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Qu'est-ce qu'un motif d'interaction par rapport à la sumoylation des protéines ?


En lisant ce matin sur la sumoylation des protéines, je suis resté bloqué sur les motifs d'interaction sumo et la ligne de motifs de consensus. J'ai entendu le mot motifs pour la première fois. Que signifient les motifs dans ce contexte et Que signifie également le motif de consensus Sumo canonique ΨKx(D/E) ? Pourriez-vous s'il vous plaît élaborer la formule et merci d'avance.


Un motif signifie un motif. Étant donné que les nucléotides et les protéines ont une séquence, ils peuvent avoir des motifs de sous-séquence qui peuvent remplir une sorte de fonction. Par exemple, la boîte TATA dans l'ADN sert d'élément promoteur. De même, les protéines peuvent avoir des motifs de séquence qui peuvent servir de sites de reconnaissance pour les partenaires de liaison (entre autres fonctions). De même, il peut y avoir des motifs structurels dans les protéines, des motifs de réseau dans les grands réseaux, etc.

Dans ce cas, le motif est un motif de séquence.

De Gareau et Lima (2010) :

De nombreuses protéines modifiées par SUMO identifiées contiennent un accepteur Lys dans un KX(D/E) motif de consensus, où ?? est un gros résidu hydrophobe

Ce motif sert de site de reconnaissance pour la SUMO-Ligase.

Ici,

K=Lysine
X=N'importe quel acide aminé
D=Acide aspartique
E=Acide glutamique

A partir des figures ci-dessous (Rodriguez et al., 2000), vous pouvez observer que ?? peut être la leucine (L) (résidu d'origine dans Ran GAP1), l'isoleucine (I), la phénylalanine (F) ou la valine (V).

Je ne suis pas sûr de l'effet des doubles résidus hydrophobes sur le taux de conjugaison SUMO.



SUMOylation régule la transmission synaptique médiée par les récepteurs kainate

La petite protéine modificateur de type ubiqwitine (SUMO) régule l'activité transcriptionnelle et la translocation des protéines à travers la membrane nucléaire 1 . L'identification des substrats de SUMO à l'extérieur du noyau progresse 2 mais on sait encore peu de choses sur le rôle cellulaire plus large de la SUMOylation de la protéine. Nous rapportons ici que dans les neurones hippocampiques du rat, plusieurs cibles de SUMOylation sont présentes au niveau des synapses et nous montrons que la sous-unité du récepteur kainate GluR6 est un substrat de SUMO. La SUMOylation de GluR6 régule l'endocytose du récepteur kainate et modifie la transmission synaptique. GluR6 présente de faibles niveaux de SUMOylation dans des conditions de repos et est rapidement SUMOylé en réponse à un kainate mais pas à un Ntraitement au -méthyl-D-aspartate (NMDA). La réduction de la SUMOylation de GluR6 à l'aide de l'isopeptidase SENP-1 spécifique de SUMO empêche l'endocytose évoquée par le kaïnate du récepteur du kaïnate. En outre, une forme mutée non SUMOylatable de GluR6 n'est pas endocytosée en réponse au kaïnate dans les cellules COS-7. Conformément à cela, les enregistrements électrophysiologiques dans des tranches d'hippocampe démontrent que les courants postsynaptiques excitateurs médiés par le récepteur kaïnate sont diminués par la SUMOylation et améliorés par la déSUMOylation. Ces données révèlent un rôle auparavant insoupçonné de SUMO dans la régulation de la fonction synaptique.

Les récepteurs kainate (KAR) jouent un rôle clé dans la régulation de la transmission synaptique et de l'excitabilité neuronale dans le cerveau des mammifères. Au niveau du terminal présynaptique, ils peuvent moduler la libération des neurotransmetteurs, et au niveau de la membrane postsynaptique, ils contribuent à une transmission synaptique excitatrice rapide 3 . La sous-unité GluR6 est exprimée dans tout le cerveau mais est particulièrement abondante dans l'hippocampe, où les sous-unités GluR6 peuvent être présentes dans les complexes KAR pré- et post-synaptiques 4 .

Nous avons identifié l'enzyme de conjugaison SUMO spécifique Ubc9 et la ligase SUMO PIAS3 (figures supplémentaires 1, 2) en tant qu'interacteurs GluR6a dans un criblage à deux hybrides de levure. Parmi les sous-unités du récepteur ionotrope du glutamate testées, seule GluR6a a présenté une forte interaction avec les deux enzymes (Fig. 1a). Ces interactions ont été vérifiées par co-immunoprécipitation de Ubc9 et PIAS3 avec un anticorps anti-GluR6 (Fig. 1b, c). La mutagenèse par troncature a cartographié le domaine d'interaction GluR6 (Fig. 1b) sur les résidus 882� qui, seuls parmi les sous-unités KAR, contiennent le motif consensus de SUMOylation ΨKXE (réf. 5).

une, L'enzyme de conjugaison SUMO Ubc9 et la ligase SUMO PIAS3 se lient sélectivement au domaine C-terminal de GluR6a dans le test à deux hybrides de levure. Les terminaisons C d'aucune des autres sous-unités du récepteur ionotrope du glutamate testées interagissent fortement avec les deux enzymes, comme déterminé par l'activation du rapporteur β-galactosidase. b, Une série de mutants de troncature chevauchants de l'extrémité C de GluR6a testés dans le test à deux hybrides sur levure a montré que le domaine des deux enzymes de SUMOylation contient le motif de SUMOylation consensus (ΨKXE, où Ψ est le résidu hydrophobe). c, Analyse par immunotransfert (IB) de protéines synaptiques SUMOylées après fractionnement de cerveau de rat. De multiples substrats SUMOylés sont présents dans les fractions synaptiques. Une quantité égale de protéines (40 μg de protéines par piste) de chaque fraction a été chargée. P1, fraction nucléaire brute P2, fraction membranaire brute post-nucléaire S3, cytosol P3, microsomes My, myéline Mt, mitochondries Syn, synaptosomes PSD, fraction de densité post-synaptique. L'immunotransfert sondé avec un anticorps anti-PSD95 est présenté ci-dessous (protéine 2 μg par piste). Nous notons que le transfert PSD95 est chargé avec de très faibles niveaux de protéines pour éviter la saturation du signal dans les voies de fraction de densité synaptique et postsynaptique hautement enrichies. , Immunoblots montrant les formes SUMOylées et non SUMOylées de GluR6a dans un homogénat cérébral. A noter qu'en l'absence de l'inhibiteur de cystéine protéase NEM, aucune bande détectable correspondant au SUMOylé GluR6a n'a été observée, ce qui confirme que l'adduit SUMO est très labile et sensible à la déconjugaison. e, Immunoblots montrant des formes SUMOylées et non SUMOylées de GluR6a dans des neurones hippocampiques en culture. Des expériences d'immunoprécipitation (IP) utilisant un anticorps anti-SUMO-1 révèlent qu'une fraction de GluR6a est SUMOylée dans des neurones hippocampiques en culture (panneau de droite). IgG, immunoglobuline. Les transferts sont représentatifs d'au moins quatre expériences distinctes. F, g, Colocalisation de surface peu fréquente mais ponctuée (F) et GluR6 total (g) avec SUMO total (en vert) dans des neurones hippocampiques en culture non stimulés. Nous notons que SUMO est fortement concentré dans le compartiment nucléaire, conformément à son rôle décrit dans la fonction nucléaire, mais montre également clairement une distribution ponctuée le long des dendrites. Les pointes de flèche indiquent la colocalisation. Barre d'échelle, 20 μm. h, Quantification de la population de récepteurs GluR6 de surface et totale qui colocalise avec le SUMO-1 total dans les neurones hippocampiques cultivés non stimulés, comme indiqué dans F et g. Les puncta correspondant au GluR6 colocalisé avec le marquage SUMO-1 ont été quantifiés à l'aide du logiciel LSM510 version 3.2 (Zeiss). L'analyse a été faite à partir d'au moins huit cellules pour chaque condition et donnée en pourcentage ± s.e.m.

