombinaison homologue. En concevant des sgRNA appropriés, des insertions ou délétions planifiées peuvent être introduites dans le génome. Dans le contexte des criblages LOF à l'échelle du génome, l'objectif est de provoquer une perturbation et un knock-out de gènes. [ citation requise ]

Bibliothèques de sgRNA Modifier

Construire une bibliothèque Modifier

Pour effectuer des knock-outs CRISPR à l'échelle du génome, des collections de sgRNA connues sous le nom de bibliothèques de sgRNA, ou bibliothèques de knock-out CRISPR, doivent être générées. La première étape de la création d'une bibliothèque d'ARNsg consiste à identifier les régions génomiques d'intérêt sur la base de règles de ciblage d'ARNsg connues. [31] Par exemple, les sgRNA sont les plus efficaces pour cibler les régions codantes des gènes et non les UTR 5' et 3'. Les exons conservés sont des cibles attractives et la position par rapport au site de démarrage de la transcription doit être prise en compte. [31] Deuxièmement, tous les sites PAM possibles sont identifiés et sélectionnés. [31] L'activité sur et hors cible doit être analysée, tout comme la teneur en GC, et les étirements d'homopolymère doivent être évités. [31] L'endonucléase Cas9 la plus couramment utilisée, dérivée de Streptocoque pyogène, reconnaît une séquence PAM de NGG. [32]

De plus, des nucléotides spécifiques semblent être favorisés à des emplacements spécifiques. La guanine est fortement favorisée par rapport à la cytosine en position 20 juste à côté du motif PAM, et en position 16, la cytosine est préférée à la guanine. [33] Pour le nucléotide variable dans le motif NGG PAM, il a été montré que la cytosine est préférée et la thymine défavorisée. [33] Avec de tels critères pris en compte, la bibliothèque sgRNA est conçue informatiquement autour des sites PAM sélectionnés. [31] [33] [34]

Plusieurs sgRNA (au moins 4-6) doivent être créés contre chaque gène pour limiter la détection de faux positifs, et des sgRNA de contrôle négatif sans cible connue doivent être inclus. [31] [33] Les sgRNA sont ensuite créés par in situ synthèse, amplifié par PCR, et cloné dans un système de livraison de vecteur.

Bibliothèques existantes Modifier

Le développement d'une nouvelle bibliothèque de sgRNA est un processus laborieux et chronophage. En pratique, les chercheurs peuvent sélectionner une bibliothèque existante en fonction de leur objectif expérimental et des lignées cellulaires d'intérêt. En février 2020, les ressources les plus largement utilisées pour les écrans knock-out CRISPR à l'échelle du génome étaient les deux bibliothèques Genome-Scale CRISPR Knock-Out (GeCKO) créées par le laboratoire Zhang. [35] Disponibles via addgene, ces bibliothèques lentivirales ciblent respectivement les exons humains et de souris, et les deux sont disponibles sous forme de système à un vecteur (où les sgRNA et Cas9 sont présents sur le même plasmide) ou en tant que système à deux vecteurs (où le sgRNAs et Cas9 sont présents sur des plasmides séparés). Chaque bibliothèque est livrée sous forme de deux demi-bibliothèques, permettant aux chercheurs de cribler avec 3 ou 6 sgRNA/gène. [36]

Outre GeCKO, un certain nombre d'autres bibliothèques CRISPR ont été générées et mises à disposition via addgene. Les laboratoires Sabatini & Lander disposent actuellement de 7 bibliothèques distinctes pour l'homme et la souris, y compris des sous-bibliothèques ciblées pour des sous-groupes distincts tels que les kinases et les gènes ribosomiques (Addgene #51043-51048). En outre, des améliorations de la spécificité des ARNsg ont abouti à des bibliothèques de « deuxième génération », telles que les bibliothèques Brie (Addgene #73632) et Brunello (Addgene #73178) générées par les laboratoires Doench et Root, et la bibliothèque Toronto knockout (TKO). (Addgene #1000000069) généré par le laboratoire Moffat. [36]

Vecteurs lentiviraux Modifier

Le knock-out de gène ciblé à l'aide de CRISPR/Cas9 nécessite l'utilisation d'un système d'administration pour introduire le sgRNA et le Cas9 dans la cellule. Bien qu'un certain nombre de systèmes d'administration différents soient potentiellement disponibles pour CRISPR, [37] [38] les criblages de perte de fonction à l'échelle du génome sont principalement effectués à l'aide de vecteurs lentiviraux de troisième génération. [35] [39] [40] Ces vecteurs lentiviraux sont capables de transduire efficacement une large gamme de types de cellules et de s'intégrer de manière stable dans le génome des cellules en division et non en division. [41] [42] Les particules lentivirales de troisième génération sont produites en co-transfectant des cellules rénales embryonnaires humaines (HEK) 293T avec :

  1. deux plasmides d'encapsidation, l'un codant pour Rev et l'autre Gag et Pol
  2. un plasmide d'enveloppe interchangeable qui code pour une glycoprotéine d'enveloppe d'un autre virus (le plus souvent la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G))
  3. un ou deux (selon la bibliothèque appliquée) plasmides de transfert, codant pour Cas9 et sgRNA, ainsi que des marqueurs de sélection. [35][43][44]

Le surnageant contenant des particules lentivirales est récolté, concentré et ensuite utilisé pour infecter les cellules cibles. [45] Le protocole exact pour la production de lentiviraux variera en fonction du but de la recherche et de la bibliothèque appliquée. [35] [43] [44] Si un système à deux vecteurs est utilisé, par exemple, les cellules sont séquentiellement transduites avec Cas9 et sgRNA dans une procédure en deux étapes. [35] [44] Bien que plus complexe, cela a l'avantage d'un titre plus élevé pour le virus de la bibliothèque sgRNA. [35]

Sélection phénotypique Modifier

En général, il existe deux formats différents d'écrans knock-out CRISPR à l'échelle du génome : en réseau et en pool. Dans un écran en réseau, chaque puits contient un sgRNA spécifique et connu ciblant un gène spécifique. [46] Étant donné que le sgRNA responsable de chaque phénotype est connu en fonction de l'emplacement du puits, les phénotypes peuvent être identifiés et analysés sans nécessiter de séquençage génétique. Ce format permet la mesure de phénotypes cellulaires plus spécifiques, peut-être par fluorescence ou luminescence, et permet aux chercheurs d'utiliser plus de types de bibliothèques et de méthodes de livraison. [46] Pour les écrans LOF à grande échelle, cependant, les formats en réseau sont considérés comme peu efficaces et coûteux en termes de ressources financières et matérielles, car les populations cellulaires doivent être isolées et cultivées individuellement. [46]

Dans un criblage groupé, les cellules cultivées dans un seul récipient sont transduites en masse avec des vecteurs viraux contenant collectivement l'ensemble de la bibliothèque sgRNA. Pour s'assurer que la quantité de cellules infectées par plus d'une particule contenant du sgRNA est limitée, une faible multiplicité d'infection (MOI) (généralement 0,3-0,6) est utilisée. [46] [47] Les preuves jusqu'à présent ont suggéré que chaque sgRNA devrait être représenté dans un minimum de 200 cellules. [48] ​​[23] Les cellules transduites seront sélectionnées, suivies d'une sélection positive ou négative pour le phénotype d'intérêt, et le séquençage génétique sera nécessaire pour identifier les sgRNA intégrés. [46]

Séquençage de nouvelle génération et analyse des hits Modifier

Suite à la sélection phénotypique, l'ADN génomique est extrait des clones sélectionnés, aux côtés d'une population de cellules témoins. [23] [46] [49] Dans les protocoles les plus courants pour les knock-outs à l'échelle du génome, une « bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) » est créée par une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en deux étapes. [23] [46] La première étape amplifie la région sgRNA, en utilisant des amorces spécifiques à la séquence d'intégration lentivirale, et la deuxième étape ajoute les séquences Illumina i5 et i7. [23] Le NGS des produits PCR permet d'identifier les sgRNA récupérés, et une étape de quantification peut être utilisée pour déterminer l'abondance relative de chaque sgRNA. [23]

La dernière étape du criblage consiste à évaluer par ordinateur les sgRNA significativement enrichis ou appauvris, à les retracer jusqu'à leurs gènes correspondants et à déterminer à leur tour quels gènes et quelles voies pourraient être responsables du phénotype observé. Plusieurs algorithmes sont actuellement disponibles à cette fin, le plus populaire étant la méthode d'analyse basée sur le modèle de la méthode CRISPR/Cas9 Knockout (MAGeCK) à l'échelle du génome. [50] Développé spécifiquement pour les écrans knock-out CRISPR/Cas9 en 2014, MAGeCK a démontré de meilleures performances par rapport aux algorithmes alternatifs de l'époque, [50] et a depuis démontré des résultats robustes et une sensibilité élevée dans différentes conditions expérimentales. [51] À partir de 2015, l'algorithme MAGeCK a été étendu pour introduire des mesures de contrôle de la qualité et tenir compte de l'efficacité de knock-out des sgRNA auparavant négligée. [51] Un outil de visualisation basé sur le Web (VISPR) a également été intégré, permettant aux utilisateurs d'explorer de manière interactive les résultats, l'analyse et les contrôles de qualité. [51]

Mécanismes de signalisation cellulaire Modifier

Au cours des dernières années, l'écran CRISPR à l'échelle du génome est devenu un outil puissant pour étudier les réseaux complexes de signalisation cellulaire. [52] La signalisation cellulaire est essentielle pour un certain nombre de processus biologiques fondamentaux, y compris la croissance cellulaire, la prolifération, la différenciation et l'apoptose.

Un exemple pratique est l'identification des gènes requis pour la signalisation proliférative dans les cellules cancéreuses. Les cellules sont transduites avec une banque d'ARNsg CRISPR et étudiées pour leur croissance dans le temps. En comparant l'abondance d'ARNsg dans des cellules sélectionnées à un contrôle, on peut identifier quels ARNsg sont épuisés et à leur tour quels gènes peuvent être responsables du défaut de prolifération. De tels criblages ont été utilisés pour identifier les gènes essentiels au cancer dans la leucémie myéloïde aiguë [53] et le neuroblastome, [54] et pour décrire les différences spécifiques aux tumeurs entre les lignées cellulaires cancéreuses. [55]

Identifier les partenaires mortels synthétiques Modifier

Les thérapies ciblées contre le cancer sont conçues pour cibler des gènes, des protéines ou des environnements spécifiques contribuant à la croissance ou à la survie des cellules tumorales. Après une période de traitement prolongé avec ces thérapies, cependant, les cellules tumorales peuvent développer une résistance. Bien que les mécanismes à l'origine de la résistance aux médicaments anticancéreux soient mal compris, les causes potentielles incluent : l'altération de la cible, la dégradation des médicaments, l'échappement de l'apoptose et les altérations épigénétiques. [56] La résistance est bien connue et pose un sérieux problème dans la gestion du cancer. [ citation requise ]

Pour surmonter ce problème, un partenaire létal synthétique peut être identifié. Les cribles LOF à l'échelle du génome utilisant CRISPR-Cas9 peuvent être utilisés pour rechercher des partenaires létaux synthétiques. [57] Pour cela, une lignée cellulaire de type sauvage et une lignée cellulaire tumorale contenant la mutation provoquant la résistance sont transduites avec une bibliothèque d'ARNsg CRISPR. Les deux lignées cellulaires sont cultivées et toutes les cellules sous-représentées ou mortes sont analysées pour identifier les gènes partenaires létaux synthétiques potentiels. Une étude récente de Hinze et al. (2019) [58] ont utilisé cette méthode pour identifier une interaction létale synthétique entre le médicament de chimiothérapie asparaginase et deux gènes de la voie de signalisation Wnt NKD2 et LGR6.

Facteurs de dépendance de l'hôte pour l'infection virale Modifier

En raison de leur petit génome et de leur nombre limité de protéines codées, les virus exploitent les protéines hôtes pour l'entrée, la réplication et la transmission. L'identification de telles protéines hôtes, également appelées facteurs de dépendance à l'hôte (HDF), est particulièrement importante pour identifier des cibles thérapeutiques. Au cours des dernières années, de nombreux groupes ont utilisé avec succès CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome comme stratégie de dépistage des HDF dans les infections virales. [59]

Un exemple est fourni par Marceau et al. (2017), [60] qui visaient à disséquer les facteurs de l'hôte associés à l'infection de la dengue et de l'hépatite C (VHC) (deux virus de la famille Flaviviridae). ELAVL1, une protéine de liaison à l'ARN codée par le gène ELAVL1, s'est avérée être un récepteur critique pour l'entrée du VHC, et une divergence remarquable dans les facteurs de dépendance à l'hôte a été démontrée entre les deux flaviviridae. [60]

Autres applications Modifier

D'autres applications rapportées des criblages CRISPR à l'échelle du génome comprennent l'étude de : métabolisme mitochondrial, [61] résistance aux toxines bactériennes, [62] facteurs génétiques des métastases, [63] résistance aux médicaments contre le cancer, [64] mort cellulaire induite par le virus du Nil occidental, [65] et les réseaux de gènes des cellules immunitaires. [66] [67]

Cette section traitera spécifiquement des écrans CRISPR à l'échelle du génome. Pour un examen des limites de CRISPR, voir Lino et al. (2018) [38]

La bibliothèque sgRNA Modifier

Les écrans CRISPR à l'échelle du génome seront finalement limités par les propriétés de la bibliothèque de sgRNA choisie. Chaque bibliothèque contiendra un ensemble différent de sgRNA, et la couverture moyenne par gène peut varier.Les bibliothèques actuellement disponibles ont tendance à être biaisées vers les ARNsg ciblant les exons codant pour les protéines précoces (5'), plutôt que ceux ciblant les domaines protéiques plus fonctionnels. [58] Ce problème a été mis en évidence par Hinze et al. (2019), [58] qui ont noté que les gènes associés à la sensibilité à l'asparaginase n'ont pas réussi à marquer dans leur criblage à l'échelle du génome des cellules leucémiques résistantes à l'asparaginase.

Si une bibliothèque appropriée n'est pas disponible, la création et l'amplification d'une nouvelle bibliothèque sgRNA est un processus long qui peut prendre plusieurs mois. Les défis potentiels incluent : (i) une conception efficace des sgRNA (ii) assurer une couverture complète des sgRNA dans tout le génome (iii) la conception du squelette du vecteur lentiviral (iv) produire des quantités suffisantes de lentivirus de haute qualité (v) surmonter une faible efficacité de transformation (vi) une mise à l'échelle appropriée de la culture bactérienne. [68]

Maintien de la couverture sgRNA cellulaire Modifier

L'un des plus grands obstacles au criblage CRISPR à l'échelle du génome est d'assurer une couverture adéquate de la bibliothèque de sgRNA à travers la population cellulaire. [23] Jusqu'à présent, les preuves ont suggéré que chaque sgRNA devrait être représenté et maintenu dans un minimum de 200 à 300 cellules. [23] [48]

Considérant que le protocole standard utilise une multiplicité d'infection de

0,3, et une efficacité de transduction de 30 à 40 % [44] [23] le nombre de cellules nécessaires pour produire et maintenir une couverture appropriée devient très important. A titre d'exemple, la bibliothèque de sgRNA humain la plus populaire est la bibliothèque GeCKO v2 créée par le laboratoire Zhang [30] elle contient 123 411 sgRNA. Les études utilisant cette bibliothèque transduisent couramment plus de 1x10 8 cellules [58] [59] [69]

Comme CRISPR continue de présenter un faible bruit et des effets hors cible minimes, une stratégie alternative consiste à réduire le nombre de sgRNA par gène pour un criblage primaire. Des seuils moins stricts sont utilisés pour la sélection des hits, et des sgRNA supplémentaires sont ensuite utilisés dans un criblage secondaire plus spécifique. Cette approche est démontrée par Doench et al. (2016), [33] qui ont constaté que >92% des gènes récupérés à l'aide du protocole standard ont également été récupérés en utilisant moins d'ARNsg par gène. Ils suggèrent que cette stratégie pourrait être utile dans les études où la mise à l'échelle est d'un coût prohibitif. [ citation requise ]

Limitations lentivirales Modifier

Les vecteurs lentiviraux ont certaines limitations générales. D'une part, il est impossible de contrôler où le génome viral s'intègre dans le génome hôte, et cela peut affecter des fonctions importantes de la cellule. Vannucci et al. [70] fournissent une excellente revue des vecteurs viraux ainsi que de leurs avantages et inconvénients généraux. Dans le contexte spécifique des criblages CRISPR à l'échelle du génome, la production et la transduction des particules lentivirales est relativement laborieuse et prend du temps, prenant environ deux semaines au total. [44] De plus, parce que l'ADN s'intègre dans le génome de l'hôte, la livraison lentivirale conduit à une expression à long terme de Cas9, conduisant potentiellement à des effets hors cible. [ citation requise ]

Écrans en réseau ou en pool Modifier

Dans un écran en réseau, chaque puits contient un sgRNA spécifique et connu ciblant un gène spécifique. Les écrans en réseau permettent donc un profilage détaillé d'une seule cellule, mais sont limités par les coûts élevés et le travail requis pour isoler et cultiver le nombre élevé de populations de cellules individuelles. [46] Les écrans CRISPR groupés conventionnels sont relativement simples et rentables à réaliser, mais sont limités à l'étude de la population cellulaire entière. Cela signifie que les phénotypes rares peuvent être plus difficiles à identifier, et seuls les phénotypes bruts peuvent être sélectionnés pour, par ex. la survie cellulaire, la prolifération ou l'expression du gène rapporteur. [ citation requise ]

Médias culturels Modifier

Le choix du milieu de culture peut affecter la pertinence physiologique des résultats des expériences de culture cellulaire en raison des différences dans la composition et les concentrations en nutriments. [71] Un biais systématique dans les ensembles de données générés a été récemment montré pour les écrans de silençage des gènes CRISPR et ARNi (en particulier pour les gènes métaboliques), [72] et pour le profilage métabolique des lignées cellulaires cancéreuses. [71] Par exemple, une plus forte dépendance à l'ASNS (asparagine synthétase) a été trouvée dans les lignées cellulaires cultivées en DMEM, qui manque d'asparagine, par rapport aux lignées cellulaires cultivées en RPMI ou F12 (contenant de l'asparagine). [72] Éviter un tel biais pourrait être réalisé en utilisant un milieu uniforme pour toutes les lignées cellulaires criblées, et idéalement, en utilisant un milieu de croissance qui représente mieux les niveaux physiologiques de nutriments. Récemment, des types de milieux tels que Plasmax [73] et Human Plasma Like Medium (HPLM), [74] ont été développés.