Nous avons ensuite sondé les fractions subcellulaires avec des anticorps anti-SUMO-1 spécifiques (figure 1c, figures supplémentaires 3, 5). De multiples protéines conjuguées à SUMO ont été détectées dans toutes les fractions, y compris des niveaux élevés dans les fractions de densité synaptosomale et postsynaptique (Fig. 1c). La SUMOylation est facilement réversible 6 , nous avons donc évalué les effets de l'inhibiteur de la cystéine isopeptidase N-éthylmaléimide (NEM) 7 . La détection des protéines SUMOylées était nettement réduite en l'absence de NEM (Fig. 3a supplémentaire). De plus, dans les extraits de cerveau, une bande distincte de GluR6 de masse moléculaire plus élevée a été détectée en présence de NEM (Fig. 1d). Une bande GluR6 spécifique a également été détectée dans des immunoprécipités d'anticorps anti-SUMO à partir de cultures (figure 1e, figure supplémentaire 5a) confirmant en outre que GluR6 est SUMOylé dans les neurones hippocampiques. En tant que témoin, le substrat connu de SUMO RanGAP1 a également été récupéré dans des immunoprécipités de SUMO (Fig. 4a, c). Fait intéressant, cependant, le GluR6 exprimé en surface par SUMOylée n'a pas été détecté dans les neurones cultivés au repos (Fig. 1e). Conformément aux données sur les deux hybrides de levure, aucun décalage de bande correspondant en présence de NEM n'a été observé pour la sous-unité du récepteur AMPA GluR1 (figure 1e, figure supplémentaire 4b).

Comme prévu, nous avons trouvé des niveaux élevés d'immunoréactivité SUMO dans le noyau des neurones en culture. L'immunoréactivité de SUMO était également distribuée dans les dendrites (Fig. 1f–h), où elle présentait une distribution ponctuée similaire à celles de GluR6, Ubc9 et PIAS3 (Fig. 1d, e) et était présente au niveau des synapses positives pour PSD95 (Fig. 2a, b). Dans des conditions basales, il y avait de faibles niveaux de colocalisation de GluR6 et SUMO-1 exprimés en surface (5,3 à 10,8 %), mais il y avait un chevauchement limité entre l'immunoréactivité totale de GluR6 et de SUMO-1 (28,6 à 11,5 % Fig. 1f–h), indiquant que la plupart des GluR6 SUMOylés sont intracellulaires. Le faible niveau de colocalisation entre la surface GluR6 et SUMO-1 est compatible avec seulement une petite fraction du substrat étant SUMOylée à un moment donné 6,8.

L'application de kainate ou de NMDA évoque l'internalisation de GluR6 dans des voies de tri distinctes 9 . Nous avons donc testé les effets de ces agonistes sur la SUMOylation de GluR6 dans des expériences d'immunoprécipitation. Kainate (10 μM) a rapidement augmenté le faible niveau basal de GluR6 SUMOylation (Fig. 2a, b). Cela était détectable après 1 min (données non présentées), augmenté de Ϣ fois (2,4ଐ.4, Pπ.001) à 3 min et atteint la conjugaison maximale en 10 min (3.4ଐ.4, Pπ.001). Le glutamate (1 mM) a également eu des effets similaires (Fig. 6 supplémentaire). Malgré une forte internalisation évoquée par le NMDA 9, il n'y a pas eu d'augmentation de la SUMOylation de GluR6 (Fig. 2a, b). Ni le kainate ni le NMDA n'ont modifié la SUMOylation cellulaire globale (Fig. 7). De même, dans les tests immunocytochimiques, la colocalisation entre SUMO-1 et GluR6 internalisé était de 46,7ଓ,0% à 3 min et de 54,1ଔ,9% à 30 min après l'ajout de kainate mais seulement 15,9଑,8% à 3 min et 16,7଑,7% à 30 min après l'ajout de NMDA (Fig. 2c–h).

une, L'immunoprécipitation de la protéine SUMOylée et l'immunotransfert pour GluR6 montrent que l'application de 10 μM kainate augmente considérablement la SUMOylation de GluR6 d'une manière dépendante du temps. En revanche, 30 μM NMDA ne modifie pas l'état de SUMOylation de GluR6. Les panneaux inférieurs montrent un immunoblot de l'actine totale β comme contrôle de la charge protéique. b, Quantification de la SUMOylation de GluR6 induite par le kainate et le NMDA montrée dans une. Les données proviennent de quatre expériences distinctes et montrent une moyenne ± s.e.m. *Pπ.01 et ***Pπ.001 par rapport aux témoins non stimulés. ce, Colocalisation de SUMO-1 et GluR6 endocytosé 3 min après 10 μM kainate (c) ou 30 μM NMDA () stimulation. Une proportion importante de GluR6 intériorisé (rouge) colocalise comme indiqué par les pointes de flèche (jaune) avec SUMO-1 (vert) après 3 min de stimulation kainate, alors que peu de récepteurs internalisés (‘int’) colocalisent avec SUMO-1 lors de l'application NMDA, tel que quantifié en e. Les données indiquent la moyenne ± s.e.m. de trois expériences indépendantes. ***Pπ.0001 par rapport à la stimulation NMDA (t-test). Fh, Colocalisation de SUMO-1 et GluR6 endocytosé 30 min après 10 μM kainate (F) ou 30 μM NMDA (g) stimulation. Une grande proportion de GluR6 internalisé (rouge) en réponse à la stimulation kainate colocalise (pointes de flèches jaunes) avec le marquage SUMO (vert) alors que peu de récepteurs internalisés colocalisent avec SUMO lorsque les neurones sont stimulés avec NMDA. h, Quantification du pourcentage de GluR6 internalisé qui colocalise avec SUMO-1 en réponse à l'activation du récepteur kainate ou NMDA. Les données indiquent la moyenne ± s.e.m. de trois expériences indépendantes. ***Pπ.0001 par rapport à la stimulation NMDA (t-test).

Pour explorer le rôle de la SUMOylation dans l'endocytose GluR6 évoquée par l'agoniste, nous avons exprimé l'isopeptidase SENP-1 spécifique de SUMO marquée par la protéine fluorescente verte (GFP) (réf. 10) pour faciliter la déSUMOylation ou son mutant ponctuel inactif SENP-1 C603S (réf. 11) (Fig. 8 supplémentaire). SENP-1, mais pas SENP-1 C603S, a empêché l'internalisation de GluR6 évoquée par le kaïnate mais n'a eu aucun effet sur l'internalisation de GluR6 évoquée par le NMDA (Fig. 3a, b). Ainsi, la SUMOylation de GluR6 est requise pour l'internalisation évoquée par le kaïnate et se produit probablement au niveau de la membrane plasmique. Parce que nous n'avons pas détecté de SUMOylation GluR6 à la surface (Fig. 1e), nous avons pensé que l'internalisation se produit rapidement après SUMOylation. Conformément à cela, nous avons détecté le GluR6 SUMOylé en surface en présence de saccharose qui bloque l'endocytose KAR (Fig. 9 supplémentaire).

une, Effet de l'application de kainate (10 μM) et de NMDA (30 μM) pendant 30 min à 37 ଌ sur l'endocytose de GluR6 évaluée par des tests d'immunofluorescence 9 (voir Méthodes). Le GluR6 internalisé est indiqué en rouge et les récepteurs de surface marqués restants sont visualisés en bleu. Le marquage vert représente la fluorescence due à l'expression de GFP à partir de neurones hippocampiques transduits pendant 24 h avec le virus sindbis exprimant soit la forme active de SENP-1 (GFP-SENP-1-WT) soit sa forme mutante ponctuelle inactive (GFP-SENP- 1-C603S). La surexpression de SENP-1 n'empêche pas l'endocytose de GluR6 induite par la stimulation NMDA, indiquant une implication spécifique de la voie de SUMOylation dans l'endocytose KAR induite par un ligand. Barre d'échelle, 20 μm. b, Quantification de l'endocytose GluR6 exprimée en unités arbitraires (a.u.) correspondant au rapport entre le marquage GluR6 internalisé et total comme indiqué dans une. Les données proviennent de trois expériences distinctes et montrent une moyenne ± s.e.m. *P < 0,001 par rapport aux neurones non infectés non traités **P < 0,01 par rapport à GFP-SENP-1-WT non traité ***P < 0,001 par rapport à la GFP non traitée–SENP-1-C603S #P < 0,001 par rapport aux neurones non infectés stimulés par le kaïnate §P < 0,001 par rapport à la GFP-SENP-1-C603S stimulée par le kaïnate §§P < 0,001 par rapport à GFP-SENP-1-WT non traité ##Pπ,001 par rapport à des neurones non infectés non traités. c, Essai de SUMOylation bactérienne. L'extrémité C de GluR6a mais pas de GluR6a K886R est SUMOylée dans un système bactérien recombinant (voir Méthodes pour plus de détails). g, GluR6a de type sauvage marqué YFP (, e) et les sous-unités mutantes ponctuelles GluR6a-K886R (e, F) ont été transitoirement transfectées dans des cellules COS-7 et colorées avec un anticorps anti-SUMO-1 (rouge). Les cellules ont été exposées à 100 μM kainate à 37 ଌ pendant 10 min (e, g) pour déclencher l'endocytose. Les cellules témoins non traitées sont présentées dans et F. Panneaux de droite dans g sont des agrandissements des cases hachurées dans les panneaux de gauche de g. Barre d'échelle, 10 μm. h, Immunoblots représentatifs montrant l'évolution dans le temps de l'endocytose des récepteurs mutants YFP–GluR6a de type sauvage et YFP–GluR6a-K886R après une stimulation par kainate. Des expériences ont été réalisées sur des cellules COS-7 transfectées de manière transitoire en utilisant des tests de biotinylation (voir Méthodes pour plus de détails). i, évolution dans le temps de l'endocytose du récepteur de type sauvage GluR6a induite par le kaïnate et du récepteur mutant ponctuel K886R mesurée par un test de biotinylation à partir de h. Chaque point de temps représente la moyenne ± s.e.m. de quatre expériences indépendantes.

Nous avons ensuite fait du glutathion S-transférase (GST) fusions des domaines carboxy-terminaux de type sauvage (WT) et K886R GluR6a pour l'expression dans un test de SUMOylation bactérien 12 pour déterminer si K886 dans le motif consensus de SUMOylation sur GluR6a est le site de SUMOylation. Le GluR6a C-terminal de type sauvage, mais pas K886R, était fortement SUMOylé (Fig. 3c). Pour évaluer le rôle de la SUMOylation K886 dans l'endocytose KAR, nous avons comparé les propriétés du GluR6a de type sauvage et K886R marqué avec une protéine fluorescente jaune (YFP). Le type sauvage et le K886R YFP–GluR6a présentent des propriétés de canal fonctionnel similaires dans les cellules COS-7 (données non présentées). La YFP de type sauvage a été exprimée en surface dans des cellules de rein de singe vert africain (COS-7) avec une colocalisation minimale avec SUMO-1 dans des cellules non stimulées (Fig. 3d). Kainate a causé une perte dramatique de surface YFP–GluR6a et une forte colocalisation avec SUMO-1 dans les compartiments périmembranaires (Fig. 3e). YFP–GluR6a-K886R a également fait l'objet d'un trafic vers la membrane plasmique (Fig. 3f), mais sa distribution était inchangée par le kainate (Fig. 3f, g). L'exigence de K886 pour l'internalisation évoquée par le kainate a été en outre confirmée par des expériences de biotinylation de surface (figure 3h, i) et d'alimentation en anticorps (figure supplémentaire 10). Kainate a évoqué une endocytose massive de YFP–GluR6a de type sauvage (72,9଑,8% à 30 min) mais l'internalisation de YFP–GluR6a-K886R est restée la même que l'endocytose constitutive dans des conditions non stimulées (12,4ଐ,6% par rapport à 11,3ଐ,9% en présence de kainate à 30 min).

Pour identifier un rôle physiologique pour GluR6 SUMOylation, nous avons étudié les KAR postsynaptiques au niveau de la synapse des fibres moussues 13-15. Dans des conditions basales stables, pharmacologiquement isolées, médiées par KAR, des courants postsynaptiques excitateurs évoqués synaptiquement (KAR-EPSC) ont été enregistrés à partir de neurones CA3 dans des tranches d'hippocampe (Fig. 4a). L'infusion de SUMO-1 dans le neurone CA3 a provoqué une réduction rapide de l'amplitude de KAR-EPSC (97 % et 77 % de contrôle à 18 % contre SUMO-1 Pπ.05). Le mutant SUMO-1-ΔGG inactif en conjugaison n'a eu aucun effet (100ଖ% et 77ଖ% SUMO-1-ΔGG versus SUMO-1 Pπ.05) (Fig. 4a, b, g). La perfusion de SENP-1 recombinant a augmenté le KAR-EPSC (contrôle à 98 % et 145 % à 113 % contre SENP-1 Pπ.05). L'infusion du mutant SENP-1 C603S inactif n'a eu aucun effet (91 % et 145 % de SENP-1 C603S contre SENP-1 Pπ.05) (Fig. 4c, d, g). Les EPSC médiées par les récepteurs AMPA enregistrées au niveau de la même synapse n'ont pas été affectées par SUMO-1 ou SENP-1 (contrôle à 89 % et 101 % et 101 % contre SUMO-1 101 % et contrôle à 91 % b113% par rapport à SENP-1 Fig. 4e–g) ou au niveau des synapses collatérales de CA1 Schaffer (Fig. 11 supplémentaire).La cinétique de désintégration du KAR-EPSC était également inchangée par SUMO-1 (τ=30,3଒,1 ms pendant les 2 premières minutes d'enregistrement et 28,9଑,7 ms pendant les 5 dernières minutes, m=11) ou SENP-1 (τ=26,8଒,1 ms pendant les 2 premières minutes d'enregistrement et 25,6± 1,6 ms pendant les 5 dernières minutes, m=11).

une, L'inclusion de 4,2 μM de protéine SUMO-1 active dans la pipette de patch a provoqué une diminution significative de l'EPSC médiée par KAR par rapport aux expériences de contrôle entrelacées. Les réponses pour chaque cellule sont normalisées à la première minute après la rupture de la membrane. Les exemples de traces sont pris comme la moyenne de la première minute (noir) et 15� min (rouge). Les barres d'échelle sont de 50 pA (vertical) et 100 ms (horizontal). b, Identique à a mais le contrôle contient 4,2 μM du mutant SUMO-ΔGG inactif pour la conjugaison. c, L'inclusion de 100 nM de SENP-1 a provoqué une augmentation significative de l'EPSC par rapport aux expériences de contrôle entrelacées. Les exemples de traces sont pris comme la moyenne de la première minute (noir) et 15� min (rouge). Les barres d'échelle sont de 50 pA et 100 ms. , Pareil que c mais le contrôle interne contient 100 nM du mutant inactif SENP-1-C603S. e, les EPSC médiées par les récepteurs AMPA n'ont pas été affectées par l'inclusion de 4,2 μM SUMO actif. F, les EPSC médiées par les récepteurs AMPA n'ont pas été affectées par l'inclusion de 100 nM de SENP-1. g, Quantification des résultats présentés dans unee. Signification statistique indiquée par * (P < 0,05, non apparié t-test). h, Un retard de 10 minutes dans le début de la stimulation synaptique a provoqué une réduction similaire dans les expériences de contrôle EPSC kainate aux expériences de contrôle entrelacées, où dans les deux cas la pipette contenait 4,2 μM SUMO actif (69 ± 10 % contre 61 ± 9 % 15&# x0201320 min après le début de la stimulation). Norme, normalisé. Toutes les barres d'erreur sont des moyens ± s.e.m.

Nous avons également perfusé SUMO-1 pendant 10 min avant la stimulation synaptique pour déterminer si la conjugaison de SUMO-1 seule est suffisante pour induire une diminution de l'amplitude KAR-EPSC. Après le délai de 10 minutes, la réduction de l'amplitude de KAR-EPSC était similaire à celles enregistrées immédiatement après la rupture de la membrane (Fig. 4h), indiquant que ce processus dépend de l'activité car la liaison à la fois à SUMO-1 et à l'agoniste est requise pour la dépression de l'EPSC.

Nos données indiquent que l'action coïncidente de la liaison agoniste et de la SUMOylation à la surface GluR6a conduit à l'endocytose rapide des KAR. L'observation que SENP-1 provoque une augmentation de l'amplitude KAR-EPSC implique que lorsque l'élimination des KAR est inhibée, il y a exocytose et diffusion latérale des KAR dans la synapse, comme indiqué pour les récepteurs AMPA 16,17. De plus, l'endocytose GluR6 stimulée par le NMDA est indépendante de SUMO-1, il doit donc y avoir plusieurs voies d'endocytose et d'exocytose KAR.