CRISPR + RNA-seq à cellule unique Modifier

Les technologies émergentes visent à combiner des écrans CRISPR groupés avec la résolution détaillée du séquençage d'ARN monocellulaire massivement parallèle (RNA-seq). Des études utilisant « CRISP-seq », [75] « CROP-seq », [76] et « PERTURB-seq » [77] ont démontré des lectures génomiques riches, identifiant avec précision les signatures d'expression génique pour les knock-outs de gènes individuels dans un pool complexe de cellules . Ces méthodes ont l'avantage supplémentaire de produire des profils transcriptionnels des cellules induites par le sgRNA. [ citation requise ]


Résultats

Génération d'allèles conditionnels pour Mecp2 gène utilisant la méthode de floxing à deux donneurs

Nous avons tenté de reproduire une expérience ciblant le Mecp2 gène, le locus pour lequel la création d'allèles floxés par la méthode de floxing à deux donneurs était efficace à 16 % [11]. Nous avons utilisé les mêmes sgRNA et ssODN décrits dans le rapport original [11]. Trois centres indépendants de l'Université nationale australienne (ANU) en Australie, du Centre médical de l'Université du Nebraska (UNMC) aux États-Unis et du Centre tchèque de phénogénomique en République tchèque (IMG) ont réalisé ces expériences sur des souris consanguines C57BL/6N. Les zygotes micro-injectés ont été cultivés en blastocystes, et les ADN génomiques ont été analysés par génotypage PCR et séquençage Sanger (tableau 1). En utilisant un mélange de concentration de 10 ng/μl d'ARNm Cas9, 10 ng/μl d'ARNsg transcrit in vitro et 10 ng/μl de ssODN, nous n'avons observé aucun ciblage réussi (c'est-à-dire l'insertion correcte de deux LoxP sites dans cis-configuration) même si les deux ARNsg ont clivé l'ADN cible, comme indiqué par la présence de indels ou l'intégration d'un LoxP site à l'emplacement souhaité, qui variait de 13 à 33 % (tableau 1).

Fait intéressant, nous avons noté la présence occasionnelle de mutations dans le LoxP sites indiquant des événements de réparation illégitimes sur le site cible ou des erreurs résultant des ADN donneurs synthétisés commercialement. La fréquence de ciblage réussi de deux LoxP des sites en cis était auparavant de 16 % [11], que nous n'avons pas réussi à reproduire.

Une enquête mondiale sur la génération d'allèles conditionnels par la méthode de floxing à deux donneurs

Pour mieux évaluer l'efficacité de la méthode de floxing à deux donneurs sur d'autres loci, nous avons évalué 56 loci supplémentaires dans le génome de la souris d'un consortium de 20 institutions en Australie, en Belgique, au Japon, aux États-Unis, au Royaume-Uni, en République tchèque et au Canada. (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Cette étude n'a pas été préconçue, mais constitue plutôt des données d'expériences réalisées dans de nombreux laboratoires qui ont tenté d'utiliser la méthode de floxing à deux donneurs pour générer des modèles de souris cKO. Il est à noter, parce que les conditions expérimentales décrites dans la méthode originale ne produisaient pas des efficacités souhaitables, les laboratoires de notre consortium ont encore modifié les conditions expérimentales dans le but d'augmenter son efficacité. Nous rapportons une compilation de ces données provenant de ces laboratoires et, par conséquent, cela représente naturellement une « situation du monde réel » car elle constitue de nombreuses caractéristiques diverses qui n'étaient pas pré-planifiées. Par conséquent, cet ensemble de données a permis d'étudier l'effet de nombreux paramètres différents sur l'efficacité de la méthode.

Les données de floxing à deux donneurs du consortium ont été recueillies par le biais d'une enquête au cours de laquelle les enquêteurs ont été invités à saisir les détails de divers paramètres des expériences dans un fichier Excel. Pour une présentation facile du grand ensemble de données, nous avons divisé les informations de la feuille de calcul unique en 3 feuilles de calcul plus petites. Ces données et les résultats sont présentés sous Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1, Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2 et Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3, et le résumé global des résultats est présenté dans Fichier supplémentaire 4 : Tableau S4. Sur 17 887 zygotes (17 557 micro-injectés et 330 électroporés voir détails ci-dessous), 12 764 (71,4 %) ont été transférés chirurgicalement à des femelles receveuses. Les femelles receveuses ont donné naissance à 1718 petits (9,6 % des zygotes micro-injectés/électroporés), dont seulement 15 petits (0,87 %) contenaient les allèles floxés.

Analyse des facteurs affectant le résultat de la méthode de floxing à deux donneurs

Ce grand ensemble de données nous a permis d'analyser les différents facteurs affectant le résultat de la méthode de floxing à deux donneurs. Ces facteurs comprenaient différentes souches de souris, la nature des loci (gènes essentiels vs non essentiels), la distance entre les deux guides, différents modes d'administration (microinjection ou électroporation), différents formats de réactifs, différentes concentrations de réactifs et des différences dans les pratiques de test des guides ( certains laboratoires pré-testent les ARN guides, d'autres non). Une majorité de projets ont été réalisés sur un fond C57BL/6J (39) alors que 18 projets utilisaient un fond C57BL/6N et 3 autres utilisaient un fond souris hybride (B6C3HF1, B6SJLF1, FVBCD1F1). Analyse statistique de nos données (test exact de Fisher, p = 0,74) n'a trouvé aucun impact du bruit de fond sur l'efficacité de la méthode. Sur les 56 loci ciblés (49 micro-injectés et 7 électroporés), 21 ont été classés comme gènes essentiels sur la base de la létalité embryonnaire précoce ou postnatale des souris knock-out homozygotes selon la base de données du génome de la souris http://www.informatics.jax.org [12] . Il a été rapporté que des suppressions ciblées antérieures de 18 des 56 loci généraient des souris homozygotes viables jusqu'à l'âge adulte, et les conséquences d'une mutation nulle sur 17 loci étaient inconnues. Ensemble, cela indique que la répartition entre le gène ciblé putatif essentiel et non essentiel était à fréquence égale (test exact de Fisher, p = 0,76). En utilisant une méthode d'apprentissage automatique publiée précédemment pour prédire l'essentialité des gènes chez la souris [13], nous avons confirmé une fréquence égale de gènes essentiels et non essentiels dans notre ensemble de données (test exact de Fisher, p = 0,99) La distance entre sgRNA variait de 250 pb à 1,1 Mb avec une médiane de 2 Kb. Des exons uniques à des gènes entiers ou à des régions génomiques régulatrices (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1) ont été floxés. Nous avons cherché à savoir si la distance entre sgRNA est critique pour la probabilité du succès de la méthode de floxing à deux donneurs. Nous n'avons pas réussi à trouver de telles preuves dans notre ensemble de données (test de la somme des rangs de Kruskal-Wallis, chi-carré = 32, p = 0,42), bien que la taille de l'échantillon soit trop faible pour tirer une conclusion (taille de l'effet de Cohen = 0,40 avec puissance 1-bêta = 0,27). Sur les 56 loci, 49 loci ont été micro-injectés (Fichier complémentaire 2 : Tableau S2) et 7 loci ont été électroporés (Fichier complémentaire 3 : Tableaux S3). Parmi les zygotes micro-injectés pour 49 loci avec 53 conceptions indépendantes, un nombre significativement plus élevé de zygotes a été micro-injecté dans le pronucleus seul (26/53) plutôt que dans le cytoplasme seul (10/53) ou à la fois pronucleus et cytoplasme (17/53) (Fischer essai exact p = 0,004), ce qui est cohérent avec la pratique actuelle dans la plupart des centres transgéniques (Fig. 2a). Différentes formes de réactifs CRISPR (ARNsg synthétique ou transcrit in vitro, ARNm Cas9 ou protéine Cas9, ou plasmide exprimant sgRNA et Cas9) ont été utilisées (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). La majorité des projets ont utilisé des ARNm transcrits in vitro (35/59) à différentes concentrations variant de 10 à 100 ng/μl d'ARNm Cas9 (Fig. 2b) et de 10 à 50 ng/μl d'ARNsg. Les ssODN ont été délivrés à une concentration variant de 10 à 200 ng/μl. Dans 18 cas, Cas9 a été délivré sous forme de protéine avec une concentration variant de 10 à 75 ng/μl. Soixante-sept pour cent (41 paires sur 61 paires) d'ARNsg ont été testés dans un essai de clivage in vitro avant l'injection zygotique. Nous n'avons trouvé aucune différence dans l'efficacité d'édition entre les ensembles sgRNA testés et non testés [guides 5′ : test de Kruskal-Wallis rank-sum, chi-carré = 0,004, p = 0.94 3′ guides : test de Kruskal-Wallis rank-sum, chi-carré = 0,2, p = 0,65]. Fait intéressant, pour 6 loci, Cas9 et sgRNA ont été délivrés sous la forme d'un plasmide chimérique sgRNA-SpCas9 (pX330) à une concentration de 5 ng/μl. Nous avons cherché à déterminer si les formes d'administration de réactifs telles que le plasmide, la ribonucléoprotéine (RNP) ou l'ARNm auraient un effet sur l'efficacité globale du ciblage à l'aide de la méthode de floxing à deux donneurs. Nous n'avons pas réussi à trouver de telles preuves (test exact de Fisher p = 1).

Évaluation quantitative du succès de la méthode de floxing à deux donneurs. une Méthode d'injections de zygotes (pronucléaires, cytoplasmiques ou les deux) pour l'administration des réactifs CRISPR utilisés par les centres déclarants. Les nombres indiquent le pourcentage du total des zygotes micro-injectés ou électroporés. b Forme des réactifs CRISPR (ARNm, protéine ou plasmide) délivrés aux zygotes. Les chiffres indiquent les pourcentages. c Nombre d'allèles édités avec succès et corrects LoxP insertions sur le nombre total de petits nés vivants de zygotes micro-injectés et transférés. Les nombres indiquent des nombres absolus. Types d'édition observés parmi les chiots nés vivants génotypés à partir d'un sous-échantillon de 25 loci. Les chiffres indiquent des valeurs absolues

Récemment, l'électroporation des zygotes a été développée comme une méthode efficace pour générer des KO, des mutations ponctuelles, des allèles étiquetés ou conditionnels [14,15,16,17,18,19,20]. De notre consortium, trois laboratoires et programmes ont étudié la probabilité de succès de la méthode. Pour sept loci enquêtés, nous avons noté le succès de l'insertion d'un seul LoxP allèle (Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3) issu de l'analyse de blastocystes ou de souris vivantes pour deux des sept loci. En revanche, nous avons noté une fréquence relativement élevée de grandes délétions et indels (jusqu'à 39% de suppressions importantes) indiquant une édition réussie. Cependant, aucun des loci n'a montré deux LoxP sites insérés dans cis chez la progéniture, ce qui suggère que l'administration de réactifs CRISPR par électroporation ne fait pas de différence statistique dans l'obtention du résultat souhaité de l'approche de floxing à deux donneurs, bien que le grand nombre d'embryons pouvant être manipulés permette la récupération d'un très petit nombre d'allèles correctement ciblés.

Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que le succès de la génération d'allèles floxés à l'aide de l'approche de floxing à deux donneurs peut dépendre de facteurs tels que (i) l'efficacité du sgRNA, (ii) la simultanéité dans LoxP l'insertion, ou (iii) la concentration des réactifs Cas9, sgRNA et ssODN. Pour mieux comprendre ces possibilités, nous avons analysé plus en détail les données des 56 loci (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2, Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3). A noter que les descendants de 54 loci ont été analysés au stade postnatal (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2, Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3) alors que 2 loci ont été analysés au stade blastocyste (Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3). Dans certains cas, les loci ont été analysés plus avant pour évaluer l'activité de clivage du guide. Sur les 1684 souris fondatrices, 676 (40 %) ont effectué des événements d'édition. Deux cent soixante-treize souris (16 %) ont montré un certain type d'édition (indels et/ou des substitutions), et 225 (13 %) et 180 (11 %) souris hébergeaient un seul LoxP insertion ou délétions entre les deux sites de clivage, respectivement (Fig. 2c). Les souris pour 25/56 loci ont été davantage évaluées pour des événements d'édition supplémentaires, y compris de grandes délétions (Fig. 2c). Sur les 487 souris fondatrices analysées (à partir de ces 25 loci), 219 (45%) 203 (41%), 52 (10,7%)% et (13) 2,7% échantillons ne contenaient aucune édition, indels, Célibataire LoxP insertions ou de grandes délétions, respectivement (Fig. 2d). Sur les 1684 animaux analysés, seules 15 souris (0,87 %) ont été correctement ciblées avec des LoxP sites dans le cis-configuration (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2). Sur les 56 loci, seuls 11 loci ont été ciblés avec succès (19,6 %). Le nombre moyen de zygotes nécessaires pour générer 1 animal correctement ciblé était de 1192. L'essentialité des gènes n'a eu aucun impact sur la probabilité de succès du floxing à deux donneurs (succès sur 4/23 dans le ciblage de la létalité embryonnaire ou postnatale vs 5/18 pour les souris homozygotes viables et 2/15 pour une létalité embryonnaire ou postnatale inconnue, test exact de Fisher p = 0,27). Nous avons également noté à partir de nos données, parmi les 56 loci analysés, 14% ont montré des suppressions entre les 2 sites cibles pour le clivage Cas9. Nous avons également noté une occurrence relativement élevée de LoxP insertions pour > 20% des souris génotypées (de tous les loci) et quelques cas de trans-LoxP insertions (sur différents allèles, réduisant la probabilité d'insertion correcte de la LoxP sites) (Fig. 3). Nous avons donc émis l'hypothèse que le succès de cette approche dépend de l'efficacité combinée du sgRNA et de la probabilité de LoxP insertion sur les deux sites pour permettre deux en cis Les événements HDR se produisent simultanément. Pour évaluer ce postulat, nous avons effectué une analyse de régression linéaire généralisée pour modéliser la relation entre Cas9, la concentration de sgRNA, l'efficacité de clivage de sgRNA, la distance entre LoxP les insertions et la fréquence des LoxP insertions, avec le succès de la méthode de floxing à deux donneurs comme un résultat positif. Les analyses sont résumées dans le tableau 2. L'efficacité des LoxP les insertions aux sites 5' et 3' semblent être le meilleur prédicteur de la probabilité de succès de la méthode de floxing à deux donneurs, représentant plus de 80 % de la variance totale. Cependant, ce prédicteur n'était pas significatif dans notre modèle de régression linéaire. Prédicteurs supplémentaires tels que l'efficacité du sgRNA ou l'efficacité dans l'insertion 5' ou 3' de LoxP expliquaient environ 15 % de la variance totale, mais aucun de ces prédicteurs n'était significatif dans notre modèle. La concentration d'ARNm Cas9 représentait moins de 0,1 % de la variance totale mais était statistiquement significative (p < 0,01) dans le modèle de régression linéaire généralisée comme prédicteur du succès de la méthode de floxing à deux donneurs. Cependant, le succès de la méthode de floxing à deux donneurs était marginalement corrélé avec une augmentation de la concentration d'ARNm Cas9 (r 2 Pearson = 0,27, p = 0,08). D'après notre analyse, la taille de l'échantillon des LoxP insertions dans cis était trop petit pour exclure définitivement tout autre prédicteur (taille de l'effet de Cohen = 0,4, puissance 1-bêta = 0,41). Nous avons pensé que l'analyse des seuls loci où LoxP des événements d'insertion ont été observés peuvent mieux prédire la probabilité de succès de cette approche (même si ces insertions n'étaient pas en cis-configurations). Pour tester cela, nous avons effectué une analyse statistique uniquement sur les loci contenant LoxP sites et exclu les loci manquant LoxP des insertions dans l'un ou l'autre des sites de clivage du guide.Nous avons identifié 28 de ces loci (sur un total de 56 loci). Nous n'avons trouvé aucune différence dans la prédiction du résultat par rapport à l'analyse précédente avec tous les loci (données non présentées). Ensemble, ces résultats suggèrent que la présence de deux événements de recombinaison simultanés semblait être le meilleur prédicteur pour générer deux allèles floxés dans cis bien qu'une concentration plus élevée d'ARNm de Cas9 semble être un autre prédicteur, son effet était marginal.