La régulation SUMO-1 des KAR peut être importante pour réguler la réponse des neurones à la libération de glutamate dans des conditions telles que l'ischémie. Fait intéressant, il a été démontré que les niveaux d'ARN messager SUMO-1 sont considérablement augmentés dans les cellules ischémiques 18 . Parce que GluR6 est chroniquement régulé à la baisse par le stress excitotoxique via un mécanisme dépendant de c-fos 19, une possibilité intéressante est que la régulation à la hausse des niveaux de SUMO entraîne une régulation à la baisse des KAR, réduisant ainsi l'excitabilité neuronale. Les mécanismes par lesquels la SUMOylation de GluR6 conduit à l'internalisation ne sont pas clairs, mais il semble probable que la régulation des protéines interagissantes 20,21 puisse être impliquée.

Nos résultats, combinés à la diversité des fonctions que SUMO remplit dans le noyau et le cytoplasme, suggèrent que cette modification covalente des protéines est susceptible de réguler les fonctions de nombreuses protéines synaptiques différentes. Nous prévoyons que la SUMOylation synaptique représente un nouveau mécanisme qui aura des implications de grande envergure pour la compréhension de la fonction synaptique.


Paralogues du SUMO

La levure exprime un seul paralogue SUMO, appelé Smt3p dans Saccharomyces cerevisiae. Les cellules de mammifères expriment trois paralogues majeurs de SUMO, appelés SUMO-1, SUMO-2 et SUMO-3. SUMO-2 et SUMO-3 sont identiques à 95 % l'un à l'autre. Dans la plupart des contextes, SUMO-2 et SUMO-3 ne peuvent pas être distingués, et ici nous les appelons collectivement SUMO-2/3. SUMO-2 et SUMO-3 sont chacun ∼ 45% identiques à SUMO-1, et tous les paralogues mammifères sont ∼ 45% identiques à Smt3p.

Il existe plusieurs différences importantes entre les paralogues SUMO mammifères. Premièrement, certaines cibles SUMO sont conjuguées uniquement à SUMO-1, d'autres uniquement à SUMO-2/3, et d'autres encore à tous les paralogues SUMO (Vertegaal et al., 2006). Deuxièmement, la concentration cellulaire globale de SUMO-2/3 est supérieure à celle de SUMO-1, tout comme le pool de protéines libres disponibles pour la conjugaison (Saitoh et Hinchey, 2000). Il est donc probable que la majeure partie de la SUMOylation implique SUMO-2/3. Troisièmement, SUMO-1 et SUMO-2/3 présentent des schémas de localisation subcellulaire différents (Ayaydin et Dasso, 2004 Zhang et al., 2008). Quatrièmement, les expériences de photoblanchiment suggèrent que SUMO-1 est moins dynamique que les autres paralogues SUMO et que son modèle de conjugaison réagit différemment au choc thermique et au stress (Ayaydin et Dasso, 2004 Saitoh et Hinchey, 2000).

Smt3p, SUMO-2 et SUMO-3 peuvent former des chaînes conjuguées via une seule lysine acceptrice conservée (Bylebyl et al., 2003 Tatham et al., 2001). SUMO-1 n'a pas de résidu lysine équivalent et n'agit donc probablement pas comme un lien dans l'allongement des chaînes in vivo. Cependant, SUMO-1 pourrait terminer des chaînes allongées par conjugaison en série de SUMO-2/3 (Matic et al., 2008). Notamment, bien que SUMOylation ne semble pas s'appuyer sur la géométrie des liaisons de chaîne pour conférer des informations, comme le fait l'ubiquitylation (Pickart et Fushman, 2004), les conjugués SUMO construits à partir de différents paralogues ou avec différentes longueurs de chaîne peuvent spécifier des destins cibles distincts, comme discuté ci-dessous .


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3. PCNA glissant sur l'ADN

Afin de comprendre le mécanisme de glissement, les données structurelles ont été combinées avec des simulations de dynamique moléculaire [28]. Les simulations ont présenté une inclinaison plus prononcée de l'ADN, à environ 30 000b0, et une plus grande partie de l'ADN interagissant simultanément avec deux protomères du trimère par rapport à la structure cristalline. Pourtant, les résidus basiques dans le canal PCNA ont établi des interactions de courte durée avec les phosphates de l'ADN et ont basculé entre les phosphates adjacents de manière non coordonnée. Les données suggèrent un mécanisme de glissement du PCNA le long de l'ADN : lorsqu'un nombre suffisant de contacts polaires sont établis avec des groupes phosphates adjacents de l'ADN, l'anneau tourne sur l'ADN, ce qui entraîne un avancement d'une paire de bases. Par conséquent, le patch conservé de résidus basiques sur la paroi interne permet à PCNA de suivre en rotation le pas hélicoïdal par diffusion en spirale, qui est appelée diffusion en roue dentée 𠇌ogwheel” ( Figure 3 a). Ce processus maintient les contacts ADN-protéine et maintient l'orientation de la pince invariante par rapport à l'ADN [29]. Ces résultats sont cohérents avec les études précédentes sur une seule molécule, qui ont montré deux modes de glissement du PCNA le long de l'ADN. Dans un mode, la pince suit le pas hélicoïdal du duplex d'ADN, entraînant une rotation de la protéine autour de l'ADN. Dans le second mode, moins fréquent, la protéine diffuse par traduction à des vitesses plus élevées [30].

PCNA humain glissant le long de l'ADN. (UNE) Mode de diffusion à crémaillère : la rotation du PCNA suit l'ADN à travers un mouvement en spirale, établissant des interactions transitoires avec l'ADN, ce qui maintient l'orientation de la pince invariante par rapport à l'ADN. L'axe de rotation triple du PCNA autour de l'axe hélicoïdal de l'ADN. Dans le panneau inférieur, l'évolution des contacts PCNA𠄽NA pendant le glissement de la roue dentée est illustrée. Les chaînes latérales en interaction peuvent basculer rapidement et de manière aléatoire entre les phosphates adjacents (indiqués par les lignes fines et épaisses), permettant au PCNA d'avancer le long du squelette du phosphate par des mouvements de rotation et d'inclinaison. (B) Mode de diffusion translationnelle : PCNA se déplace le long de l'ADN, sans entrer en contact avec l'ADN. (Figure adaptée de [28]).

En raison de la symétrie clamp, l'ADN peut interagir avec trois sites équivalents de PCNA. La commutation de site est générée par 120 rotations autour de l'axe triple de l'anneau et nécessite l'interruption et le réarrangement ultérieur de l'interface ADN de la pince (Figure 3 b). Ainsi, l'échange occasionnel d'ADN entre les trois positions peut expliquer la composante traductionnelle du glissement du PCNA observée dans les études sur une molécule unique [30].

On s'attend à ce que le PCNA soit présent sur l'ADN en l'absence de partenaires de liaison, au moins de manière transitoire. Par exemple, lors de la réplication du brin retardé, la polymérase doit s'écarter de la pince lors de l'achèvement d'un fragment d'Okazaki, laissant le PCNA sur le fragment terminé. La polymérase peut ensuite s'associer à une autre pince chargée sur un nouveau site amorcé, tandis que le PCNA laissé peut se lier à d'autres partenaires pour un traitement ultérieur des fragments d'Okazaki. Le principal mécanisme de glissement, le glissement de la roue dentée, confère à l'anneau PCNA une orientation inclinée par rapport à l'ADN, ce qui est considéré comme important pour des rencontres productives avec les enzymes. Le maintien ou non du mode de glissement de la roue dentée primaire lorsque PCNA est lié à différents partenaires pourrait être élucidé par des expériences sur une molécule unique.