Résultats souhaités et non souhaités de la méthode de floxing à deux donneurs. un F Locus de type sauvage montrant les exons 3, 4 et 5 d'un gène hypothétique où l'exon 4 est choisi comme exon cible pour l'insertion LoxP des sites. une Résultat souhaité montrant un allèle floxé. La fréquence globale était de < 1%. bF Divers résultats indésirables dont un seul LoxP insertion de site (b), seul indels créé sur un ou les deux sites (c), combinaison de LoxP insertion et indels (), délétion entre les deux sites de clivage (e), et non indel ou aucun événement d'insertion (F)

Pour déterminer davantage si des facteurs tels que la composition en nucléotides du ssODN du donneur, la longueur du ssODN ou la concentration de réactifs pourraient expliquer le succès de cette approche, nous avons appliqué un algorithme d'apprentissage automatique (forêts aléatoires) sur tous les loci correctement ou incorrectement ciblés [21 ]. Validation croisée du modèle d'apprentissage automatique par bootstrapping agrégation (alias « out-of-bag error »), nous n'avons trouvé aucune association entre le succès de cette approche et la concentration des réactifs (p valeur = 0,84), 5′ et 3′ longueur du donneur ssODN (respectivement p valeurs de 0,21 et 0,18) ou les compositions nucléotidiques au site cible. Dans l'ensemble, nous avons observé une faible performance du modèle lors de l'inclusion de la longueur du donneur ssODN, de la composition nucléotidique sur le site cible et de la concentration des réactifs avec une «valeur d'estimation hors sac» à 0,222. En résumé, l'évaluation de la régression combinée à l'analyse de l'apprentissage automatique n'a pas permis d'identifier clairement les facteurs spécifiques contribuant à l'inefficacité de la méthode de floxing à deux donneurs.

Effet du facteur de compétence en microinjection sur le résultat de la méthode de floxing à deux donneurs

Parce que la microinjection est l'une des étapes les plus critiques dans les expériences d'édition du génome de souris, nous avons postulé que l'efficacité de cette méthode pourrait dépendre des compétences du personnel technique qui effectue la microinjection. Si la compétence influence le résultat (par exemple, les allèles floxing réussis), nous serions en mesure de déterminer une différence entre les laboratoires. Nous avons évalué ce paramètre en calculant la corrélation entre le laboratoire comme valeur prédictive et le résultat positif (allèles floxés réussis). Nous n'avons trouvé aucune preuve d'un effet de « compétence » influençant le résultat positif (test de la somme des rangs de Kruskal-Wallis, chi carré = 22, p = 0.16).

En tant qu'analyse indépendante de l'effet des compétences en microinjection, nous avons rassemblé un autre type de grand ensemble de données (création de modèles knockin à l'aide d'un donneur one-ssODN) de notre consortium qui a évalué les compétences en microinjection du personnel technique de notre consortium. Les 20 laboratoires qui ont participé à cette étude (dont le laboratoire de l'ANU qui n'a testé que les Mecp2 locus) a eu un taux de réussite de près de 90 % dans la génération de modèles knockin de donneur one-ssODN 293 des 330 loci tentés ont réussi avec une efficacité globale de 13 % des souris nées vivantes portant les allèles knockin souhaités (Fichier supplémentaire 5 : tableau S5) , suggérant que tous les laboratoires qui ont participé à l'étude avaient des compétences suffisantes en micro-injection pour créer des modèles à l'aide de l'outil CRISPR. Par conséquent, le manque de succès dans la génération d'allèles floxés en utilisant la méthode de floxing à deux donneurs dans les 20 laboratoires participants n'était pas dû au manque de compétences techniques en zygote-microinjection de réactifs CRISPR.

Évaluation de l'efficacité d'autres méthodes de génération d'allèles conditionnels

Ces dernières années, quelques autres méthodes de génération d'allèles conditionnels ont été décrites en utilisant de l'ADN à un seul donneur, telles que Facilité-CRISPR (additions efficaces avec ssDNA inserts-CRISPR) ou CLICK (CRISPR avec lssDNA inducing cKO alleles) ou méthodes basées sur l'ADN double brin (dsDNA) [17, 22, 23]. Nous avons émis l'hypothèse que l'une des raisons de la moindre efficacité de la méthode de floxing à deux donneurs pourrait être qu'elle nécessite deux événements de recombinaison (chacun d'entre eux étant indépendamment soumis à des événements mutationnels) alors qu'un seul événement de recombinaison est suffisant pour « un seul donneur d'ADN. « méthodes. Pour tester ce postulat, nous avons utilisé la méthode de l'ADN à un donneur pour générer un allèle conditionnel dans plusieurs loci qui a initialement échoué à l'aide de la méthode de floxing à deux donneurs. Sur les 61 projets de ciblage indépendants (pour 56 loci), 48 projets ont échoué avec la méthode à deux donateurs. Neuf de ces projets ont ensuite été répétés en utilisant de longues approches de donneurs d'ADN simple brin (4 avec Facile-méthode CRISPR, 5 avec la méthode CLICK), 2 projets avec la méthode du donneur dsDNA et 1 projet avec le ciblage traditionnel des cellules ES. Remarquablement, toutes les méthodes à donneur unique ont conduit à une génération réussie des allèles floxés (Fichier supplémentaire 6 : Tableau S6). Sur les 11 projets utilisant les méthodes Easi-CRISPR, CLICK ou dsDNA, nous avons constaté que le taux de réussite moyen était de 18,3 % ± 13 % avec une médiane de 13,2 %, ce qui correspond à une amélioration moyenne de 20 fois par rapport à la méthode de floxing à deux donneurs. (test de Kolmogorov-Smirnov p valeur < 10 -5 ). Nous avons examiné si ce taux de réussite moyen de 18,3 % pouvait être dû à une efficacité de clivage plus élevée des sgRNA. Notre analyse des efficacités de clivage des guides 5' et 3' (en comptant l'indel ou LoxP événements d'insertion) indique que ce n'est pas le cas (Mann-Whitney U tester avec un respectif p valeur de 0,43 et 1 suggère que la différence d'efficacité d'édition n'est pas la raison de cet écart de taux de réussite entre ces méthodes).

Une explication possible de la grande différence d'efficacité entre la méthode de floxing à deux donneurs et celles qui utilisent l'ADN à un donneur est que cette dernière ne nécessite qu'un seul événement de recombinaison alors que la méthode de floxing à deux donneurs repose sur deux événements de recombinaison se produisant dans cis. Si cette hypothèse est vraie, on devrait observer une différence de fréquence d'insertion simultanée dans les sites 3' et 5' entre ces méthodes. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons comparé la fréquence des insertions simultanées de LoxP sites en 3′ et 5′ pour l'administration d'Easi-CRISPR, CLICK ou dsDNA et la méthode de floxage à deux donneurs, et a effectivement trouvé une différence (6 ± 20 % de floxage à deux donneurs vs 76 ± 27 % pour les autres méthodes Mann-Whitney U test W = 1, p valeur = 4,7 × 10 −5 ) confirmant notre hypothèse.

Deux modifications de la méthode de floxing à deux donneurs ont été signalées récemment. La première modification implique l'insertion de la seconde LoxP site via une seconde injection de réactifs dans les zygotes issus des lignées de souris de la première injection contenant un seul des deux LoxP insertions [24]. Nous appelons cette méthode « deuxième LoxP insertion dans la prochaine génération. La deuxième modification consiste à introduire LoxP sites à deux intervalles distincts chez les mêmes zygotes, le premier au stade 1 cellule et le second au stade 2 cellules [25]. Nous appelons cette méthode « la livraison séquentielle de LoxP des sites." Nous avons testé 7 projets (sur les 48 ayant échoué) en utilisant le « deuxième LoxP insertion dans la prochaine génération » (Fichier supplémentaire 6 : Tableau S6), et tous ont abouti à la génération réussie d'allèles floxés. Nous avons trouvé 14 ± 6 % et 27 ± 32 % d'efficacité, respectivement, dans le premier et le deuxième LoxP expériences d'insertion, qui indiquent que la fréquence de recombinaison est beaucoup plus élevée lors de l'insertion d'un seul LoxP est traité comme un événement distinct. En d'autres termes, les efficacités des événements d'insertion « un seul donneur » (événements individuels) sont significativement plus élevées que l'efficacité combinée de l'insertion de deux donneurs. Même si cette approche prend près d'un an, la méthode génère finalement des allèles floxés avec une efficacité équivalente aux «approches à un seul donneur» telles que Easi-CRISPR, CLICK ou la délivrance d'ADNdb. Nous avons également testé « l'approche de livraison séquentielle », la deuxième modification de la méthode de floxing à deux donneurs introduite ci-dessus, sur trois nouveaux loci, mais aucun n'a produit d'allèles conditionnels (Fichier supplémentaire 7 : Tableau S7). Nous notons que nous n'avons testé que le mode de livraison par microinjection pour évaluer l'approche de livraison séquentielle. Considérant que l'électroporation est considérée comme une approche moins sévère (car elle maintient une quantité suffisamment raisonnable de viabilité des zygotes après les deux séries consécutives d'introduction de réactif), nous suggérons que cette méthode peut nécessiter une évaluation plus approfondie à des loci supplémentaires pour tirer une conclusion sur son efficacité.


Remerciements

Nous remercions O. Shalem, D.A. Scott et P.D. Hsu pour les discussions et les idées utiles R. Belliveau pour le soutien global à la recherche R. Macrae pour la lecture critique du manuscrit et l'ensemble du laboratoire Zhang pour le soutien et les conseils. O.O.A. a été soutenu par une bourse Paul et Daisy Soros, une bourse Friends of the McGovern Institute et le Poitras Center for Affective Disorders. J.S.G. a été soutenu par une bourse d'études supérieures en sciences informatiques du DOE. F.Z. a été soutenu par le NIH via le National Institute of Mental Health (NIMH accorde 5DP1-MH100706 et 1R01-MH110049), la National Science Foundation (NSF), le Howard Hughes Medical Institute (HHMI), la New York Stem Cell Foundation, les Simons Foundation, la Fondation de la famille Paul G. Allen et la Fondation Vallée, et James et Patricia Poitras, Robert Metcalfe et David Cheng. F.Z. est un chercheur de la New York Stem Cell Foundation-Robertson. Les réactifs sont disponibles via les forums de support Addgene et les outils de calcul sont disponibles via le site Web du laboratoire Zhang (http://www.genome-engineering.org).


Contenu

Séquences répétées Modifier

La découverte de répétitions d'ADN groupées s'est produite indépendamment dans trois parties du monde. La première description de ce qui sera plus tard appelé CRISPR est celle du chercheur de l'Université d'Osaka Yoshizumi Ishino et de ses collègues en 1987. Ils ont accidentellement cloné une partie d'une séquence CRISPR avec le "gène iap" (conversion isozymique de la phosphatase alcaline) du génome de Escherichia coli [14] [15] qui était leur cible. L'organisation des reprises était inhabituelle. Les séquences répétées sont généralement arrangées consécutivement, sans séquences différentes intercalées. [15] [11] Ils ne connaissaient pas la fonction des répétitions groupées interrompues.

En 1993, des chercheurs de Mycobacterium tuberculosis aux Pays-Bas ont publié deux articles sur un groupe de répétitions directes interrompues (DR) dans cette bactérie. Ils ont reconnu la diversité des séquences qui intervenaient les répétitions directes entre les différentes souches de M. tuberculose [16] et a utilisé cette propriété pour concevoir une méthode de typage nommée spoligotypage, qui est encore utilisé aujourd'hui. [17] [18]

Francisco Mojica à l'Université d'Alicante en Espagne a étudié les répétitions observées dans les organismes archéens de Haloferax et Haloarcula espèces et leur fonction. Le superviseur de Mojica a supposé à l'époque que les répétitions groupées avaient un rôle dans la ségrégation correcte de l'ADN répliqué dans les cellules filles pendant la division cellulaire, car les plasmides et les chromosomes avec des matrices de répétition identiques ne pouvaient pas coexister dans Haloferax volcanii. La transcription des répétitions interrompues a également été notée pour la première fois, il s'agissait de la première caractérisation complète de CRISPR. [18] [19] En 2000, Mojica a effectué une étude de la littérature scientifique et un de ses étudiants a effectué une recherche dans les génomes publiés avec un programme conçu par lui-même. Ils ont identifié des répétitions interrompues dans 20 espèces de microbes comme appartenant à la même famille. [20] En 2001, Mojica et Ruud Jansen, qui cherchaient des répétitions interrompues supplémentaires, ont proposé l'acronyme CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) pour atténuer la confusion résultant des nombreux acronymes utilisés pour décrire les séquences dans la littérature scientifique. [19] [21] En 2002, Tang et al. a montré que les régions répétées CRISPR du génome de Archaeoglobus fulgidus ont été transcrits en longues molécules d'ARN qui ont ensuite été transformées en petits ARN de longueur unitaire, plus quelques formes plus longues de 2, 3 ou plus unités de répétition d'espacement. [22] [23]

En 2005, Rodolphe Barrangou, chercheur en yaourt, a découvert que Streptocoque thermophilus, après des épreuves phagiques itératives, développe une résistance accrue aux phages, et cette résistance accrue est due à l'incorporation de séquences d'espacement CRISPR supplémentaires. [24] L'entreprise alimentaire danoise Danisco, pour laquelle Barrangou travaillait à l'époque, a ensuite développé une résistance aux phages S. thermophilus souches destinées à la production de yaourt. Danisco a ensuite été racheté par DuPont, qui « détient environ 50 pour cent du marché mondial de la culture laitière » et la technologie s'est généralisée. [25]

Systèmes associés à CRISPR Modifier

Un ajout majeur à la compréhension de CRISPR est venu avec l'observation de Jansen que le groupe de répétitions procaryotes était accompagné d'un ensemble de gènes homologues qui constituent les systèmes associés à CRISPR ou cas gènes. Quatre cas gènes (cas 1 à 4) ont été initialement reconnus. Les protéines Cas présentaient des motifs hélicase et nucléase, suggérant un rôle dans la structure dynamique des loci CRISPR. [26] Dans cette publication, l'acronyme CRISPR a été utilisé comme nom universel de ce modèle. Cependant, la fonction CRISPR restait énigmatique.

En 2005, trois groupes de recherche indépendants ont montré que certains espaceurs CRISPR sont dérivés d'ADN de phage et d'ADN extrachromosomique tels que des plasmides. [30] [31] [32] En effet, les espaceurs sont des fragments d'ADN recueillis à partir de virus qui ont précédemment tenté d'attaquer la cellule. La source des espaceurs était un signe que le CRISPR/cas pourrait avoir un rôle dans l'immunité adaptative chez les bactéries. [27] [33] Les trois études proposant cette idée ont d'abord été rejetées par des revues de haut niveau, mais sont finalement apparues dans d'autres revues. [34]

La première publication [31] proposant un rôle de CRISPR-Cas dans l'immunité microbienne, par Mojica et des collaborateurs de l'Université d'Alicante, a prédit un rôle pour le transcrit ARN des espaceurs sur la reconnaissance de cibles dans un mécanisme qui pourrait être analogue à l'interférence ARN système utilisé par les cellules eucaryotes. Koonin et ses collègues ont étendu cette hypothèse d'interférence ARN en proposant des mécanismes d'action pour les différents sous-types de CRISPR-Cas en fonction de la fonction prédite de leurs protéines. [35]

Les travaux expérimentaux de plusieurs groupes ont révélé les mécanismes de base de l'immunité CRISPR-Cas. En 2007, la première preuve expérimentale que CRISPR était un système immunitaire adaptatif a été publiée. [11] [4] Une région CRISPR en Streptocoque thermophilus des espaceurs acquis à partir de l'ADN d'un bactériophage infectant. Les chercheurs ont manipulé la résistance de S. thermophilus à différents types de phages en ajoutant et en supprimant des espaceurs dont la séquence correspond à celles trouvées dans les phages testés. [36] [37] En 2008, Brouns et Van der Oost ont identifié un complexe de protéines Cas (appelé Cascade) qui dans E. coli couper le précurseur d'ARN CRISPR dans les répétitions en molécules d'ARN matures contenant un espaceur appelées ARN CRISPR (crRNA), qui sont restées liées au complexe protéique. [38] De plus, il a été constaté que Cascade, crRNA et une hélicase/nucléase (Cas3) étaient nécessaires pour fournir à un hôte bactérien une immunité contre l'infection par un virus à ADN. En concevant un CRISPR anti-virus, ils ont démontré que deux orientations du crRNA (sens/antisens) procuraient une immunité, indiquant que les guides crRNA ciblaient l'ADNdb. Cette année-là, Marraffini et Sontheimer ont confirmé qu'une séquence CRISPR de S. epidermidis l'ADN ciblé et non l'ARN pour empêcher la conjugaison. Cette découverte était en contradiction avec le mécanisme proposé de type ARN-interférence de l'immunité CRISPR-Cas, bien qu'un système CRISPR-Cas qui cible l'ARN étranger ait été trouvé plus tard dans Pyrococcus furiosus. [11] [36] Une étude de 2010 a montré que CRISPR-Cas coupe à la fois les brins d'ADN de phage et de plasmide dans S. thermophilus. [39]

Cas9 Modifier

Les chercheurs ont étudié un système CRISPR plus simple de Streptocoque pyogène qui repose sur la protéine Cas9. L'endonucléase Cas9 est un système à quatre composants qui comprend deux petites molécules : l'ARNcr et l'ARN CRISPR trans-activant (tracrRNA). [40] [41] Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier ont réorganisé l'endonucléase Cas9 en un système à deux composants plus gérable en fusionnant les deux molécules d'ARN en un « ARN à guide unique » qui, lorsqu'il est combiné avec Cas9, pourrait trouver et couper l'ADN cible spécifié par l'ARN guide. Cette contribution était si importante qu'elle a été reconnue par le prix Nobel de chimie en 2020. En manipulant la séquence nucléotidique de l'ARN guide, le système artificiel Cas9 pourrait être programmé pour cibler n'importe quelle séquence d'ADN pour le clivage. [42] Un autre groupe de collaborateurs comprenant Virginijus Šikšnys avec Gasiūnas, Barrangou et Horvath a montré que Cas9 de la S. thermophilus Le système CRISPR peut également être reprogrammé pour cibler un site de son choix en modifiant la séquence de son ARNcr. Ces avancées ont alimenté les efforts pour éditer les génomes avec le système CRISPR-Cas9 modifié. [18]

Des groupes dirigés par Feng Zhang et George Church ont publié simultanément pour la première fois des descriptions de l'édition du génome dans des cultures de cellules humaines à l'aide de CRISPR-Cas9. [11] [43] [44] Il a depuis été utilisé dans un large éventail d'organismes, y compris la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae), [45] [46] [47] le pathogène opportuniste Candida albicans, [48] [49] poisson zèbre (Danio rerio), [50] mouches des fruits (Drosophila melanogaster), [51] [52] fourmis (Saltator Harpegnathos [53] et Ooceraea biroi [54] ), les moustiques (Aedes aegypti [55] ), nématodes (Caenorhabditis elegans), [56] plantes, [57] souris, [58] [59] singes [60] et embryons humains. [61]

CRISPR a été modifié pour créer des facteurs de transcription programmables qui permettent aux scientifiques de cibler et d'activer ou de faire taire des gènes spécifiques. [62]

Le système CRISPR-Cas9 a montré qu'il effectuait des modifications génétiques efficaces dans les zygotes tripronucléaires humains décrits pour la première fois dans un article de 2015 par les scientifiques chinois P. Liang et Y. Xu. Le système a réussi le clivage de la bêta-hémoglobine mutante (HBB) dans 28 des 54 embryons. 4 des 28 embryons ont été recombinés avec succès à l'aide d'un modèle de donneur fourni par les scientifiques. Les scientifiques ont montré que lors de la recombinaison de l'ADN du brin clivé, la séquence endogène homologue HBD entre en compétition avec la matrice du donneur exogène. La réparation de l'ADN dans les embryons humains est beaucoup plus compliquée et particulière que dans les cellules souches dérivées. [63]

Cas12a (anciennement Cpf1) Modifier

En 2015, la nucléase Cas12a (anciennement connue sous le nom de Cpf1 [64] ) a été caractérisée dans le système CRISPR/Cpf1 de la bactérie Francisella novicida. [65] [66] Son nom d'origine, issu d'une définition de famille de protéines TIGRFAMs construite en 2012, reflète la prévalence de son sous-type CRISPR-Cas dans le Prévotella et Francisella lignées. Cas12a a montré plusieurs différences clés par rapport à Cas9, notamment : provoquer une coupe « décalée » dans l'ADN double brin par opposition à la coupe « émoussée » produite par Cas9, en s'appuyant sur un PAM « riche en T » (fournissant des sites de ciblage alternatifs à Cas9) et ne nécessitant que un ARN CRISPR (crRNA) pour un ciblage réussi. En revanche, Cas9 nécessite à la fois un ARNcr et un ARNc transactivant (tracrRNA).