Les résidus basiques à l'interface de glissement sont essentiels pour établir une orientation définie du PCNA par rapport à l'ADN, ce qui peut être requis par l'holoenzyme Pol δ pour assembler et initier l'élongation des fragments d'Okazaki amorcés [27]. De plus, il a été rapporté que la surface de glissement de l'ADN peut être modulée par des acétylations spécifiques de la lysine pour contrôler la réponse aux dommages de l'ADN [31], et par la liaison du facteur PCNA p15 [32]. L'acétylation de la lysine supprime les charges positives sur la face interne du PCNA et devrait favoriser le mode de translation par rapport au mode de roue dentée, ce qui entraîne un glissement plus rapide sans inclinaison préférée. Si cette inclinaison est nécessaire pour des rencontres productives avec l'holoenzyme Pol δ, l'allongement des fragments d'Okazaki amorcés sera compromis. À l'appui de cette prédiction, il y a l'observation que les mutations de deux lysines conservées à l'interface PCNA-ADN de levure ont complètement altéré la fonction de la polymérase de levure dans la réplication des modèles d'ADN circulaires [33]. La liaison de p15 resserre l'emprise du PCNA sur l'ADN et défavorise probablement le mode de traduction. Par conséquent, bien que moins étudiée que la surface externe, la partie interne du PCNA est également conservée au cours de l'évolution, hautement régulée et cruciale pour le rôle du PCNA dans la fourche de réplication [28,33].


La voie convergente de la SUMOylation des protéines dans la signalisation des phytohormones : faits marquants et nouvelles frontières

L'intersection des voies de signalisation des phytohormones avec SUMOylation, une modification post-traductionnelle clé, offre une couche supplémentaire de contrôle à la signalisation des phytohormones pour une régulation sophistiquée du développement des plantes.

Résumé

Les plantes vivent dans un environnement en constante évolution qui est souvent difficile pour la croissance et le développement des plantes. Les phytohormones jouent un rôle essentiel dans la modulation des changements au niveau moléculaire pour permettre aux plantes de résister aux aberrations climatiques. L'orchestration de telles réponses moléculaires efficaces implique une régulation rapide de la signalisation des phytohormones aux niveaux transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel. Les modifications post-traductionnelles sont apparues comme un acteur clé dans la modulation des voies hormonales. La revue actuelle met l'accent sur le rôle de la SUMOylation, une modification post-traductionnelle clé, dans la manipulation des voies de signalisation hormonales individuelles pour une meilleure adaptabilité des plantes. Ici, nous discutons des récents progrès dans le domaine et soulignons comment SUMO cible les principaux intermédiaires de signalisation, y compris les facteurs de transcription, pour fournir une réponse rapide à différents stress biotiques ou abiotiques, parfois même avant des changements dans les niveaux d'hormones. La compréhension de la convergence de la SUMOylation et des voies hormonales offrira une couche supplémentaire de contrôle à la signalisation phytohormonale pour une régulation complexe et sophistiquée du développement des plantes et pourra être utilisée comme un outil pour générer des cultures résilientes au climat.


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Conclusion

En résumé, dans ce travail, nos résultats décrivent un profil de développement général relativement cohérent pour la régulation des protéines de la machinerie SUMO et des substrats SUMOylés, avec des variations régionales entre le cerveau et le cervelet. Cette image globale fournit un contexte clair pour de futures études axées sur la façon dont les protéines spécifiques de la machinerie SUMO ou les protéines substrats de SUMOylation définies dans différentes régions du SNC et compartiments cellulaires sont régulées individuellement au cours du développement.


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La SUMOylation induite par le zinc de la protéine 1 liée à la dynamine protège le cœur contre les lésions d'ischémie-reperfusion

Fond. Le zinc joue un rôle dans la mitophagie et protège les cardiomyocytes des lésions d'ischémie/reperfusion. Cette étude vise à déterminer si la SUMOylation de Drp1 est impliquée dans la protection de l'ion zinc sur les lésions cardiaques I/R. Méthodes. Des cœurs de souris ont été soumis à 30 minutes d'ischémie régionale suivies de 2 heures de reperfusion (ischémie/réoxygénation (I/R)). La taille de l'infarctus et l'apoptose ont été évaluées. Les cellules HL-1 ont été soumises à 24 heures d'hypoxie et 6 heures de réoxygénation (hypoxie/réoxygénation (H/R)). Le zinc a été administré 5 min avant reperfusion pendant 30 min. Le plasmide de surexpression SENP2 (Flag-SENP2), le plasmide de mutation Drp1 (Myc-Drp1 4KR) et l'ARNsi SUMO1 ont été transfectés dans des cellules HL-1 pendant 48 h avant l'hypoxie. Les effets du zinc sur les membres de la famille SUMO ont été analysés par Western blot. SUMOylation de Drp1, apoptose et effondrement du potentiel membranaire mitochondrial (

) et la mitophagie ont été évaluées. Résultats. Par rapport au contrôle, le niveau de modification SUMO1 des protéines dans le H/R a diminué, tandis que cet effet a été inversé par le zinc. Dans le cadre de H/R, le zinc a atténué l'apoptose myocardique, qui a été inversée par l'ARNsi SUMO1. Des effets similaires ont été observés chez les souris SUMO1 KO exposées à H/R. De plus, la protéine 1 associée à la dynamine (Drp1) est une protéine cible de SUMO1. La SUMOylation de Drp1 induite par la mitophagie régulée par le zinc et a contribué à l'effet protecteur du zinc sur les lésions H/R. Conclusion. La SUMOylation de Drp1 a joué un rôle essentiel dans la protection cardio induite par le zinc contre les blessures I/R. Nos résultats fournissent une approche thérapeutique prometteuse pour les lésions aiguës du myocarde I/R.

1. Introduction

Les lésions d'ischémie-reperfusion myocardique (I/R) entraînent diverses conséquences graves, notamment une fibrillation ventriculaire, une rupture cardiaque et une mort subite. Actuellement, il existe peu d'interventions efficaces pour protéger le cœur contre les lésions d'ischémie-reperfusion [1]. Sheng et al. [2] ont constaté que les niveaux de zinc diminuaient dans les cardiomyocytes lors de la reperfusion et que l'ion zinc est l'un des oligo-éléments essentiels pour l'organisme. Le zinc était impliqué dans la régulation de plus de 100 protéases, la stabilité structurelle des membranes cellulaires et des organites, et la régulation des voies de signalisation dans divers processus physiopathologiques [3]. De plus, les niveaux de divers transporteurs de zinc maintiennent l'homéostasie du zinc pendant la réoxygénation. Les niveaux de protéines de ZnT1, ZnT2, ZnT5 et ZnT9 ont diminué et les niveaux de protéines de Zip2, Zip7, Zip13 et Zip14 ont augmenté [4]. Ceux-ci ont indiqué que les ions zinc endogènes jouaient un rôle important dans les lésions d'ischémie-reperfusion myocardique. De même, des cœurs de rats isolés traités avec des ions zinc exogènes pendant la reperfusion ont réduit la taille de l'infarctus du cœur par certaines voies de kinase, et les cardiomyocytes de rat H9c2 traités avec des ions zinc pendant la réoxygénation ont également réduit les dommages aux cellules du myocarde [5]. Il est indiqué que les ions zinc exogènes protègent également le myocarde des dommages I/R ou H/R. Cependant, le mécanisme exact de protection des ions zinc doit être exploré plus avant.

Au cours des dix dernières années, un certain nombre d'études ont montré que la SUMOylation est impliquée dans la détermination du devenir du cœur perfusé [6, 7]. Actuellement, il existe cinq paralogues SUMO mammifères (SUMO1, SUMO2, SUMO3, SUMO4 et SUMO5). L'homologie structurelle primaire des protéines SUMO1, SUMO2 et SUMO3 est de près de 50 %, et l'homologie des protéines SUMO2 et SUMO3 est d'environ 97 %. La structure de SUMO4 et SUMO5 est différente des trois autres protéines SUMO, et elles n'ont pas été largement observées chez les mammifères [8, 9]. SUMO4, dépourvu de traitement C-terminal, entraîne son incapacité à se conjuguer aux résidus lysine dans les protéines cibles [10]. La SUMOylation est un processus dynamique réversible et peut être médiée par la famille SENP. Il existe sept SENP chez les mammifères, dont SENP1, SENP2, SENP3, SENP5, SENP6, SENP7 et SENP8. Parmi ceux-ci, SENP8 montre une spécificité contre la protéine Nedd8 de type ubiquitine et n'inverse pas la SUMOylation. D'autres SENP ont une spécificité différente pour les SUMO. SENP1 et SENP2 ont une large spécificité pour SUMO1 et SUMO2/3, tandis que SENP3 et SENP5 favorisent l'élimination de SUMO2, et SENP6 et SENP7 ont moins d'effet sur le monomère SUMO2/3 que le poly-SUMO de SUMO2/3 [11]. La voie de conjugaison SUMO est importante pour le développement d'une grande variété de maladies humaines telles que l'ischémie cérébrale et la tumorigenèse [12-14]. Des travaux antérieurs ont également indiqué que les SUMO ciblant les protéines contribuent à un certain nombre de maladies cardiovasculaires humaines, telles que les anomalies valvulaires, les cardiopathies ischémiques, l'hypertrophie cardiaque et la cardiomyopathie idiopathique [15]. Chez les animaux soumis à l'I/R cardiaque, les conjugaisons de SUMO1 se sont révélées inactivées [16]. Cependant, il n'est pas clair, dans ces conditions, si et comment la modification SUMO est impliquée dans la protection des ions zinc contre les lésions cardiaques I/R.

La protéine liée à la dynamine (Drp) 1 est une protéine clé pour la fission mitochondriale. Il se compose de quatre parties : les domaines effecteurs GTPase (GED) GTP-binding, middle, insert B et C-terminal. Une variété de modifications post-transcriptionnelles contribuent à la régulation de l'activité de Drp1, telles que la phosphorylation, l'ubiquitination, la SUMOylation et la S-nitrosylation, et la SUMOylation semble exercer un rôle dans la régulation de l'activité de Drp1 [17, 18]. Des études ont rapporté la suppression de SUMO2/3 de Drp1 médiée par SENP3 et SENP5 et la suppression de SUMO1 de Drp1 à SENP2 [6, 19, 20]. Cependant, il n'y a aucune preuve indiquant une implication directe de la SUMOylation de Drp1 dans la protection du zinc contre les lésions cardiaques I/R.

Le but de notre étude est de déterminer si (1) la SUMOylation de Drp1 contribue à la progression de la lésion myocardique I/R et comment elle contribue à la protection du préconditionnement du zinc et (2) le préconditionnement du zinc peut induire la mitophagie via la régulation de la SUMOylation de Drp1 dans le cœur.

2. Méthodes

Cette étude est conforme au NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication No. 85-23, révisé 1996).

2.1. Produits chimiques et souris SUMO1 KO

, la N-tétrakis-(2-pyridylméthyl)éthylènediamine (TPEN) a été achetée chez Sigma (St. Louis, MO, USA). Les animaux SUMO1 KO ont été gracieusement mis à disposition par le professeur Wei Yang et Huaxin Sheng (Duke University, Durham, North Carolina, USA) [7]. Des souris C57Bl/6J de type sauvage ont été achetées auprès du Military Medical Science Academy Laboratory, Pékin, Chine.

2.2. Perfusion de coeurs de rats isolés

/groupe) ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (300 mg/kg, intrapéritonéal). Une fois les souris anesthésiées, la canule PE-90 avec une structure centrale interne et externe a été utilisée pour l'intubation trachéale. Inséré dans la partie supérieure de la bifurcation trachéale, retirez le noyau interne, intubez le ventilateur, ajustez le volume courant de la souris pour maintenir 250-300 ml/min et ajustez la fréquence respiratoire à 110-130 fois/min. La température corporelle a été maintenue à 36,5-37°C en utilisant un réchauffeur de température corporelle infrarouge. Les souris ont été fixées en position latérale droite et une incision transversale a été pratiquée à partir de l'aisselle gauche. Ouvrez la cavité thoracique pour exposer le ventricule gauche et l'appendice auriculaire gauche du quatrième ou cinquième espace intercostal. En utilisant la suture sans perte 7-0 du bord inférieur de l'appendice auriculaire gauche à environ 2 mm à travers la surface du myocarde jusqu'au côté du cône de l'artère pulmonaire, les extrémités de la suture ont été passées à travers un petit morceau de tube en vinyle souple pour former un piège. L'ischémie régionale a été induite en fixant l'anse au cœur par clampage d'un hémostatique. Après 30 min d'ischémie, les cœurs ont été reperfusés pendant 120 min en relâchant l'hémostatique. Zinc (100 ??g/kg) a été administré 5 min avant reperfusion pendant 30 min.

2.3. Mesure du SI

Après 2 h d'I/R, l'artère descendante antérieure gauche a été ligaturée et 1 ml de colorant bleu Evans à 2 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a été injecté à partir de l'aorte abdominale. Une fois que le cœur a viré au bleu, la perfusion a été arrêtée et le cœur a été soigneusement lavé avec une solution saline normale pour faire la distinction entre les zones sans risque et les zones à risque (AAR). Retirer le cœur et conserver au réfrigérateur à -20°C pendant 2 h. Une fois le cœur congelé et fixé, coupez une tranche d'environ 1 mm de l'apex, soit un total de 4 morceaux. Le cœur a été incubé dans du chlorure de triphényltétrazolium à 1% (TTC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) à 37°C pendant 20 minutes pour distinguer la zone d'infarctus (blanc, IS) de la zone à risque (rouge). Les coupes ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 10 % pendant 2 h pour distinguer les zones colorées des zones non colorées. La zone des zones sans risque, la zone à risque et les zones d'infarctus ont été analysées par le logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Le pourcentage de la taille de l'infarctus a été calculé comme

2.4. Hypoxie/Réoxygénation des cellules cardiaques

La lignée cellulaire de myocytes auriculaires de souris HL-1 a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) et cultivée dans du Claycomb Medium (Sigma, San Francisco, USA) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) et 1‰ streptomycine à 37°C dans le 5% CO2-95% d'atmosphère atmosphérique. Une fois que les cellules ont atteint une densité de 90 %, digérez avec de la trypsine 0,25 mM, diluez à différentes densités et inoculez-les dans différentes plaques à puits, telles que des plaques à 6 puits (

cellules/puits) et des plaques confocales (cellules/plaque). Pour les expériences d'hypoxie/réoxygénation (H/R), les cellules ont été cultivées dans du DMEM à faible teneur en glucose (Invitrogen, Carlsbad, CA) avec du FBS libre et ont été placées dans une chambre hypoxique (Coylab, Grass Lake, MI) et cultivées avec 95 % de N2/5% CO2 à 37°C pendant 24h. Pendant 6 h de réoxygénation, les cellules HL-1 ont été incubées dans du DMEM contenant 10% de FBS à 37°C dans le 5% de CO2-95% d'atmosphère atmosphérique.

2.5. Construction de plasmide, synthèse d'ARNsi et transfection transitoire dans des cellules HL-1

Les ADNc complets des souris SUMO1, UBC9, SENP2 et Drp1 ont été obtenus par RT-PCR à l'aide d'ARN total extrait de cellules HL-1, et leurs séquences ont été confirmées par séquençage BigDye (Applied Biosystems). Les ADNc complets SUMO1, UBC9, SENP2 et Drp1 ont été sous-clonés dans le plasmide d'expression de mammifère pcDNA3.1 (Life Technologies) abritant une étiquette HA, Flag, Myc à l'extrémité C, respectivement. Les lysines 532, 535, 558 et 568 de Drp1 ont été remplacées par de la leucine (Myc-Drp1 4KR) en utilisant le kit de mutagenèse génique dirigée (Beyotime). Les oligonucléotides siRNA ont été synthétisés par Sigma. Les séquences étaient les suivantes : siRNA contrôle négatif : 5 - GAT CCG AAT TGC CAC AAC AGG GTC GTG TTC AAG AGA ATCA CAT CTT CTT CCT CCA TTC TTT TTTG-3 SUMO1 siRNA : 5 - GAT CCG CCT TCA TAT TAC CCT CTC CTT TCA AGA GAA GGA GAG GGT AAT ATG AAG GCT TTT TTG-3 . Les vecteurs vides, le plasmide cible, l'ARNsi de contrôle négatif et l'ARNsi SUMO1 ont été transitoirement transfectés dans des cellules HL-1 à l'aide du réactif lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) selon les instructions du fabricant. Toutes les expériences ont été menées pendant 48 h après la transfection.