Ces différences peuvent donner à Cas12a des avantages par rapport à Cas9. Par exemple, les petits ARNr de Cas12a sont idéaux pour l'édition de génomes multiplexés, car plus d'entre eux peuvent être emballés dans un seul vecteur que les sgRNA de Cas9. De plus, les surplombs collants de 5' laissés par Cas12a peuvent être utilisés pour l'assemblage d'ADN qui est beaucoup plus spécifique à la cible que le clonage traditionnel par enzyme de restriction. [67] Enfin, Cas12a clive l'ADN de 18 à 23 paires de bases en aval du site PAM. Cela signifie qu'il n'y a pas de perturbation de la séquence de reconnaissance après réparation, et donc Cas12a permet plusieurs cycles de clivage de l'ADN. En revanche, étant donné que Cas9 ne coupe que 3 paires de bases en amont du site PAM, la voie NHEJ entraîne des mutations indel qui détruisent la séquence de reconnaissance, empêchant ainsi d'autres cycles de coupe. En théorie, des cycles répétés de clivage de l'ADN devraient augmenter les chances de réalisation de l'édition génomique souhaitée. [68] Une caractéristique distinctive de Cas12a, par rapport à Cas9, est qu'après avoir coupé sa cible, Cas12a reste lié à la cible et clive ensuite les autres molécules d'ADN ss sans discrimination. [69] Cette propriété est appelée activité de "clivage collatéral" ou de "trans-clivage" et a été exploitée pour le développement de diverses technologies de diagnostic. [70] [71]

Cas13 (anciennement C2c2) Modifier

En 2016, la nucléase Cas13a (anciennement connue sous le nom de C2c2) de la bactérie Leptotrichia shahii a été caractérisé. Cas13 est une endonucléase à ARN guidée par l'ARN, ce qui signifie qu'elle ne clive pas l'ADN, mais uniquement l'ARN simple brin. Cas13 est guidé par son ARNc vers une cible ARNsb et se lie et clive la cible. Semblable à Cas12a, le Cas13 reste lié à la cible et clive ensuite les autres molécules d'ARNss sans discrimination. [72] Cette propriété de clivage collatéral a été exploitée pour le développement de diverses technologies de diagnostic. [73] [74] [75]

Répétitions et espaceurs Modifier

La puce CRISPR est composée d'une séquence leader riche en AT suivie de courtes répétitions séparées par des espaceurs uniques. [76] Les répétitions CRISPR varient généralement en taille de 28 à 37 paires de bases (bps), bien qu'il puisse y avoir aussi peu que 23 pb et jusqu'à 55 pb. [77] Certains montrent une symétrie de dyade, impliquant la formation d'une structure secondaire telle qu'une tige-boucle (« épingle à cheveux ») dans l'ARN, tandis que d'autres sont conçus pour être non structurés. La taille des espaceurs dans différentes matrices CRISPR est généralement de 32 à 38 pb (plage de 21 à 72 pb). [77] De nouveaux espaceurs peuvent apparaître rapidement dans le cadre de la réponse immunitaire à l'infection par les phages. [78] Il y a généralement moins de 50 unités de la séquence d'espacement de répétition dans une puce CRISPR. [77]

Structures d'ARN CRISPR Modifier

Gènes Cas et sous-types CRISPR Modifier

De petites grappes de cas les gènes sont souvent situés à côté des puces à espacement répété CRISPR. Collectivement les 93 cas les gènes sont regroupés en 35 familles sur la base de la similarité de séquence des protéines codées. 11 des 35 familles forment le cas core, qui comprend les familles de protéines Cas1 à Cas9. Un locus CRISPR-Cas complet possède au moins un gène appartenant au cas coeur. [79]

Les systèmes CRISPR-Cas se répartissent en deux classes. Les systèmes de classe 1 utilisent un complexe de plusieurs protéines Cas pour dégrader les acides nucléiques étrangers. Les systèmes de classe 2 utilisent une seule grande protéine Cas dans le même but. La classe 1 est divisée en types I, III et IV. La classe 2 est divisée en types II, V et VI. [80] Les 6 types de système sont divisés en 19 sous-types. [81] Chaque type et la plupart des sous-types sont caractérisés par un « gène de signature » trouvé presque exclusivement dans la catégorie. La classification est également basée sur le complément de cas gènes qui sont présents. La plupart des systèmes CRISPR-Cas ont une protéine Cas1. La phylogénie des protéines Cas1 est généralement d'accord avec le système de classification. [79] De nombreux organismes contiennent plusieurs systèmes CRISPR-Cas, ce qui suggère qu'ils sont compatibles et peuvent partager des composants. [82] [83] La distribution sporadique des sous-types CRISPR/Cas suggère que le système CRISPR/Cas est soumis à un transfert horizontal de gènes pendant l'évolution microbienne.

L'immunité CRISPR-Cas est un processus naturel des bactéries et des archées. [98] CRISPR-Cas prévient l'infection, la conjugaison et la transformation naturelle des bactériophages en dégradant les acides nucléiques étrangers qui pénètrent dans la cellule. [36]

Acquisition d'espaceur Modifier

Lorsqu'un microbe est envahi par un bactériophage, la première étape de la réponse immunitaire consiste à capturer l'ADN du phage et à l'insérer dans un locus CRISPR sous la forme d'un espaceur. Cas1 et Cas2 se trouvent dans les deux types de systèmes immunitaires CRISPR-Cas, ce qui indique qu'ils sont impliqués dans l'acquisition d'espaceurs. Des études de mutation ont confirmé cette hypothèse, montrant que la suppression de cas1 ou cas2 arrêtait l'acquisition de l'espaceur, sans affecter la réponse immunitaire CRISPR. [99] [100] [101] [102] [103]

Plusieurs protéines Cas1 ont été caractérisées et leurs structures résolues. [104] [105] [106] Les protéines Cas1 ont diverses séquences d'acides aminés. Cependant, leurs structures cristallines sont similaires et toutes les protéines Cas1 purifiées sont des nucléases/intégrases métal-dépendantes qui se lient à l'ADN d'une manière indépendante de la séquence. [82] Des protéines Cas2 représentatives ont été caractérisées et possèdent une activité endoribonucléase spécifique de l'ARNss-[107] (monocaténaire) ou de l'ADNdb-[108] [109] (double brin).

Dans le système I-E de E. coli Cas1 et Cas2 forment un complexe où un dimère Cas2 relie deux dimères Cas1. [110] Dans ce complexe, Cas2 joue un rôle d'échafaudage non enzymatique, [110] liant des fragments double brin d'ADN envahissant, tandis que Cas1 lie les flancs simple brin de l'ADN et catalyse leur intégration dans les puces CRISPR. [111] [112] [113] De nouveaux espaceurs sont généralement ajoutés au début du CRISPR à côté de la séquence de tête créant un enregistrement chronologique des infections virales. [114] Dans E. coli une protéine de type histone appelée facteur d'intégration hôte (IHF), qui se lie à la séquence leader, est responsable de la précision de cette intégration. [115] L'IHF améliore également l'efficacité d'intégration dans le système de type I-F de Pectobacterium atrosepticum. [116] mais dans d'autres systèmes, différents facteurs d'hôte peuvent être requis [117]

Motifs adjacents du Protospacer Modifier

L'analyse bioinformatique des régions des génomes des phages qui ont été excisées en tant qu'espaceurs (appelés protoespaceurs) a révélé qu'elles n'étaient pas sélectionnées au hasard mais qu'elles étaient plutôt adjacentes à de courtes séquences d'ADN (3 à 5 pb) appelées motifs adjacents aux protoespaceurs (PAM). L'analyse des systèmes CRISPR-Cas a montré que les PAM étaient importantes pour les systèmes de type I et de type II, mais pas pour les systèmes de type III lors de l'acquisition. [32] [118] [119] [120] [121] [122] Dans les systèmes de type I et de type II, les protoespaceurs sont excisés à des positions adjacentes à une séquence PAM, l'autre extrémité de l'espaceur étant coupée à l'aide d'un mécanisme de règle, maintenant ainsi la régularité de la taille de l'espaceur dans le réseau CRISPR. [123] [124] La conservation de la séquence PAM diffère entre les systèmes CRISPR-Cas et semble être liée de manière évolutive à Cas1 et à la séquence leader. [122] [125]

De nouveaux espaceurs sont ajoutés à une matrice CRISPR de manière directionnelle, [30] apparaissant préférentiellement, [78] [118] [119] [126] [127] mais pas exclusivement, adjacents [121] [124] à la séquence leader. Analyse du système de type I-E de E. coli ont démontré que la première répétition directe adjacente à la séquence leader est copiée, avec l'espaceur nouvellement acquis inséré entre les première et deuxième répétitions directes. [102] [123]

La séquence PAM semble être importante lors de l'insertion de l'espaceur dans les systèmes de type I-E. Cette séquence contient un nucléotide final fortement conservé (nt) adjacent au premier nt du protospacer. Ce nt devient la base finale de la première répétition directe. [103] [128] [129] Cela suggère que la machinerie d'acquisition de l'espaceur génère des surplombs simple brin dans l'avant-dernière position de la répétition directe et dans le PAM lors de l'insertion de l'espaceur. Cependant, tous les systèmes CRISPR-Cas ne semblent pas partager ce mécanisme car les PAM dans d'autres organismes ne montrent pas le même niveau de conservation dans la position finale. [125] Il est probable que dans ces systèmes, une extrémité émoussée soit générée à la toute fin de la répétition directe et du protospacer lors de l'acquisition.

Variantes d'insertion Modifier

Analyse de Sulfolobus solfataricus Les CRISPR ont révélé d'autres complexités du modèle canonique d'insertion d'espaceurs, car l'un de ses six loci CRISPR a inséré de nouveaux espaceurs de manière aléatoire dans son réseau CRISPR, par opposition à l'insertion la plus proche de la séquence de tête. [124]

Plusieurs CRISPR contiennent de nombreux espaceurs pour le même phage. Le mécanisme qui provoque ce phénomène a été découvert dans le système de type I-E de E. coli. Une amélioration significative de l'acquisition d'espaceurs a été détectée lorsque les espaceurs ciblent déjà le phage, même des mésappariements avec le protospacer. Cet « amorçage » nécessite que les protéines Cas impliquées à la fois dans l'acquisition et l'interférence interagissent les unes avec les autres. Les espaceurs nouvellement acquis qui résultent du mécanisme d'amorçage se trouvent toujours sur le même brin que l'espaceur d'amorçage. [103] [128] [129] Cette observation a conduit à l'hypothèse que la machinerie d'acquisition glisse le long de l'ADN étranger après l'amorçage pour trouver un nouveau protospacer. [129]

Biogenèse Modifier

CRISPR-RNA (crRNA), qui guide plus tard la nucléase Cas vers la cible pendant l'étape d'interférence, doit être généré à partir de la séquence CRISPR. Le crRNA est initialement transcrit dans le cadre d'un seul long transcrit englobant une grande partie de la puce CRISPR. [28] Ce transcrit est ensuite clivé par les protéines Cas pour former des ARNcr. Le mécanisme de production des ARNcr diffère selon les systèmes CRISPR/Cas. Dans les systèmes de type I-E et de type I-F, les protéines Cas6e et Cas6f, respectivement, reconnaissent les tiges-boucles [130] [131] [132] créées par l'appariement de répétitions identiques qui flanquent le crRNA. [133] Ces protéines Cas clivent le plus long transcrit au bord de la région appariée, laissant un seul ARNcr avec un petit reste de la région répétée appariée.

Les systèmes de type III utilisent également Cas6, mais leurs répétitions ne produisent pas de tige-boucle. Le clivage se produit à la place par le transcrit plus long enroulant autour du Cas6 pour permettre le clivage juste en amont de la séquence répétée. [134] [135] [136]

Les systèmes de type II manquent du gène Cas6 et utilisent à la place la RNaseIII pour le clivage. Les systèmes fonctionnels de type II codent pour un ARN extra-petit qui est complémentaire de la séquence répétée, connu sous le nom de crRNA trans-activant (tracrRNA). [40] La transcription du tracrRNA et du transcrit primaire CRISPR entraîne un appariement de bases et la formation d'ARNdb au niveau de la séquence répétée, qui est ensuite ciblée par la RNaseIII pour produire des crRNA. Contrairement aux deux autres systèmes, le crRNA ne contient pas l'espaceur complet, qui est plutôt tronqué à une extrémité. [91]

Les ARNr s'associent aux protéines Cas pour former des complexes ribonucléotidiques qui reconnaissent les acides nucléiques étrangers. Les ARNr ne montrent aucune préférence entre les brins codants et non codants, ce qui indique un système de ciblage d'ADN guidé par l'ARN. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] Le complexe de type I-E (communément appelé Cascade) nécessite cinq protéines Cas liées à un seul ARNcr. [140] [141]

Interférence Modifier

Au cours de la phase d'interférence dans les systèmes de type I, la séquence PAM est reconnue sur le brin complémentaire de l'ARNcr et est requise avec l'annelage de l'ARNcr. Dans les systèmes de type I, l'appariement correct des bases entre le crRNA et le protospacer signale un changement de conformation dans Cascade qui recrute Cas3 pour la dégradation de l'ADN.

Les systèmes de type II reposent sur une seule protéine multifonctionnelle, Cas9, pour l'étape d'interférence. [91] Cas9 nécessite à la fois le crRNA et le tracrRNA pour fonctionner et clive l'ADN en utilisant ses domaines d'endonucléase de type HNH et RuvC/RNaseH. L'appariement de bases entre le PAM et le génome du phage est requis dans les systèmes de type II. Cependant, le PAM est reconnu sur le même brin que le crRNA (le brin opposé aux systèmes de type I).

Les systèmes de type III, comme le type I, nécessitent six ou sept protéines Cas se liant aux ARNcr. [142] [143] Les systèmes de type III analysés à partir de S. solfataricus et P. furiosus les deux ciblent l'ARNm des phages plutôt que le génome de l'ADN du phage, [83] [143], ce qui peut rendre ces systèmes particulièrement capables de cibler les génomes de phage à base d'ARN. [82] Les systèmes de type III ciblaient également l'ADN en plus de l'ARN en utilisant une protéine Cas différente dans le complexe, Cas10. [144] Le clivage de l'ADN s'est avéré dépendant de la transcription. [145]

Le mécanisme permettant de se distinguer de l'ADN étranger lors d'une interférence est intégré aux ARNr et est donc probablement commun aux trois systèmes. Tout au long du processus de maturation distinctif de chaque type majeur, tous les ARNr contiennent une séquence d'espacement et une partie de la répétition à une ou aux deux extrémités. C'est la séquence de répétition partielle qui empêche le système CRISPR-Cas de cibler le chromosome car l'appariement de bases au-delà de la séquence d'espacement signale le soi et empêche le clivage de l'ADN. [146] Les enzymes CRISPR guidées par l'ARN sont classées comme des enzymes de restriction de type V.