2.6. Imagerie confocale du potentiel membranaire mitochondrial

Le potentiel de membrane mitochondriale ( ) a été mesuré par JC-10 (Solarbio, Pékin, Chine), le colorant fluorescent de la membrane mitochondriale. Les cellules HL-1 ont été incubées avec JC-10 selon les instructions du fabricant. Les changements de fluorescence ont été détectés avec un microscope confocal à balayage laser. La longueur d'onde d'excitation maximale du monomère JC-10 est de 515 nm et la longueur d'onde d'émission maximale est de 529 nm (vert), la longueur d'onde d'excitation maximale du polymère JC-10 est de 585 nm et la longueur d'onde d'émission maximale est de 590 nm (rouge).

2.7. Mesure des espèces réactives de l'oxygène

Les cellules HL-1 ont été colorées avec du diacétate de 2,7-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA,10 ??M/l) (Solarbio, Pékin, Chine) pendant 20 minutes dans Claycomb Medium avec FBS gratuit. Les cellules ont été lavées trois fois avec un milieu sans sérum et ont été directement observées par microscopie confocale avec des cultures sans sérum, en utilisant 488 lumière d'excitation et 525 lumière d'émission pour capturer la fluorescence verte.

2.8. Western blot

Après extraction de l'échantillon de protéine, la concentration a été appliquée de manière cohérente dans un volume égal de 30 ??g et électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10-12 %. La protéine a été transférée sur des membranes en fluorure de polyvinylidène, bloquée avec du lait écrémé à 5 % pendant 90 minutes et incubée avec l'anticorps primaire à 4°C pendant une nuit. Les anticorps primaires comprenaient anti-SUMO1 (ab11672 Abcam, Cambridge, MA), anti-UBC9 (ab75854 Abcam, Cambridge, MA), anti-Bcl2 (ab692 Abcam, Cambridge, MA), anti-Bax (ab32503 Abcam, Cambridge, MA) , anti-caspase3 (ab13847 Abcam, Cambridge, MA), anticorps anti-caspase-3 actif (ab2302 Abcam, Cambridge, MA), anticorps anti-Tom20 (ab56783 Abcam, Cambridge, MA), anticorps anti-Tim23 (ab116329 Abcam, Cambridge, MA), anticorps anti-Drp1 (ab184247 Abcam, Cambridge, MA), anticorps anti-LC3B (ab51520 Abcam, Cambridge, MA), anticorps anti-p62 (ab56416 Abcam, Cambridge, MA) et anticorps anti-GAPDH ( ab128915 Abcam, Cambridge, MA). Les anticorps primaires ont été récupérés et incubés avec l'anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été visualisées avec les réactifs de chimiluminescence améliorés (Millipore, Boston, MA).

2.9. Immunoprécipitation

Les cellules HL-1 ont été immunoprécipitées avec des anticorps dirigés contre SUMO1 ou Drp1 à l'aide du kit Pierce™ Crosslink Magnetic IP/Co-IP (88805, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. Les échantillons ont ensuite été soumis aux techniques standard de Western blot et les membranes sondées, respectivement, avec des anticorps dirigés contre Drp1 et SUMO1.

2.10. Protocoles expérimentaux

Des cœurs de souris ont été soumis à 30 min d'ischémie régionale, suivies de 2 h de reperfusion. Les souris ont été traitées avec du zinc (100 ??g/kg Sigma, St. Louis, MO, USA) via la veine caudale 5 min avant reperfusion pendant 30 min. Les cellules HL-1 ont été exposées à 1% d'O2 avec Claycomb Medium pendant 24 h suivi de 6 h de réoxygénation. Zn 2+ chélateur N,N,N , N - tétrakis-(2-pyridylméthyl) éthylènediamine (TPEN, 20 ??M) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a reçu 2 h après transfection avec le vecteur ou le plasmide pendant 48 h.

2.11. Analyses statistiques

et ont été obtenus à partir de 5 à 10 expériences distinctes. La signification statistique a été déterminée à l'aide de la méthode de Student

- test ou ANOVA à sens unique suivi du test de Tukey. Une valeur de

a été considérée comme statistiquement significative.

3. Résultats

3.1. Effets du zinc sur les protéines de la famille SUMO dans des conditions normoxiques et H/R

Des recherches ont rapporté que les SUMO jouent un rôle important dans l'ischémie cérébrale et l'ischémie cardiaque. Nous avons déjà montré que le zinc protège le cœur contre les lésions d'ischémie-reperfusion dans des cœurs de rat isolés et H9c2, nous cherchons donc à savoir si les protéines de la famille SUMO sont impliquées dans l'effet protecteur du zinc sur les lésions d'ischémie-reperfusion myocardique. Comme le montrent les figures 1(a)–1(e) ( ), par rapport au groupe témoin, les lésions H/R ont significativement diminué la conjugaison SUMO1 des protéines. Cependant, la lésion H/R n'a pas affecté la conjugaison SUMO2/3. De plus, les niveaux de SENP2, SENP5 et SENP7 ont diminué, tandis que le zinc a inversé l'effet de H/R sur SUMO1, SENP2, SENP5 et SENP7. Dans les conditions normoxiques, le zinc a également régulé à la baisse les niveaux de SENP5 et SENP7 mais n'a pas eu d'effet sur la conjugaison de SUMO1 et la protéine SENP2. Fait intéressant, la seule SUMO ligase UBC9 a également été exprimée à des niveaux inférieurs dans le cadre de l'ischémie/reperfusion, qui a été inversée par le zinc. Ensemble, ces données suggèrent que la conjugaison de SUMO1 et les niveaux de SENP2 sont fortement régulés par le zinc dans le cadre d'une lésion H/R mais pas dans des conditions normoxiques. Dans le même temps, H/R a provoqué une perte d'indiquée par la diminution du rapport rouge (agrégat)/vert (monomère) et une augmentation des ROS cellulaires détectés par l'intensité de fluorescence DCF, qui a été inversée par le zinc (figures 1 (f) - 1(i), ).


Matériaux et méthodes

Description des caractéristiques au niveau des gènes/protéines et analyse de corrélation

Tout au long de cet article, les corrélations ont été effectuées à l'aide du coefficient de corrélation de Pearson [33] et calculées à l'aide de Matlab. corrcoef fonction. Les limites d'erreur sont l'intervalle de confiance à 95 %.

Dans la section suivante, nous décrivons les ensembles de données utilisés pour caractériser les aspects du trouble. Plusieurs de ces caractéristiques ont été précédemment décrites dans [9].

Degré d'interaction génétique

C'était la même mesure que le degré GI négatif dans [9]. Plus précisément, il s'agit du nombre d'interactions négatives de chaque gène de la matrice, où les interactions négatives sont définies comme celles qui ont un score ε < -0,08 et P < 0.05.

Trouble protéique

Le trouble protéique a été dérivé à l'aide du logiciel Disopred2 [2]. Nous définissons les protéines structurées comme celles avec moins de 10 % de désordre et les protéines désordonnées comme celles avec plus de 30 % de désordre, selon [4].

Rapport dN/dS

Nous avons calculé le rapport dN/dS moyen pour S. cerevisiae par rapport aux espèces de levure (Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces bayanus et Saccharomyces mikatae). Les séquences ont ensuite été alignées à l'aide de MUSCLE [34] et les rapports dN/dS ont été calculés à l'aide de PAML [35].

Niveau d'expression

Le niveau d'expression d'un gène tel que mesuré par le nombre moyen de copies d'ARNm de chaque transcrit par cellule a été tiré de [36].

Demi-vie

La demi-vie d'un gène était la demi-vie de son ARNm mesurée en minutes et rapportée dans [37].

Capacité phénotypique

La capacité phénotypique reflète la variabilité d'un panel de phénotypes induite par la délétion de gènes non essentiels et a été utilisée directement à partir de l'étude de Levy et Siegal [38].

Multi-fonctionnalité

Il s'agit simplement du nombre d'annotations de processus GO pour chaque gène se limitant à l'ensemble fonctionnellement distinct de termes GO décrits dans [39].

Score de cohérence des expressions

Il s'agit du coefficient de clustering calculé sur le réseau combiné MEFIT [40] où les arêtes sont des gènes avec un score supérieur à 2 (environ 95e percentile). Laisser E(Nje,Nj) vaut 1 s'il y a une arête entre Nje et nj et zéro sinon. Le coefficient de clustering pour un gène G avec n voisins <>je> est :

Motifs linéaires

Des motifs linéaires ont été trouvés en utilisant Scansite [41] sur le réglage le plus strict.