On pense que les gènes cas dans les modules adaptateurs et effecteurs du système CRISPR-Cas ont évolué à partir de deux modules ancestraux différents. Un élément de type transposon appelé casposon codant pour l'intégrase de type Cas1 et potentiellement d'autres composants du module d'adaptation a été inséré à côté du module effecteur ancestral, qui fonctionnait probablement comme un système immunitaire inné indépendant. [147] Les gènes cas1 et cas2 hautement conservés du module adaptateur ont évolué à partir du module ancestral tandis qu'une variété de gènes cas effecteurs de classe 1 ont évolué à partir du module effecteur ancestral. [148] L'évolution de ces différents gènes cas du module effecteur de classe 1 a été guidée par divers mécanismes, tels que les événements de duplication. [149] D'autre part, chaque type de module effecteur de classe 2 est né d'insertions indépendantes ultérieures d'éléments génétiques mobiles. [150] Ces éléments génétiques mobiles ont remplacé les modules effecteurs de gènes multiples pour créer des modules effecteurs de gènes uniques qui produisent de grandes protéines qui effectuent toutes les tâches nécessaires du module effecteur. [150] Les régions d'espacement des systèmes CRISPR-Cas proviennent directement d'éléments génétiques mobiles étrangers et leur évolution à long terme est donc difficile à retracer. [151] L'évolution non aléatoire de ces régions d'espacement s'est avérée fortement dépendante de l'environnement et des éléments génétiques mobiles étrangers particuliers qu'il contient. [152]

CRISPR/Cas peut immuniser les bactéries contre certains phages et ainsi stopper la transmission. Pour cette raison, Koonin a décrit CRISPR/Cas comme un mécanisme d'héritage lamarckien. [153] Cependant, cela a été contesté par un critique qui a noté : « Nous devrions nous souvenir de [Lamarck] pour le bien qu'il a apporté à la science, et non pour des choses qui ne ressemblent que superficiellement à sa théorie. obscurcit la manière simple et élégante dont l'évolution fonctionne réellement". [154] Mais au fur et à mesure que des études plus récentes ont été menées, il est devenu évident que les régions d'espacement acquises des systèmes CRISPR-Cas sont en effet une forme d'évolution lamarckienne car ce sont des mutations génétiques acquises puis transmises. [155] D'autre part, l'évolution de la machinerie du gène Cas qui facilite le système évolue à travers l'évolution darwinienne classique. [155]

Coévolution Modifier

L'analyse des séquences CRISPR a révélé la coévolution des génomes de l'hôte et du virus. [156] Les protéines Cas9 sont hautement enrichies en bactéries pathogènes et commensales. La régulation génique médiée par CRISPR/Cas peut contribuer à la régulation des gènes bactériens endogènes, en particulier lors de l'interaction avec des hôtes eucaryotes. Par exemple, Francisella novicida utilise un petit ARN unique associé à CRISPR/Cas (scaARN) pour réprimer un transcrit endogène codant pour une lipoprotéine bactérienne essentielle à la F. novicida pour atténuer la réponse de l'hôte et promouvoir la virulence. [157]

Le modèle de base de l'évolution de CRISPR est constitué d'espaceurs nouvellement incorporés qui poussent les phages à muter leurs génomes pour éviter la réponse immunitaire bactérienne, créant une diversité à la fois dans les populations de phages et d'hôtes. Pour résister à une infection phagique, la séquence de l'espaceur CRISPR doit correspondre parfaitement à la séquence du gène phagique cible. Les phages peuvent continuer à infecter leurs hôtes en raison de mutations ponctuelles dans l'espaceur. [146] Une stringence similaire est requise dans le PAM ou la souche bactérienne reste sensible aux phages. [119] [146]

Tarifs Modifier

Une étude de 124 S. thermophilus souches ont montré que 26 % de tous les espaceurs étaient uniques et que différents loci CRISPR présentaient des taux différents d'acquisition des espaceurs. [118] Certains loci CRISPR évoluent plus rapidement que d'autres, ce qui a permis de déterminer les relations phylogénétiques des souches. Une analyse génomique comparative a montré que E. coli et S. enterica évoluent beaucoup plus lentement que S. thermophilus. Les souches de ce dernier qui ont divergé il y a 250 000 ans contenaient toujours le même complément d'espacement. [158]

L'analyse métagénomique de deux biofilms de drainage minier acide a montré que l'un des CRISPR analysés contenait des suppressions étendues et des ajouts d'espaceurs par rapport à l'autre biofilm, suggérant une activité/prévalence des phages plus élevée dans une communauté que dans l'autre. [78] Dans la cavité buccale, une étude temporelle a déterminé que 7 à 22 % des espaceurs étaient partagés sur 17 mois au sein d'un individu alors que moins de 2 % étaient partagés entre les individus. [127]

Dans le même environnement, une seule souche a été suivie à l'aide d'amorces PCR spécifiques à son système CRISPR. Les résultats à grande échelle de la présence/absence d'espaceur ont montré une diversité significative. Cependant, ce CRISPR a ajouté 3 espaceurs sur 17 mois, [127] suggérant que même dans un environnement avec une diversité CRISPR significative, certains loci évoluent lentement.

Les CRISPR ont été analysés à partir des métagénomes produits pour le projet sur le microbiome humain. [159] Bien que la plupart étaient spécifiques à un site corporel, certains au sein d'un site corporel sont largement partagés entre les individus. L'un de ces loci provenait d'espèces streptococciques et contenait environ 15 000 espaceurs, dont 50 % étaient uniques. A l'instar des études ciblées de la cavité buccale, certaines ont montré peu d'évolution dans le temps. [159]

L'évolution de CRISPR a été étudiée dans des chémostats utilisant S. thermophilus pour examiner directement les taux d'acquisition des espaceurs. Dans une semaine, S. thermophilus les souches ont acquis jusqu'à trois espaceurs lorsqu'elles ont été mises à l'épreuve avec un seul phage. [160] Au cours du même intervalle, le phage a développé des polymorphismes nucléotidiques uniques qui se sont fixés dans la population, suggérant que le ciblage avait empêché la réplication du phage en l'absence de ces mutations. [160]

Un autre S.thermophile L'expérience a montré que les phages peuvent infecter et se répliquer chez des hôtes qui n'ont qu'un seul espaceur de ciblage. Un autre encore a montré que des hôtes sensibles peuvent exister dans des environnements avec des titres élevés de phages. [161] Le chemostat et les études observationnelles suggèrent de nombreuses nuances pour CRISPR et la (co)évolution des phages.

Les CRISPR sont largement distribués parmi les bactéries et les archées [87] et présentent certaines similitudes de séquences. [133] Leur caractéristique la plus notable est leurs espaceurs répétés et leurs répétitions directes. Cette caractéristique rend les CRISPR facilement identifiables dans de longues séquences d'ADN, car le nombre de répétitions diminue la probabilité d'une correspondance faussement positive. [162]

L'analyse des CRISPR dans les données métagénomiques est plus difficile, car les loci CRISPR ne s'assemblent généralement pas, en raison de leur nature répétitive ou de la variation de la souche, ce qui confond les algorithmes d'assemblage. Lorsque de nombreux génomes de référence sont disponibles, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour amplifier les puces CRISPR et analyser le contenu des espaceurs. [118] [127] [163] [164] [165] [166] Cependant, cette approche ne fournit des informations que pour les CRISPR spécifiquement ciblés et pour les organismes suffisamment représentés dans les bases de données publiques pour concevoir des amorces fiables de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Des amorces dégénérées spécifiques aux répétitions peuvent être utilisées pour amplifier les espaceurs CRISPR directement à partir d'échantillons environnementaux. Des amplicons contenant deux ou trois espaceurs peuvent ensuite être assemblés informatiquement pour reconstruire de longues matrices CRISPR. [166]

L'alternative consiste à extraire et à reconstruire des matrices CRISPR à partir de données métagénomiques de fusil de chasse. Cela est plus difficile en termes de calcul, en particulier avec les technologies de séquençage de deuxième génération (par exemple 454, Illumina), car les courtes longueurs de lecture empêchent plus de deux ou trois unités répétées d'apparaître dans une seule lecture. L'identification CRISPR dans les lectures brutes a été réalisée en utilisant purement de novo identification [167] ou en utilisant des séquences répétées directes dans des puces CRISPR partiellement assemblées à partir de contigs (segments d'ADN se chevauchant qui représentent ensemble une région consensus de l'ADN) [159] et des séquences répétées directes provenant de génomes publiés [168] comme crochet pour identifier les répétitions directes en lectures individuelles.

Une autre façon pour les bactéries de se défendre contre l'infection par les phages est d'avoir des îlots chromosomiques. Un sous-type d'îlots chromosomiques appelés îlots chromosomiques inductibles par les phages (PICI) est excisé d'un chromosome bactérien lors d'une infection par les phages et peut inhiber la réplication des phages. [169] Les PICI sont induits, excisés, répliqués et finalement conditionnés dans de petites capsides par certains phages tempérés staphylococciques. Les PICI utilisent plusieurs mécanismes pour bloquer la reproduction des phages. Dans le premier mécanisme, la Ppi codée par PICI bloque de manière différentielle la maturation du phage en se liant ou en interagissant spécifiquement avec le phage TerS, bloque ainsi la formation du complexe phage TerS/TerL responsable de l'encapsidation de l'ADN du phage. Dans le deuxième mécanisme, PICI CpmAB redirige la protéine morphogénétique de la capside du phage pour fabriquer 95% de la capside de la taille de SaPI et l'ADN du phage ne peut emballer qu'un tiers de son génome dans ces petites capsides et donc devenir un phage non viable. [170] Le troisième mécanisme implique deux protéines, PtiA et PtiB, qui ciblent le LtrC, responsable de la production de virions et de protéines de lyse. Ce mécanisme d'interférence est modulé par une protéine modulatrice, PtiM, qui se lie à l'une des protéines de médiation d'interférence, PtiA, et atteint ainsi le niveau d'interférence requis. [171]

Une étude a montré que le phage lytique ICP1, qui cible spécifiquement Vibrio cholerae sérogroupe O1, a acquis un système CRISPR/Cas qui cible un V. choléra Élément de type PICI. Le système possède 2 loci CRISPR et 9 gènes Cas. Il semble être homologue au système I-F trouvé dans Yersinia pestis. De plus, comme le système bactérien CRISPR/Cas, ICP1 CRISPR/Cas peut acquérir de nouvelles séquences, ce qui permet au phage et à l'hôte de co-évoluer. [172]

Il a été montré que certains virus archéens portaient des puces mini-CRISPR contenant un ou deux espaceurs. Il a été démontré que les espaceurs au sein des puces CRISPR à transmission virale ciblent d'autres virus et plasmides, ce qui suggère que les puces mini-CRISPR représentent un mécanisme d'exclusion de la surinfection hétérotypique et participent aux conflits interviraux. [166]

Édition de gènes CRISPR Modifier

La technologie CRISPR a été appliquée dans les industries alimentaires et agricoles pour concevoir des cultures probiotiques et immuniser des cultures industrielles (pour le yaourt, par exemple) contre les infections. Il est également utilisé dans les cultures pour améliorer le rendement, la tolérance à la sécheresse et la valeur nutritionnelle. [173]

À la fin de 2014, quelque 1000 articles de recherche avaient été publiés qui mentionnaient CRISPR. [174] [175] La technologie avait été utilisée pour inactiver fonctionnellement des gènes dans des lignées cellulaires et des cellules humaines, pour étudier Candida albicans, pour modifier les levures utilisées pour fabriquer des biocarburants et pour modifier génétiquement des souches végétales. [175] Hsu et ses collègues déclarent que la capacité de manipuler les séquences génétiques permet une ingénierie inverse qui peut affecter positivement la production de biocarburants [176] CRISPR peut également être utilisé pour changer les moustiques afin qu'ils ne puissent pas transmettre de maladies telles que le paludisme. [177] Les approches basées sur CRISPR utilisant Cas12a ont récemment été utilisées pour modifier avec succès un grand nombre d'espèces végétales. [178]

En juillet 2019, CRISPR a été utilisé pour traiter expérimentalement un patient atteint d'une maladie génétique. La patiente était une femme de 34 ans atteinte de drépanocytose. [179]

En février 2020, des progrès ont été réalisés sur les traitements du VIH avec 60 à 80 % de l'ADN retiré chez les souris et certains étant complètement exempts du virus après des modifications impliquant à la fois LASER ART, une nouvelle thérapie antirétrovirale, et CRISPR. [180]

En mars 2020, un virus modifié par CRISPR a été injecté dans l'œil d'un patient pour tenter de traiter l'amaurose congénitale de Leber. [181]

À l'avenir, l'édition de gènes CRISPR pourrait potentiellement être utilisée pour créer de nouvelles espèces ou faire revivre des espèces éteintes à partir d'espèces étroitement apparentées. [182]

Les réévaluations basées sur CRISPR des allégations de relations gène-maladie ont conduit à la découverte d'anomalies potentiellement importantes. [183]

CRISPR comme outil de diagnostic Modifier

Les nucléases associées à CRISPR se sont avérées utiles en tant qu'outil pour les tests moléculaires en raison de leur capacité à cibler spécifiquement des séquences d'acides nucléiques dans un fond élevé de séquences non cibles. En 2016, la nucléase Cas9 a été utilisée pour épuiser les séquences nucléotidiques indésirables dans les bibliothèques de séquençage de nouvelle génération tout en ne nécessitant que 250 picogrammes d'entrée d'ARN initiale. [184] À partir de 2017, les nucléases associées à CRISPR ont également été utilisées pour des tests de diagnostic direct des acides nucléiques, jusqu'à la sensibilité à une seule molécule. [185] [186]

En couplant les diagnostics basés sur CRISPR à des processus enzymatiques supplémentaires, la détection de molécules au-delà des acides nucléiques est possible. Un exemple de technologie couplée est le profilage de la transcription IN vitro (SPRINT) basé sur SHERLOCK. SPRINT peut être utilisé pour détecter une variété de substances, telles que des métabolites dans des échantillons de patients ou des contaminants dans des échantillons environnementaux, avec un débit élevé ou avec des appareils portables au point de service. [187] Les plates-formes CRISPR/Cas sont également explorées pour la détection [188] [189] [190] [191] [192] et l'inactivation du SARS-CoV-2, le virus qui cause le COVID-19. [193]


Dépistage

Les cribles permettent une étude rapide d'un grand nombre de gènes candidats ou de sites génomiques pour une implication dans votre voie ou phénotype d'intérêt. Les améliorations apportées à la fabrication d'oligos groupés et à la gestion des mégadonnées, combinées à l'efficacité de l'administration des lentiviraux, permettent aux chercheurs d'envisager des milliers de gènes candidats à la fois, soit en tant que bibliothèque, soit en tant que panel plus ciblé. Nous définissons les bibliothèques comme des collections entières de génomes de panels de clones CRISPR sont des sous-ensembles de gènes plus petits. Généralement, les panels et les bibliothèques peuvent être assemblés sous deux formats : regroupés (des milliers d'ARNg dans un tube) ou en réseau (un ARNg par puits dans des plaques à 96 puits). Les deux approches fournissent des réponses rapides à des questions plus vastes, offrant des avantages significatifs par rapport aux méthodes antérieures qui nécessitaient un processus fastidieux et laborieux d'interrogation des gènes candidats un par un.

Nous proposons une variété de solutions de criblage, y compris les bibliothèques GeCKO regroupées de la bibliothèque CRISPR Broad et Sanger Arrayed Whole Genome Lentiviral CRISPR pour effectuer de grands criblages de gène knock-out (8). Et, bientôt, les bibliothèques regroupées du médiateur d'activation synergique (SAM) CRISPR/Cas9 humain et murin pour le criblage à l'échelle du génome des phénotypes d'activation transcriptionnelle !


INTRODUCTION

Le développement d'outils d'édition du génome de haute précision, tels que les nucléases ciblées, a accéléré les progrès de la science végétale fondamentale et de la sélection végétale (Zhang, Massel, Godwin et Gao, 2018). Les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR), et sa protéine associée à CRISPR (Cas), est une nucléase guidée par l'ARN développée à partir du système immunitaire adaptatif microbien en se réutilisant pour l'édition du génome (Barrangou & Marraffini, 2014). Les technologies CRISPR-Cas peuvent faciliter l'ingénierie efficace du génome au sein des cellules eucaryotes (Komor, Badran et Liu, 2017). Le ciblage précis de la protéine Cas9 est obtenu en spécifiant une séquence de ciblage de 20 nucléotides (nt) au sein de son ARN guide unique (sgRNA Ran et al., 2013). L'application d'outils d'édition du génome tels que CRISPR-Cas9 dans les études génétiques et pour l'ingénierie des cultures avec des traits souhaitables est devenue un objectif majeur des phytotechniciens et des sélectionneurs de plantes de précision (Borrill, 2020). L'induction de cassures double brin spécifiques à un site ciblé dans l'ADN et la réparation ultérieure par ligature directe entraînent parfois des erreurs telles que des insertions ou des délétions (indels) entraînant une perte de la fonction des gènes (knockouts Rodgers & McVey, 2016).

Les blés domestiqués modernes sont des dérivés d'anciens événements d'hybridation entre des espèces progénitrices ancestrales. Les deux blés les plus cultivés sont le blé dur tétraploïde ou le blé à pâtes (Triticum turgidum ssp. blé dur L.) et le blé tendre hexaploïde (Triticum aestivum L.) (Matsuoka, 2011). Les deux espèces ont de grands génomes—durum, 12 et hexaploïdie, ∼16 Gbp—constitués principalement d'éléments répétitifs. Au sein de ces espèces polyploïdes, chaque gène existe généralement en deux exemplaires dans le blé dur tétraploïde ou en trois exemplaires dans le blé panifiable hexaploïde. Les copies de gènes homologues sont généralement hautement conservées dans la structure et la séquence des gènes parmi les sous-génomes (>95% Adamski et al., 2020).

La première utilisation signalée de CRISPR-Cas9 pour produire une plante de blé à génome stable a été la suppression ciblée du Mildew Locus O (Mlo), conférant une résistance au pathogène de l'oïdium. Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt), ceci a été réalisé en combinaison avec une technologie d'édition de gènes antérieure, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN Wang et al., 2014). Depuis ce premier rapport, des gènes de blé d'intérêt agronomique et scientifique fondamental ont été ciblés à l'aide de la technologie CRISPR-Cas9, tels que les gènes de la α-gliadine pour abaisser la teneur en gluten des grains (Sánchez-León et al., 2018), TaGW2 augmenter le poids des grains (Zhang, Li, et al., 2018 ), TaZIP4-B2 pour comprendre le croisement homologue méiotique (Rey et al., 2018 ), TaQsd1 pour réduire la germination avant récolte (Abe et al., 2019 ), TaMTL et CENH3 pour l'induction de plantes haploïdes (Liu et al., 2019 Lv et al., 2020).

Ici, nous décrivons des protocoles dérivés expérimentalement pour la sélection de cibles sgRNA, l'assemblage de construction et l'analyse de dépistage pour l'édition du génome dans le blé hexaploïde.


CRISPR-Cas : biologie, mécanismes et pertinence

Les procaryotes ont développé plusieurs mécanismes de défense pour se protéger des prédateurs viraux. Les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR) et leurs protéines associées (Cas) affichent un système immunitaire adaptatif procaryote qui mémorise les infections précédentes en intégrant de courtes séquences de génomes envahissants - appelés espaceurs - dans le locus CRISPR. Les espaceurs espacés avec des répétitions sont exprimés sous forme de petits ARN CRISPR guides (ARNcr) qui sont utilisés par les protéines Cas pour cibler la séquence des envahisseurs spécifiquement lors d'une infection récurrente. La capacité du système CRISPR-Cas9 minimal à cibler des séquences d'ADN à l'aide d'ARN programmables a ouvert de nouvelles voies dans l'édition du génome dans une large gamme de cellules et d'organismes à fort potentiel dans les applications thérapeutiques. Alors que de nombreuses études scientifiques ont fait la lumière sur les processus biochimiques derrière les systèmes CRISPR-Cas, plusieurs aspects des étapes de l'immunité manquent cependant encore de compréhension suffisante. Cette revue résume les principales découvertes dans le domaine CRISPR-Cas, discute du rôle de CRISPR-Cas dans l'immunité procaryote et d'autres propriétés physiologiques, et décrit les applications du système en tant que technologie d'édition d'ADN et agent antimicrobien.

Cet article fait partie du numéro thématique « La nouvelle bactériologie ».

1. Introduction

Étant les entités les plus abondantes sur notre planète, les virus bactériens et archéens (bactériophages ou phages) présentent une menace constante pour la vie procaryote. Afin de résister aux phages, les procaryotes ont développé plusieurs stratégies de défense. Au cours de la dernière décennie, le système immunitaire procaryote CRISPR-Cas (regroupé de courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées - associé à CRISPR) a attiré de plus en plus l'attention de la communauté scientifique, non seulement en raison de sa nature adaptative unique, mais aussi en raison de son potentiel thérapeutique. Cette revue cherche à résumer les principales découvertes faites dans le domaine de CRISPR-Cas, et décrit les rôles biologiques du système dans la défense antivirale et d'autres voies biologiques ainsi que son importance pour les applications médicales.

CRISPR-Cas est le seul système immunitaire adaptatif connu à ce jour chez les procaryotes. Dans ce système, de petits ARN guides (crRNA) sont utilisés pour une interférence spécifique à la séquence avec les acides nucléiques envahissants. CRISPR-Cas comprend un locus génomique appelé CRISPR qui abrite de courts éléments répétitifs (répétitions) séparés par des séquences uniques (espaceurs), qui peuvent provenir d'éléments génétiques mobiles (MGE) tels que des bactériophages, des transposons ou des plasmides. La matrice dite CRISPR est précédée d'une séquence leader riche en AT et est généralement flanquée d'un ensemble de cas gènes codant pour les protéines Cas [1–4]. À ce jour, les systèmes CRISPR-Cas peuvent être divisés en deux classes principales, qui sont ensuite classées en six types et plusieurs sous-types [5-7]. La classification est basée sur la présence de protéines effectrices Cas qui transmettent l'immunité en clivant des acides nucléiques étrangers. Dans les systèmes CRISPR-Cas de classe 1 (types I, III et IV), le module effecteur est constitué d'un complexe multiprotéique alors que les systèmes de classe 2 (types II, V et VI) n'utilisent qu'une seule protéine effectrice [5].

2. Mécanismes moléculaires : adaptation, maturation et interférence

Le système CRISPR-Cas agit d'une manière spécifique à la séquence en reconnaissant et en clivant l'ADN ou l'ARN étranger. Le mécanisme de défense peut être divisé en trois étapes : (i) adaptation ou acquisition d'espaceurs, (ii) biogenèse des ARNcr, et (iii) interférence cible (figure 1).

Figure 1. Modèle simplifié des mécanismes d'immunité des systèmes CRISPR-Cas de classe 1 et de classe 2. Les systèmes CRISPR-Cas sont composés d'un cas opéron (flèches bleues) et une puce CRISPR qui comprend des séquences répétées identiques (rectangles noirs) qui sont entrecoupées d'espaceurs dérivés du phage (rectangles colorés). Lors de l'infection par le phage, une séquence de l'ADN envahissant (protospacer) est incorporée dans la puce CRISPR par le complexe Cas1-Cas2. La puce CRISPR est ensuite transcrite en un long ARN CRISPR précurseur (pré-crRNA), qui est ensuite traité par Cas6 dans les systèmes de type I et III (traitement dans les systèmes CRISPR-Cas de type I-C par Cas5d). Dans les systèmes CRISPR-Cas de type II, la maturation de l'ARNcr nécessite tracrRNA, RNase III et Cas9, alors que dans les systèmes de type V-A, Cpf1 seul est suffisant pour la maturation de l'ARNcr. Dans l'état d'interférence des systèmes de type I, Cascade est guidé par l'ARNr pour lier l'ADN étranger d'une manière spécifique à la séquence et recrute ensuite Cas3 qui dégrade le brin déplacé par son activité exonucléolytique 3'-5'. Les systèmes CRISPR-Cas de type III-A et de type III-B utilisent des complexes Csm et Cmr, respectivement, pour le clivage de l'ADN (triangles rouges) et de ses transcrits (triangles noirs). Un complexe ribonucléoprotéique composé de Cas9 et d'un tracrRNA : le duplex crRNA cible et clive l'ADN envahissant dans les systèmes CRISPR-Cas de type II. La protéine effectrice guidée par l'ARNc Cpf1 est responsable de la dégradation de la cible dans les systèmes de type V. Les triangles rouges représentent les sites de clivage de la machinerie d'interférence.

(a) Adaptation

Dans une première phase, une séquence distincte du MGE envahissant appelée protospacer est incorporée dans le réseau CRISPR, produisant un nouvel espaceur. Cet événement permet à l'organisme hôte de mémoriser le matériel génétique de l'intrus et montre la nature adaptative de ce système immunitaire [1]. Deux protéines, Cas1 et Cas2, semblent être omniprésentes dans le processus d'acquisition d'espaceurs car elles peuvent être trouvées dans presque tous les types CRISPR-Cas. Les exceptions sont les systèmes CRISPR-Cas de type III-C, III-D et IV, qui n'hébergent aucune protéine homologue. De plus, le type V-C montre une composition minimale car il ne comprend qu'une protéine effectrice putative appelée C2C3 et un homologue Cas1 [5-7]. Au cours des dernières années, des avancées majeures ont été réalisées dans la révélation des principes biochimiques et génétiques de l'immunité CRISPR-Cas. Cependant, le mécanisme d'acquisition des espaceurs n'est toujours pas entièrement compris [8,9]. La sélection des protospacers et leur traitement avant intégration restent largement obscurs dans de nombreux types CRISPR-Cas. Des découvertes récentes, cependant, ont mis en lumière la biochimie du processus d'intégration des espaceurs. Il a été démontré que Cas1 et Cas2 du système de type I-E de Escherichia coli forment un complexe qui favorise l'intégration de nouveaux espaceurs d'une manière qui rappelle les intégrases et transposases virales [10-13]. Bien que Cas1 et Cas2 soient tous deux des nucléases [14–16], le site catalytiquement actif de Cas2 est superflu pour l'acquisition d'espaceurs [10–12]. Un nouvel espaceur est généralement incorporé à la limite leader-répétition du réseau CRISPR [1] tandis que la première répétition du réseau est dupliquée [17,18].

Les mécanismes des différents types de CRISPR-Cas ne pourraient être conservés que dans une certaine mesure car plusieurs études ont montré des variations concernant les exigences et les cibles de la machinerie d'adaptation. Alors que Cas1 et Cas2 sont suffisants pour favoriser l'acquisition d'espaceurs dans la plupart des systèmes CRISPR-Cas de type I étudiés, le type I-B nécessite en outre Cas4 pour l'adaptation [19]. Le système CRISPR-Cas de type I-F de Pseudomonas aeruginosa nécessite en outre la machinerie d'interférence pour favoriser l'adoption de nouveaux espaceurs [20]. De même, les systèmes de type II-A nécessitent Csn2, Cas9 et tracrRNA (trans activation de l'ARN CRISPR - voir plus de détails ci-dessous) pour l'acquisition [1,21,22]. Un autre mode d'adaptation, unique à ce jour, a été révélé pour une protéine Cas1 de type III-B fusionnée à une transcriptase inverse. Ici, l'acquisition à partir d'ADN et d'ARN a été rapportée [23].

La sélection d'une séquence cible intégrée au locus CRISPR n'est pas aléatoire.Il a été démontré que dans les systèmes CRISPR-Cas de type I, II et V, une courte séquence, appelée motif adjacent au protospacer (PAM), est située directement à côté du protospacer et est cruciale pour l'acquisition et l'interférence [24-29]. Dans les systèmes CRISPR-Cas de type II-A, le domaine de reconnaissance PAM de Cas9 est responsable de la sélection du protospacer [21,22]. On pense qu'après la sélection du protospacer, Cas9 recrute Cas1, Cas2 et éventuellement Csn2 pour l'intégration du nouvel espaceur dans la matrice CRISPR. Cette caractéristique peut être conservée parmi tous les systèmes CRISPR-Cas de classe 2 bien que les preuves expérimentales soient manquantes. Pour le type I-E, le complexe Cas1-Cas2 est suffisant pour la sélection et l'intégration des espaceurs, bien qu'il ait été rapporté que la présence du complexe d'interférence augmente la fréquence des espaceurs intégrés adjacents à un PAM approprié [24,25]. De plus, dans un processus appelé amorçage, la machinerie d'interférence de plusieurs systèmes CRISPR-Cas de type I peut stimuler l'absorption accrue de nouveaux espaceurs lors de la liaison guidée par l'ARNc à un protoespaceur sélectionné lors d'une première infection [19,25,30]. Ce procédé présente un mode d'adaptation distinct par rapport à l'acquisition naïve d'espaceur car il nécessite strictement un espaceur préexistant correspondant à la cible. Cela conduit généralement à des taux d'acquisition plus élevés à partir de protospacers situés à proximité du site cible [25]. Fait intéressant, l'acquisition d'espaceurs amorcés ne dépend pas du clivage de la cible car elle fonctionne également pour les sites cibles dégénérés qui entraîneraient généralement une interférence altérée [31]. Le mécanisme exact reste obscur mais il a été démontré que le complexe d'interférence peut recruter Cas1 et Cas2 lors de la liaison indépendante de PAM à l'ADN [32].

(b) Biogenèse

Pour activer l'immunité, la puce CRISPR est transcrite en un long ARNc précurseur (pré-ARNcr) qui est ensuite transformé en ARNcr guides matures contenant les séquences mémorisées des envahisseurs [33,34]. Dans les systèmes de type I et III, les membres de la famille Cas6 effectuent l'étape de traitement produisant des espèces intermédiaires d'ARNc qui sont flanquées d'une courte étiquette 5'. Une exception est donnée par les systèmes de type I-C, qui ne codent pas pour les protéines Cas6. Ici, la protéine Cas5d traite le pré-ARNr, ce qui donne des ARNr intermédiaires avec une étiquette 5′ de 11 nt [33,35-38]. Un rognage supplémentaire de l'extrémité 3' de l'ARNc intermédiaire par une nucléase inconnue peut se produire et produire des espèces d'ARNc matures composées d'une partie d'espacement complète (extrémité 5') et d'une partie répétée (extrémité 3'), qui affiche généralement une structure en épingle à cheveux dans la plupart des systèmes de type I [39-41]. La maturation des ARNcr dans les systèmes CRISPR-Cas de classe 2 diffère considérablement. Dans les systèmes de type II, le tracrRNA est requis pour le traitement du pré-crRNA. La séquence anti-répétition de cet ARN permet la formation d'un duplex d'ARN avec chacune des répétitions du pré-crRNA, qui est stabilisé par Cas9. Le duplex est ensuite reconnu et traité par l'hôte RNase III, produisant une forme intermédiaire d'ARNc qui subit une maturation supplémentaire par un mécanisme encore inconnu pour conduire au petit ARN guide mature [42]. Un mécanisme indépendant de la RNase III a été découvert dans le système CRISPR-Cas de type II-C de Neisseria meningitidis. Ici, les séquences de promoteur ont été identifiées comme se trouvant dans chaque répétition et certaines ont pu initier la transcription menant à des espèces d'ARNcr intermédiaires. Même si un traitement 3' médié par la RNase III du duplex crRNA : tracrRNA a été observé, il n'était pas nécessaire pour des interférences [43]. Dans le système CRISPR-Cas de type V-A, il a été démontré que Cpf1 a une double fonction pendant l'immunité CRISPR-Cas. Cpf1 traite les ARNr prématurés [28] et, à la suite d'un autre événement de maturation de nature inconnue, utilise les ARNr traités qu'il a générés pour cliver l'ADN cible [28,29].

(c) Interférence

Dans la dernière étape de l'immunité, les ARNc matures sont utilisés comme guides pour interférer spécifiquement avec les acides nucléiques envahissants. Les systèmes de classe 1 utilisent des complexes de type Cascade (complexe associé à CRISPR pour la défense antivirale) pour atteindre la dégradation de la cible, tandis que dans les systèmes de classe 2, une seule protéine effectrice est suffisante pour l'interférence cible [29,39,44-49]. Pour éviter l'auto-ciblage, les systèmes de type I, II et V reconnaissent spécifiquement la séquence PAM située en amont (types I et V) ou en aval (type II) du protospacer [26,28,29,31,45,50– 52]. Dans les systèmes de type III, la discrimination entre soi et non-soi est réalisée via le tag 5' du crRNA mature, qui ne doit pas s'apparier avec la cible pour permettre la dégradation par le complexe [53].

Dans les systèmes de type I, Cascade localise l'ADN envahissant d'une manière dépendante de l'ARNc et recrute en outre la nucléase Cas3 pour la dégradation de la cible. Cas3 induit une coupure sur l'ADN étranger et dégrade ensuite l'ADN cible [54,55]. Dans les systèmes CRISPR-Cas de type II, le duplex tracrRNA:crRNA guide la protéine effectrice Cas9 pour introduire une cassure double brin dans l'ADN cible [45]. La machinerie d'interférence des systèmes de type III comprend les complexes Cas10-Csm (types III-A et III-D) et Cas10-Cmr (types III-B et III-C) [5], qui sont capables de cibler à la fois l'ADN et l'ARN [ 38,39,47,49,56-63]. Curieusement, il a été montré que l'interférence des systèmes de type III-A et de type III-B dépend de la transcription de l'ADN cible [57,58]. Plus précisément, la sous-unité Cas10 clive l'ADN tandis que Csm3 [59,60] et Cmr4 [61] clivent l'ARNm transcrit dans les systèmes CRISPR-Cas de type III-A et de type III-B, respectivement. Les interférences dans les systèmes CRISPR-Cas de type V présentent des similitudes avec les interférences de type II. Un duplex d'ARN, composé de tracrRNA et de crRNA, est strictement requis pour le clivage de la cible dans les systèmes de type V-B [7]. Le type V-A, cependant, n'utilise que l'ARNr pour la localisation et la dégradation de la cible [28,29].

3. Mécanismes anti-CRISPR

Les procaryotes recèlent un remarquable arsenal de stratégies de défense pour coexister avec leurs prédateurs viraux (encadré 1). Dans le cadre de la course aux armements constante entre les bactéries et leurs homologues viraux, les phages ont développé différentes stratégies pour surmonter les mécanismes de défense antiviraux. Ce paragraphe résume les recherches sur la façon dont les phages échappent aux systèmes CRISPR-Cas.

Encadré 1. CRISPR-Cas – Quoi d'autre ? (Mécanismes de défense alternatifs en gras)

Outre les systèmes CRISPR-Cas, les procaryotes ont développé un ensemble complet de mécanismes de défense pour se protéger contre les prédateurs. Le cycle d'infection virale est initié par l'adsorption du phage sur la surface cellulaire bactérienne, où les phages reconnaissent des récepteurs spécifiques à l'hôte sur les membranes externes ou les parois cellulaires de l'hôte. Les bactéries peuvent empêcher l'adsorption des phages en produisant une matrice extracellulaire qui bloque physiquement l'accès au récepteur spécifique. D'autres contre-stratégies impliquent la mutation des récepteurs phagiques et la production d'inhibiteurs compétitifs qui occupent le récepteur et conduisent ainsi à une sensibilité réduite à l'adsorption phagique [64-66]. À l'étape suivante de l'infection, les phages injectent leur matériel génétique dans l'hôte. Afin de bloquer l'entrée de l'ADN viral, les bactéries utilisent ce que l'on appelle exclusion de surinfection (Sie) systèmes qui sont souvent codés par des prophages. Ces systèmes comprennent un ensemble de protéines qui empêchent la translocation de l'ADN phagique dans le cytoplasme [67,68].