Trouble conservé

Définition de la conservation du désordre et des résidus de séquence du clade de levure

Chacun des 5 025 groupes orthologues répartis sur 23 espèces du clade de levure [42] a été aligné de manière multiple par MAFF [43] avec des paramètres par défaut. Les scores de conservation des acides aminés (A) de chaque position dans chaque alignement ont été calculés et regroupés comme suit :

une jereprésente l'une des 20 fonctions indicatrices de symboles d'acides aminés différentes dans une position d'alignement dans k e séquence protéique, et N représente le nombre total de séquences protéiques alignées.

Pour le score de conservation du désordre (D), chaque position d'alignement a été superposée avec le symbole du désordre prédit par Dispred2 [2] avec les paramètres par défaut et sa conservation a été calculée et classée comme suit :

représente la fonction d'indicateur de désordre dans une position d'alignement dans k e séquence protéique.

Nous n'avons considéré que les protéines pour lesquelles au moins dix orthologues étaient disponibles, et les positions de résidus où au moins cinq de ces orthologues étaient alignés. Tous les alignements orthologues de séquences et de désordres sont affichés avec l'applet Jalview [44] et disponibles sur [45].

Conservation structurelle du calcul du désordre

Pour calculer comment le désordre est structurellement conservé malgré les changements au niveau des acides aminés, nous avons divisé les acides aminés en un groupe associé au désordre et un groupe associé à la structure (tableau 1). Cette liste a été compilée sur la base de [6] où les acides aminés désordonnés sont chargés et hydrophiles tandis que les acides aminés structuraux sont neutres et donc hydrophobes. Nous avons considéré toutes les positions des orthologues de S. cerevisiae gènes après alignement. Si l'acide aminé a été changé de S. cerevisiae à un orthologue, nous avons enregistré s'il était changé vers l'ensemble désordonné d'acides aminés ou l'ensemble structuré d'acides aminés. Ensuite, nous avons comparé les acides aminés dans les régions de désordre conservé, les régions de désordre non conservé et le fond (toutes positions).

Une classification systématique des troubles

Définitions du trouble contraint et flexible

Désordre conservé : les positions alignées qui ont D 5, c'est-à-dire sont désordonnées dans plus de 50 % des résidus alignés.

Désordre flexible : les positions alignées qui ont D 5 et A < 5, c'est-à-dire qu'elles sont désordonnées dans plus ou égales à 50 % des résidus alignés mais sont conservées dans moins de 50 % des résidus alignés.

Désordre contraint : les positions alignées qui ont D 5 et A ≥ 5, c'est-à-dire sont désordonnées dans plus ou égal à 50% de résidus alignés et conservées dans plus ou égal à 50% de résidus alignés.

Trouble non conservé : les positions alignées qui ont D < 5, c'est-à-dire sont désordonnées en S. cerevisiae mais sont désordonnés dans moins de 50 % des résidus alignés.

Répartition des résidus dans deux espaces de conservation : phosphorylation et motifs linéaires

sites de phosphorylation de S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe et Candida albicans ont été obtenus à partir de [46] et d'une compilation d'ensembles de données de phosphosite [46-51]. Les sites de motifs linéaires sont prédits par ScansSite2.0 sur le S. cerevisiae Les données. Chaque distribution de fonctionnalité-résidus-rapport de cotes (O caractéristique , appelée densité relative dans le texte principal et la figure 5a) est calculée de la même manière que le hub-odds-ratio :

F jereprésente le nombre de résidus caractéristiques (c'est-à-dire le site de phosphorylation) avec je e score de conservation des acides aminés (A) et j e score de conservation des troubles (D) dans les protéines entières de S. cerevisiae, S. pombe, et C. albicans en cas de sites de phosphorylation ou S. cerevisiae en cas de motifs linéaires.

Chaque distribution de phosphorylation-site-odds-ratio (P) et de linear-motif-odds-ratio (M) est affichée avec la fonction levelplot dans le package R de réseau [52]. Corrélations partielles de O caractéristique et A (ou O caractéristique et D) sont statistiquement testés par la fonction pcor.test [53], et tracés avec les résidus après s'être contrôlés par régression linéaire.

Distribution de deux résidus conservés dans les hubs : GI, interaction protéine-protéine et réseau d'interaction structurale

Les hubs du 50e ou du 90e centile des réseaux d'interaction GI et protéine-protéine ont été définis comme des protéines dont le degré est supérieur au 50e ou au 90e centile dans les distributions de degrés respectives. Les hubs à interface unique et multi-interface ont été définis comme décrit dans [20] avec le réseau d'interaction structurel récemment mis à jour avec jePfam correspondant à la version Pfam 21.0 [54], 2 295 fichiers de la banque de données de protéines de levure [55] et 82 650 interactions physiques dans Biogrid 2.06 [56].

Fonction du trouble flexible par rapport au trouble contraint

GO enrichissements

Nous avons trouvé des enrichissements de termes GO pour le type de trouble (trouble flexible, contraint et non conservé) en utilisant la méthode suivante. La distribution du type de trouble pour chaque terme GO a été testée par rapport à la distribution de fond de ce type de trouble à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon pour P-valeur < 0.05, où le PLa valeur a été ajustée pour les tests d'hypothèses multiples en utilisant la correction de fausse découverte de Benjamini-Hochberg. Les termes enrichis pour le trouble flexible ou contraint n'étaient considérés comme enrichis que si la distribution des ratios (Flexible/(Flexible + Contraint) ou Contraint/(Flexible + Contraint), respectivement) était significativement plus élevée que le contexte du terme à l'aide d'un test de somme de rang avec P < 0.01. Ainsi, un terme qui a été rapporté comme enrichi pour le trouble flexible n'a pas été également enrichi pour le trouble contraint. De même, les termes initialement enrichis pour le trouble non conservé ont été testés pour voir si le rapport (Trouble non conservé)/(Trouble total) était au-dessus du fond du terme à l'aide d'un test de somme de rang avec P < 0.01. Les enrichissements pour les troubles flexibles et contraints sont contenus dans le dossier complémentaire 2.

Analyse de domaine

Pour définir les domaines, nous avons utilisé le domaines.tab fichier téléchargé à partir de la base de données du génome de Saccharomyces le 4 avril 2010, qui contient les résultats d'un InterProScan utilisant chaque S. cerevisiae séquence protéique pour rechercher des domaines/motifs à partir de plusieurs bases de données. Le fichier se compose de 40 737 domaines mappés sur le protéome de levure. Pour restreindre notre analyse aux domaines structuraux, nous n'avons considéré que 11 801 domaines cartographiés selon trois méthodes : superfamily (base de données SCOP, 4 943 domaines), HMMPfam (base de données Pfam, 4 422 domaines) et Gene3D (base de données CATH, 2 336 domaines). Pour chacun des 3 680 gènes avec domaines et alignements cartographiés, chaque position dans la séquence était associée à deux scores de conservation : conservation en désordre (D) et conservation en acides aminés (A) obtenus à partir des alignements de séquences du clade de levure (voir ci-dessus ). Pour un point donné de la grille de conservation (A, D), nous avons compté les résidus qui chevauchent au moins un domaine et les résidus qui ne chevauchent aucun domaine. Nous avons ensuite calculé le rapport de cotes logarithmique de ces dénombrements.

Analyse familiale

Pour chaque domaine, nous avons calculé le pourcentage de résidus appartenant à chacune des trois catégories : désordre flexible, désordre contraint, désordre non conservé. Nous avons ensuite comparé les distributions de ces pourcentages pour tous les domaines. Nous avons extrait les domaines enrichis en trouble contraint par opposition au trouble flexible en examinant le rapport contraint/flexible (taux de fausse découverte (FDR) ajusté de Wilcoxon P-valeur < 0.05). Les tests ont été effectués avec la fonction wilcox.test et le P-les valeurs ont été corrigées pour plusieurs tests avec la fonction p.adjust(méthode = 'FDR') de l'environnement de programmation statistique R [52]. Les résultats de ces enrichissements sont contenus dans le dossier complémentaire 2.

Carte d'enrichissement

Les cartes d'enrichissement ont été créées à l'aide de Cytoscape [57] et du plugin Enrichment Map [58]. Les arêtes représentent la valeur du coefficient de chevauchement (taille de l'intersection des deux termes GO/taille du petit terme GO) avec une coupure à 0,3.