Une fois entré, l'ADN viral peut être dégradé par restriction-modification (RM) des systèmes qui utilisent des nucléases pour reconnaître et cliver de courts motifs présents sur l'ADN envahisseur. L'ADN non méthylé est reconnu par ces enzymes de restriction et l'auto-clivage est empêché par la méthylation des sites cibles sur le génome de l'hôte [69,70]. Une autre stratégie de défense bloque la propagation des phages en sacrifiant une cellule hôte infectée, protégeant ainsi la population bactérienne. Ces infection abortive (Abi) Les mécanismes utilisent des protéines qui détectent les infections et induisent par conséquent la mort cellulaire, par ex. dépolarisation membranaire, inhibant l'appareil de traduction de l'hôte ou exploitant les composants des systèmes toxine-antitoxine [71-74]. Les systèmes antiviraux moins bien caractérisés englobent exclusion bactériophage (BREX) et procaryote Argonautes. Alors que BREX inhibe la réplication virale et l'intégration de l'ADN des phages lysogènes [75], les protéines Argonaute sont des nucléases guidées par l'ADN ou l'ARN qui clivent l'ADN envahissant d'une manière spécifique à la séquence [76-78].

Les phages peuvent échapper à la machinerie d'interférence CRISPR-Cas par des mutations aléatoires dans la région protospacer ou la séquence PAM [26,51]. En guise de contre-stratégie, plusieurs systèmes CRISPR-Cas de type I montrent une absorption élevée de nouveaux espaceurs en conséquence directe de mésappariements dans le PAM ou dans le protoespaceur ciblé lors de l'acquisition amorcée (voir §2). De plus, l'efficacité d'échapper à l'immunité CRISPR-Cas par des mutations ponctuelles est fortement altérée dans les populations bactériennes qui présentent une grande diversité d'espaceurs. Une explication possible de cette observation est que la diversité des espaceurs augmente la pression adaptative sur le virus et conduit ainsi à une extinction rapide du prédateur [79].

Des études récentes ont démontré que les phages de type Mu, qui infectent Pseudomonas aeruginosa, inhibent activement les systèmes CRISPR-Cas de leur hôte. Ces phages produisent des protéines anti-CRISPR (Acr) qui interagissent avec des composants de la machinerie d'interférence CRISPR-Cas de type I-F : par ex. les protéines phagiques AcrF1 et AcrF2 se lient à différentes sous-unités de Cascade et empêchent ainsi la liaison du complexe Csy à l'ADN cible. AcrF3 s'est avéré se lier à la nucléase Cas3, inhibant sa fonction dans la dégradation de la cible. Des protéines similaires ont été trouvées pour empêcher l'immunité CRISPR-Cas de type I-E dans le même organisme, soulevant ainsi la question de savoir si les protéines Acr existent pour d'autres types CRISPR-Cas [20, 80-82].

Dans un rapport unique à ce jour sur l'évasion immunitaire, il a été démontré que Vibrio cholerae Les phages ICP1 codent pour un système CRISPR-Cas de type I-F qui cible un îlot génomique hôte, connu pour être impliqué dans la défense anti-phage non liée à CRISPR. L'attaque du mécanisme de défense de l'hôte était cruciale pour la propagation des phages, car l'efficacité de l'infection était considérablement réduite lorsque les espaceurs de ciblage dans la puce virale CRISPR étaient supprimés. Curieusement, l'analyse des phages qui ont quand même réussi à infecter l'hôte a acquis de nouveaux espaceurs provenant du même locus génomique, montrant ainsi que le virus abrite un système CRISPR-Cas entièrement fonctionnel qui est également actif dans l'acquisition [83].

4. Au-delà de l'immunité adaptative

Outre leur rôle dans l'immunité procaryote, il a été démontré que les systèmes CRISPR-Cas participent à des voies cellulaires autres que l'immunité.

(a) Réparation de l'ADN

Les premiers rapports suggéraient une implication du E. coli Protéine Cas1 dans les voies de réparation de l'ADN puisqu'il a été démontré que la protéine interagissait avec les composants de la machinerie de réparation cellulaire comme RecB, RecC et RuvB. Cas1 a ensuite traité les structures d'ADN intermédiaires qui se produisent souvent lors de la réparation et de la recombinaison de l'ADN, comme les jonctions Holliday, les fourches de réplication et les 5'-volets. De plus, les suppressions de cas1 gène a entraîné une sensibilité accrue aux dommages à l'ADN et affecté la ségrégation des chromosomes [14]. De plus, la participation du système de recombinaison RecBCD à l'immunité CRISPR-Cas est devenue plus évidente ces dernières années. Le complexe RecBCD reconnaît les cassures de l'ADN double brin (ADNdb) qui se produisent souvent au niveau des fourches de réplication. Après avoir reconnu l'ADN endommagé, RecBCD dégrade ensuite l'ADN jusqu'à ce qu'il atteigne un site Chi [84]. Une étude récente a suggéré que les produits de dégradation du complexe de réparation servent de modèles pour l'acquisition d'espaceurs, car les nouveaux espaceurs ont été principalement acquis à partir de régions situées à proximité de fourches de réplication bloquées. En ce qui concerne l'immunité antivirale, RecBCD pourrait être la première ligne de défense car il reconnaît et dégrade l'ADN phagique linéaire et permet ainsi à la machinerie d'adaptation de collecter de nouveaux espaceurs. L'acquisition à partir d'ADN chromosomique est empêchée en raison de la distribution fréquente des sites Chi dans le génome de l'hôte [85]. L'exigence de RecB pour l'immunité CRISPR-Cas de type I-E a finalement été prouvée par une autre étude démontrant qu'un recB la suppression a aboli l'acquisition naïve d'espaceurs dans E. coli. Fait intéressant, l'absence de RecB n'a pas affecté l'acquisition de l'espaceur amorcé. Ici, les hélicases RecG et PriA étaient essentielles, tandis que l'ADN polymérase I était cruciale pour l'adaptation à la fois naïve et amorcée [86]. Le modèle émergé suggère que, lors de l'adaptation amorcée, RecG et PriA reconnaissent la structure de la boucle R qui se produit en liant le complexe Cascade : crRNA à l'ADN. En conséquence, Cascade se dissocie de l'ADN, ce qui entraîne l'exposition de régions d'ADN simple brin temporaires qui peuvent stimuler l'acquisition d'espaceurs par Cas1 et Cas2. Comme Cas3 est essentiel pour l'adaptation amorcée, l'activité nucléase de la protéine est susceptible de favoriser la génération de fragments d'ADN qui sont capturés par la machinerie d'acquisition. Au cours de l'adaptation naïve, les dommages à l'ADN sont peut-être induits par Cas1 et conduisent au recrutement du complexe RecBCD comme décrit ci-dessus [85,86].

(b) Régulation des gènes

L'implication des composants CRISPR-Cas dans les processus de régulation cellulaire est devenue plus évidente ces dernières années. Les systèmes CRISPR-Cas de type II semblent jouer un rôle important dans la régulation de la virulence des bactéries pathogènes. Dans Francisella novicida, un complexe ribonucléoprotéique composé de Cas9, de tracrRNA et d'un petit ARN unique associé à CRISPR réprime l'expression d'une lipoprotéine bactérienne (BLP). La régulation négative de la transcription de BLP est cruciale pour l'évasion immunitaire car la protéine peut être reconnue par le système immunitaire de l'hôte. On suppose que le complexe ribonucléoprotéique se lie au blp transcrit conduisant à la dégradation de l'ARNm par Cas9 ou une nucléase inconnue. En conséquence, la BLP est sous-représentée à la surface cellulaire, ce qui entraîne une réponse immunitaire réduite [87]. De la même manière, Neisseria meningitidis souches mutantes dépourvues de cas9 gène a montré de graves défauts de survie dans les cellules épithéliales humaines [87]. Dans Campylobacter jejuni, cas9 les mutants de délétion présentaient moins de cytotoxicité dans les lignées cellulaires humaines. Vraisemblablement, l'absence de C. jejuni Cas9 affecte la composition biochimique de la paroi cellulaire bactérienne et rend ainsi la cellule plus sujette à la liaison aux anticorps [88]. Une protéine Cas2 de type II-B de Legionella pneumophila était crucial pour l'infection des amibes et représente donc une autre fonction liée à la virulence [89]. Transcription d'une baie CRISPR abandonnée (pas de cas opéron) dans Listeria monocytogenes conduit à la stabilisation d'un ARNm partiellement correspondant. Fait intéressant, si la puce CRISPR est retirée du génome, les bactéries ont pu coloniser un foie murin plus efficacement, fournissant la preuve d'une fonction régulatrice de la virulence par un mécanisme d'ARN antisens [90].

La régulation endogène par CRISPR-Cas peut également affecter le comportement de groupe dans une population bactérienne telle qu'identifiée dans le cycle de vie de Myxocoque xanthus. La -préotéobactérie est capable de produire des myxospores pour surmonter les stress environnementaux comme la carence en nutriments. Les myxospores sont produites au cours d'un processus compliqué qui implique un mouvement coopératif et l'agrégation de cellules au sein d'une population. En conséquence, les agrégats cellulaires se différencient en ce que l'on appelle les fructifications qui contiennent les spores. Myxocoque xanthus possède un système CRISPR-Cas de type I-C et des suppressions de cas7 et cas5 conduire à une forte diminution de la sporulation. Il en était de même pour un cas8c suppression qui a en outre entraîné une agrégation cellulaire retardée. De plus, Cas8c stimule la synthèse de FruA, une protéine importante dans la voie de sporulation [91-93]. L'implication mécanique des protéines Cas dans la formation de la fructification reste déroutante car une étude récente a ajouté un autre niveau de complexité en démontrant l'implication d'une puce CRISPR de type III-B dans le développement de la fructification et la production d'exopolysaccharides [94].

(c) Évolution du génome

L'acquisition d'espaceurs d'ADN étrangers est une étape cruciale dans l'immunité CRISPR-Cas et montre la nature adaptative unique de ce système de défense. Il a été largement rapporté que dans certains cas, les espaceurs sont dérivés de leurs propres séquences génomiques. Le ciblage du chromosome, cependant, entraîne des dommages à l'ADN et tuera inévitablement la cellule bactérienne. Alors que l'auto-ciblage des systèmes CRISPR-Cas peut certainement être mortel pour un organisme hôte, plusieurs études ont étudié son rôle potentiel dans l'évolution du génome. Outre les modifications génétiques à petite échelle telles que les mutations dans les séquences PAM chromosomiques, les protoespaceurs ou le cas opéron, de grands réarrangements génomiques ont été observés dans Pectobacterium atrosepticum lorsque les espaceurs correspondent à des séquences dans le propre génome. Ici, un îlot génomique d'environ 100 kb impliqué dans la pathogénicité des plantes a été remodelé ou supprimé [95]. Une étude génomique sur Thermotogales ont révélé l'association des loci CRISPR à des sites d'inversions d'ADN et d'autres réarrangements génétiques. Même si l'implication exacte des puces CRISPR dans la stimulation des altérations génétiques observées reste inconnue, CRISPR semble favoriser ces événements évolutifs [96]. En revanche, une étude bioinformatique a suggéré que l'auto-ciblage des systèmes CRISPR-Cas est un effet plutôt indésirable, car il transmet l'auto-immunité. En conséquence, les systèmes CRISPR-Cas deviennent dégénérés en raison de mutations dans cas gènes et les sites cibles ou par l'inactivation ou la délétion de systèmes CRISPR-Cas entiers qui, en effet, favorise les variations évolutives mais conduit simultanément à une perte de fitness concernant la défense antivirale [97].

5. Importance et applications

L'utilisation de CRISPR-Cas dans les approches thérapeutiques est devenue de plus en plus pertinente dans différents domaines de la médecine. La présence de séquences répétitives entrecoupées de courts espaceurs, appelés plus tard CRISPR, a été exploitée à des fins de diagnostic et de typage simple de Mycobacterium tuberculosis souches [98]. Cela a aidé à comprendre les moyens utilisés par les agents pathogènes pour leur transmission en examinant les différences dans la teneur en espaceurs des souches apparentées [98,99]. Ce spoligotypage (spacer oligotyping) a également été adapté pour Salmonella enterica, Yersinia pestis et Corynebacterium diphteriae [100–105].

L'utilisation de CRISPR-Cas comme outil antimicrobien direct a été étudiée récemment. Les puces CRISPR artificielles ont été conçues pour tuer les bactéries pathogènes en ciblant les gènes de résistance aux antibiotiques ou de virulence. Cette manière élégante ne vise que les souches nocives dans une population bactérienne et permet aux souches non pathogènes de proliférer les agents pathogènes [106–108]. Une étude récente a utilisé des phages lysogènes pour introduire un système CRISPR-Cas dans E. coli, qui cible les gènes de résistance aux antibiotiques. Le réseau a été conçu pour cibler en outre les génomes des phages lytiques conduisant à une immunité contre les phages uniquement des bactéries sensibilisées aux antibiotiques. Plus précisément, les bactéries qui sont peu susceptibles d'acquérir des gènes de résistance aux antibiotiques en raison de leur contenu en espaceurs modifiés sont également résistantes aux phages lytiques. Ainsi, en cas d'infection phagique, seules les souches pathogènes seraient éradiquées de la population [109].

Le potentiel médical des systèmes CRISPR-Cas va au-delà du traitement antimicrobien. L'introduction de modifications efficaces et précises dans les gènes d'un organisme présente la base de l'ingénierie du génome. Des nucléases programmables sont utilisées qui se lient spécifiquement aux régions génomiques et clivent l'ADN à une position souhaitée. Les nucléases à doigt de zinc (ZFN) et les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) ont été largement utilisées pour éditer l'ADN. Les deux outils d'édition du génome reposent sur le même principe : un domaine de liaison à l'ADN spécifique à la séquence, qui fournit la spécificité, est fusionné à une nucléase. En raison de sa simplicité, de son efficacité et de la possibilité de cibler plusieurs sites génomiques simultanément, l'utilisation du système CRISPR-Cas9 est généralement privilégiée par rapport aux systèmes ZFN et TALEN [110-112]. La protéine de défense bactérienne Cas9 est utilisée pour cibler presque toutes les séquences d'ADN souhaitées à l'aide d'un ARN de ciblage. Cet ARN à guide unique (sgRNA) est un hybride modifié du duplex tracrRNA:crRNA naturel et simplifie ainsi son application à des fins d'édition du génome [45].

La réutilisation du système CRISPR-Cas9 pour l'édition du génome exploite les mécanismes de réparation de l'ADN des cellules eucaryotes : après l'introduction d'une rupture d'ADN double brin, la cellule peut réparer les dommages par jonction d'extrémités non homologues (NHEJ). Ce processus est sujet aux erreurs et conduit souvent à des mutations ponctuelles, à des suppressions ou à des décalages de cadre qui modifient le produit du gène et finissent par abolir sa fonction, ce qui est favorisé pour les knock-outs génétiques. L'ingénierie précise du génome, cependant, repose sur une autre voie, appelée réparation dirigée par homologie (HDR), où un morceau d'ADN qui montre une homologie de séquence avec le site cible est utilisé pour réparer l'ADN par recombinaison homologue. Cette courte séquence d'ADN peut héberger n'importe quelle sorte d'insertion ou d'altération, permettant l'intégration de n'importe quelle séquence d'ADN souhaitable sur le site cible [50,113-117] (figure 2une).

Figure 2. Applications de la technologie CRISPR-Cas9. (une) Cas9 est guidé par un sgRNA pour induire une rupture d'ADN double brin à un locus génomique souhaité. Les dommages à l'ADN peuvent être réparés par NHEJ, produisant de courtes insertions ou suppressions aléatoires sur le site cible. Alternativement, une séquence d'ADN qui montre une complémentarité partielle avec le site cible peut être insérée pendant HDR à des fins d'édition précise du génome. (b) Des mutations dans les domaines catalytiques de Cas9 produisent un variant mort (dCas9) qui se lie mais ne clive pas l'ADN. L'approche avec dCas9 est utilisée pour la répression transcriptionnelle en se liant à la région promotrice d'un gène et en bloquant ainsi l'accès pour l'ARN polymérase. De même, dCas9 peut être fusionné à un répresseur transcriptionnel. Les croix rouges représentent l'inhibition de la transcription. (c) La fusion de dCas9 à un activateur transcriptionnel stimule la transcription d'un gène adjacent en recrutant l'ARN polymérase.

Des mutations dans les motifs de nucléase de Cas9 conduisent à une variante «morte» qui est incapable de cliver l'ADN et peut donc être utilisée pour réguler la transcription d'un gène souhaité. En ciblant la région promotrice ou le cadre de lecture ouvert d'un gène, la liaison de l'ARN polymérase est physiquement bloquée et l'élongation de l'ARNm est inhibée. Alternativement, dCas9 peut être fusionné à un répresseur qui contrôle la transcription des gènes (figure 2b). L'activation transcriptionnelle peut être obtenue en fusionnant dCas9 à un activateur de transcription qui recrute l'ARN polymérase et induit l'expression des gènes (figure 2c). Dans certains cas, des knock-downs de gènes sont souhaités plutôt que des knock-outs de gènes, par ex. si le gène ciblé est essentiel [116,118-122]. La méthode CRISPR-Cas9 a également été exploitée pour l'édition de l'épigénome qui permet le contrôle de l'expression des gènes en introduisant des modifications telles que la méthylation de l'ADN ou l'acétylation des histones. Une étude a montré qu'une protéine de fusion de dCas9 et le domaine central de l'acétyltransférase humaine p300 pouvaient activer l'expression génique sur des sites spécifiques [123]. De plus, la fusion de dCas9 avec le répresseur KRAB a été capable d'induire une méthylation au niveau d'amplificateurs spécifiques conduisant à une accessibilité réduite à la chromatine et, ainsi, à un silence de l'expression génique [124]. L'édition précise de l'épigénome a un grand potentiel pour révéler une modification de la chromatine spécifique au site et aide à explorer la régulation de l'expression des gènes qui pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques. D'autres approches, principalement chez les procaryotes, exploitent le complexe effecteur endogène de type I Cascade pour des expériences similaires si la nucléase Cas3 est absente [125-127]. Dans toutes les stratégies de manipulation du génome susmentionnées, l'existence d'un PAM adjacent au site cible est une exigence stricte [9].

Un remodelage précis du génome peut être utilisé pour guérir les variantes génétiques qui causent des maladies génétiques. Les scientifiques ont pu réparer les mutations qui causent la mucoviscidose (FK) en corrigeant le cftr locus dans les cellules souches intestinales cultivées de patients atteints de mucoviscidose [128]. De plus, en utilisant la technique CRISPR-Cas9, un phénotype sain a pu être restauré chez des souris souffrant de tyrosinémie héréditaire, une maladie génétique qui provoque de graves lésions hépatiques [129]. L'édition du génome a également été utilisée pour développer des approches thérapeutiques antivirales. En conséquence, le génome du VIH a été éradiqué avec succès des cellules infectées de manière latente [130]. En effet, une étude récente a démontré que la génération de mutations induites par NHEJ dans le génome viral entraînait des défauts de réplication du virus. Cependant, cela a également conduit à la génération de mutants compétents pour la réplication qui hébergent des mutations sur le site cible et ne sont donc plus ciblés par Cas9 [131]. D'autres études visent à modifier une protéine de surface spécifique appelée CCR5 qui sert de co-récepteur au virus HI pour entrer dans une cellule hôte. mutations dans le ccr5 gène peut empêcher le virus d'infecter une cellule, ce qui conduit à un phénotype hautement résistant mais par ailleurs sain. En fait, modifier le type sauvage ccr5 gène conduit à l'immunité des monocytes et des macrophages contre les infections à VIH [132-134].

La technique CRISPR-Cas9 a encore simplifié les criblages à l'échelle du génome. Ces criblages visent à identifier les gènes impliqués dans certains processus métaboliques ou pathogéniques en abolissant la fonction des gènes et en étudiant le phénotype résultant. Grâce à cette approche, des gènes impliqués dans la croissance tumorale [135] ou véhiculant une sensibilité aux toxines bactériennes [136] ont pu être identifiés. Auparavant, l'interférence ARN (ARNi) était utilisée pour réduire l'expression des gènes d'une manière spécifique à la séquence. Cependant, l'ARNi ne fait que diminuer l'abondance des transcrits, alors que CRISPR-Cas9 permet un knock-out complet des gènes candidats. De plus, le multiplexage (ciblage de plusieurs loci génétiques en même temps) est crucial pour cette approche et peut être réalisé en utilisant une bibliothèque de différents ARNsg qui est généralement délivrée avec Cas9 par un système de vecteur lentiviral [135-138].

6. Perspectives

L'intérêt pour le domaine de CRISPR-Cas a rapidement augmenté ces dernières années. De nombreuses études ont mis en lumière les processus génétiques et biochimiques sous-jacents du système immunitaire procaryote adaptatif, révélant ainsi son potentiel en médecine moderne (encadré 2). Sans aucun doute, la polyvalence des différents systèmes CRISPR-Cas est étonnante et avec la découverte récente de trois nouveaux types, nous venons peut-être de commencer à comprendre pleinement l'importance de CRISPR-Cas en tant que système de défense microbienne. Cependant, de nombreux aspects du système antiviral nécessitent un approfondissement. Le processus d'immunisation qui est accompli par l'incorporation de nouveaux espaceurs dans le réseau CRISPR est toujours l'événement le plus déroutant de l'immunité CRISPR-Cas. La base biochimique précise de l'acquisition de l'espaceur et son degré de conservation parmi les différents types n'ont pas encore été découverts. Par exemple, la fonction de protéines supplémentaires telles que Cas4 et Csn2 qui se sont avérées nécessaires à l'adaptation nécessite une étude plus approfondie. L'adaptation amorcée n'a été observée que dans les systèmes CRISPR-Cas de type I, même si ce processus offre un grand avantage protecteur envers les phages mutés qui échapperaient à l'interférence CRISPR.

Encadré 2. Jalons de la recherche CRISPR-Cas.

Décrits pour la première fois en 1987 comme des séquences répétitives inhabituelles [139], l'intérêt pour les CRISPR et leurs gènes associés a lentement augmenté au cours des années 1990 et au début des années 2000. Initialement supposés participer aux processus de réparation de l'ADN cellulaire et de partition des réplicons, la première preuve que les systèmes CRISPR-Cas présentent un système immunitaire procaryote adaptatif a été fournie en 2005 [4]. Les chercheurs ont été surpris car ils ont découvert que la plupart des séquences intercalées étaient espacées entre des répétitions identiques dérivées d'ADN extra-chromosomique, plus spécifiquement de génomes de phages et de plasmides conjugatifs [4,100,140]. L'hypothèse a finalement été prouvée deux ans plus tard lorsque les scientifiques ont montré l'incorporation de nouveaux espaceurs dans un locus CRISPR-Cas de Streptocoque thermophilus après avoir défié la bactérie avec un bactériophage. Les espaceurs nouvellement acquis ont toujours montré une parfaite complémentarité avec les séquences du génome du phage et ont transmis une résistance à ce phage particulier lors d'une infection ultérieure [1]. L'intérêt de la recherche dans le domaine CRISPR s'est rapidement accéléré, menant à de nouvelles découvertes qui ont aidé à comprendre les mécanismes de base du système immunitaire. En 2008, le traitement du transcrit CRISPR en crRNA matures qui guident le complexe Cascade de la E. coli Le système de type I-E a été validé expérimentalement, donnant également des indices que l'ADN plutôt que l'ARN est ciblé [54]. Ce dernier a été confirmé la même année alors qu'une étude a démontré qu'en effet l'ADN est la molécule ciblée [56]. Cela a conduit les scientifiques à réfléchir au rôle potentiel que ce système immunitaire procaryote pourrait jouer en tant qu'outil de manipulation de l'ADN. Aujourd'hui, CRISPR-Cas9 est un outil fréquemment utilisé à des fins d'édition du génome et des progrès majeurs dans la compréhension des processus biochimiques sous-jacents dans Cas9 guidé par l'ARN ont été présentés ces dernières années. En 2010, des chercheurs ont montré que Cas9 crée une seule cassure double brin à une position précise sur l'ADN cible [63]. Un an plus tard, un aperçu plus approfondi du mécanisme a été fourni lorsque l'implication d'un autre petit ARN, appelé tracrRNA, a été démontrée. La maturation de l'ARNcr nécessite tracrARN ainsi que Cas9 et RNase III [42]. La preuve que le système fonctionnerait de manière hétérologue dans d'autres bactéries a été démontrée en 2011, comme le S. thermophilus Le système CRISPR-Cas de type II pourrait fournir une immunité dans E. coli [141]. D'autres recherches avaient montré certains éléments du système de type II, dont l'implication d'une séquence PAM dans l'interférence [6,26,141] mais la nature du complexe de clivage restait inconnue. En 2012, le tracrRNA, qui était auparavant connu pour être impliqué dans la maturation du crRNA [42], s'est avéré également constituer une partie essentielle du complexe de clivage de l'ADN, le double tracrRNA:crRNA dirigeant Cas9 pour introduire des cassures double brin dans la cible. ADN [45]. Une simplification supplémentaire du ciblage programmé a été obtenue en créant une fusion d'ARN à guide unique de tracrRNA et de crRNA, qui guide Cas9 pour le clivage de l'ADN spécifique à la séquence [45]. Quelques mois après la description de la technologie CRISPR-Cas9 [45], plusieurs publications ont démontré son pouvoir d'éditer les génomes des cellules et organismes eucaryotes, y compris les cellules humaines et murines [116,117].

Un autre aspect déroutant est l'impact des systèmes CRISPR-Cas sur la diversité procaryote. Il a été observé que le système immunitaire protège non seulement contre les phages, mais aussi contre d'autres MGE qui pourraient avoir des effets bénéfiques pour un organisme. En effet, le système natif CRISPR-Cas est réduit au silence en E. coli par la protéine structurante nucléoïde de type histone H-NS [142], soulevant l'idée qu'un système inactif peut être avantageux pour les bactéries. De plus, les systèmes CRISPR-Cas peuvent interférer avec la conjugaison plasmidique et la transformation de bactéries naturellement compétentes [43,143]. Plusieurs études montrent une corrélation négative entre l'apparition de systèmes CRISPR-Cas et la quantité de MGE dans le chromosome, ce qui semble être une limitation aux processus évolutifs et au transfert horizontal de gènes (HGT) [144,145]. Des résultats contradictoires ont été présentés par une analyse évolutive qui n'a trouvé aucune corrélation significative entre l'activité d'un système CRISPR-Cas et le nombre d'événements HGT [146]. Cependant, ces relations doivent être évaluées dans le contexte d'autres facteurs tels que la pression prédatrice, l'apparition d'autres systèmes de défense et les coûts de remise en forme qui sont liés au maintien de la défense adaptative. Il a été déclaré que les bactéries peuvent perdre ou inactiver leurs systèmes CRISPR-Cas lorsqu'elles sont confrontées à une abondance de prédateurs. Dans de tels environnements, la résistance aux phages due, par exemple, à des mutations des récepteurs semble être plus abordable [147]. Plus précisément, des taux de mutation virale élevés rendent l'immunité adaptative obsolète car les coûts d'adaptation à un habitat prédateur dynamique dépassent les avantages immunologiques [148]. Fait intéressant, une autre étude a montré que le simple maintien d'un système CRISPR-Cas sans aucune pression prédatrice peut entraîner un équilibre défavorable concernant les coûts de remise en forme. Ici, une souche de type sauvage a montré des capacités compétitives réduites par rapport à une cas mutant knock-out de gène. Dans le cas de l'infection par le phage, cependant, aucune augmentation des coûts de fitness n'a été observée comme décrit ci-dessus [149] et, démontrant ainsi que ces interactions dynamiques phage-hôte sont très complexes et nécessitent plus d'élaboration dans les futurs travaux scientifiques.

Des recherches supplémentaires sont également nécessaires sur les fonctions non liées à l'immunité des systèmes CRISPR-Cas. De nombreuses études ont révélé leur implication dans plusieurs processus de régulation (voir §4) et des informations plus approfondies sont nécessaires, par exemple, en ce qui concerne l'interaction des protéines Cas avec les composants des voies de réparation et de recombinaison de l'ADN cellulaire.

Outre leur rôle fascinant chez les procaryotes, les systèmes CRISPR-Cas ont sans aucun doute attiré le plus d'attention pour leur potentiel dans les applications médicales et de nombreuses autres applications biotechnologiques telles que l'édition des cultures, le forçage génétique (la capacité de stimuler l'héritage biaisé de gènes particuliers pour modifier une population entière) et synthétique. biologie (les applications non médicales ne sont pas discutées ici voir [150] pour plus de détails). Malgré l'énorme potentiel de la technologie CRISPR-Cas9, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour faire du système un outil applicable et sûr pour des approches thérapeutiquement utiles. Les problèmes difficiles qui subsistent et doivent être résolus à l'avenir incluent le clivage hors cible par Cas9. Les effets hors cible sont une préoccupation majeure lors du remodelage précis du contenu génomique des cellules eucaryotes. Dans certains cas, des altérations génétiques sur des sites non ciblés ont été détectées à des fréquences plus élevées que la mutation souhaitée, ce qui révèle clairement la nécessité d'une plus grande spécificité de la technique [151]. Les stratégies empêchant les effets hors cible comprennent l'injection de Cas9 purifié directement dans une cellule au lieu d'exprimer la protéine recombinante dans la cellule cible. Cette méthode est pratique pour le clivage rapide de la cible, mais conduit également à la décroissance rapide de Cas9, réduisant ainsi la possibilité d'effets hors cible [152,153]. De plus, l'utilisation de deux ARNsg qui ciblent les deux brins de la séquence cible en combinaison avec une variante de coupure d'ADN de Cas9 s'est avérée réduire de manière significative les effets hors cible [154]. D'autres stratégies se concentrent sur l'optimisation des séquences d'ARNsg afin d'obtenir une édition plus fiable. Il a été démontré que la troncature des sgRNA de 2 à 3 nt améliore la spécificité de la cible [155]. De plus, l'ajout de deux nucléotides de guanine à l'extrémité 5', directement à côté de la région complémentaire de la cible de l'ARN guide, pourrait réduire les effets hors cible [156]. Un autre problème qui nécessite une enquête plus approfondie est la livraison globale du système CRISPR-Cas9 dans les cellules souhaitées d'un organisme multicellulaire. Prometteur in vivo les approches comprennent des systèmes de vecteurs viraux et non viraux qui délivrent Cas9 et sgRNA aux cellules souhaitées [110,157]. De plus, ex vivo les concepts reposent sur l'isolement de cellules dérivées de patients qui sont repiquées après l'édition génomique. Un avantage majeur de l'utilisation de cette approche est l'évaluation de l'altération génétique qui a été introduite. Ici, seules les cellules correctement éditées sans mutations malignes hors cible sont choisies pour la transplantation [110,157]. Bien que certains défis subsistent, il semble que ce ne soit qu'une question de temps avant que l'édition du génome basée sur CRISPR-Cas9 devienne une méthode sûre et applicable utilisée dans une variété d'approches thérapeutiques.


Conclusion

L'utilisation de CRISPR-Cas9 pour des études pangénomiques a permis et élargi la nature et l'utilité des criblages génétiques chez l'homme pour corriger et modifier avec précision le génome et représente un moyen potentiel de corriger les mutations causant la maladie [195]. Bien qu'encore à ses balbutiements, le système CRISPR-Cas9 a révolutionné les études de la fonction des gènes et a un impact énorme sur la thérapie génétique en santé humaine. En comparaison avec les techniques de modulation génique précédentes telles que l'ARNi, l'utilisation de CRISPR-Cas9 est plus efficace et hautement spécifique. De plus, le système CRISPR-Cas9 est devenu un puissant outil d'édition de gènes capable de corriger la pathologie liée à l'âge à médiation génique. Suppression des expansions répétées d'hexanucléotides dans le C9ORF72 gène en utilisant le système CRISPR-Cas9 ou en corrigeant le SOD1 ou FUS les mutations génétiques peuvent améliorer respectivement la SLA et la FTD non familières, ou la FALS (Fig. 2). La MA à début précoce peut être traitée en corrigeant des mutations dans PSEN1, PSEN2, et APP, réduisant la génération de bêta-amyloïde. Alors qu'un CRISPR-Cas9 ciblé sur les mitochondries pourrait être utilisé pour inverser ou supprimer les mutations qui s'accumulent avec l'âge. La MP induite par un dysfonctionnement mitochondrial peut être traitée en remplaçant les gènes mutants par les séquences d'origine, empêchant ainsi l'accumulation de la protéine α-synucléine dans les corps de Lewy et les neurites de Lewy, la surexpression de facteurs neurotrophiques facilitant la survie des neurones ou en réduisant les fluctuations motrices du patient en délivrant l'AADC gène dans le putamen des patients parkinsoniens. En outre, les cellules cancéreuses peuvent être ciblées par le système CRISPR-Cas9, avec des KO de Par3L, Src-1 et GPRC6A améliorant respectivement le cancer colorectal, du sein et de la prostate, entraînant une sensibilité accrue à la chimiothérapie, une prolifération plus faible et une mort plus élevée des cellules cancéreuses . Au cours de l'infection, la sécrétion d'interleukine-1 sert de cytokine pro-inflammatoire dans les tissus, empêchant la différenciation des cellules souches et favorisant une dégradation agressive des tissus, entraînant des lésions tissulaires [196]. Lors de niveaux élevés de sécrétion de molécules inflammatoires par le système immunitaire, il devient impératif de cibler ces molécules. En plus de cibler l'IL-1, une autre stratégie consiste à concevoir des cellules souches pluripotentes induites résistantes à l'inflammation (iPSC) en éliminant la voie de signalisation de l'IL-1. Dans ce scénario, CRISPR-Cas9 joue un rôle prometteur car ce système a été largement utilisé pour créer des cellules eucaryotes modifiées avec des altérations de perte de fonction ou de gain de fonction [9, 41]. Des études similaires ont été réalisées sur des cellules de poisson zèbre, des lignées cellulaires tumorales et des cellules dendritiques primaires [34, 197]. Par conséquent, le rôle de la modulation CRISPR-Cas9 semble prometteur dans le ciblage de l'inflammation, en particulier dans les tissus malades et endommagés.La réduction de la production de cytokines pro-inflammatoires par knock-out miR-155 est prometteuse en tant que stratégie thérapeutique à la fois pour la PR et l'inflammation. Alors que le knock-out de MUC18, dans les AEC, a considérablement réduit l'inflammation et peut entraîner une réduction de l'enflure et du blocage des voies respiratoires. Cependant, cette technologie thérapeutique est loin d'être cliniquement approuvée par la FDA en raison des défis et des limites connexes (résumés dans le tableau 1), tels que les effets hors cible, l'efficacité de la transfection et la courte demi-vie [9-13, 15] . Si l'utilisation clinique est réalisée, le système d'édition de gènes CRISPR-Cas9 améliorera la pathologie associée au vieillissement, affectant de nombreuses maladies, réduisant le fardeau de la maladie, la morbidité et la mortalité.


Voir la vidéo: SHERLOCK: A CRISPR Tool to Detect Disease (Janvier 2022).