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Dans quelle partie du génome se situent les séquences développementales de l'embryogenèse ?


Quelle(s) partie(s) du génome sont les séquences localisées. Sont-ils répartis sur les chromosomes ? Si oui, comment y accède-t-on séquentiellement avec précision lors de l'embrygenèse ?


C'est une question très générale. Les « séquences de développement » ne sont que des gènes comme les autres. Comme tous les gènes, ils sont distribués de manière semi-aléatoire dans le génome. Bien qu'il existe des zones riches et pauvres en gènes dans le génome, à quelques exceptions près - notamment les gènes à homéoboîte -, les gènes ne sont pas regroupés par fonction.

Quant à savoir comment y accéder de manière séquentielle, c'est une énorme question mais elle n'est pas spécifique à l'embryogenèse. Les gènes devront toujours être activés/désactivés à des moments précis et en réponse à des stimuli spécifiques. Ceci est particulièrement évident lors du développement mais n'est pas exclusif à celui-ci.

Cela se produit essentiellement par le biais de boucles de rétroaction et de contrôle. Le gène A active la transcription du gène B qui active le gène C qui désactive alors A. Si vous parvenez à allumer A, le reste suivra. L'une des façons dont cela peut se produire dans les embryons en développement est l'ARNm maternel. Ce sont des molécules d'ARNm qui sont présentes dans l'ovule fécondé et qui commencent à être traduites. Cela nous donne un point de départ pour activer le gène A, qui active ensuite B, etc.

Cette réponse est une énorme simplification, mais une réponse complète pourrait nécessiter quelques (ou 40) projets de doctorat.


Terdon a raison sur la façon dont la coordination est effectuée, et je connais au moins un étudiant qui y travaille pour sa thèse. Cependant, pour répondre directement à votre autre question, il y a eu une excellente révision en 2010, qui a été enseignée dans mon cours de génétique cette année-là.

Il est important de noter que nous ne connaissons toujours pas tous les gènes impliqués avec une certitude significative. De plus, il serait extrêmement difficile de financer et de mener les travaux de Hong et al aux États-Unis.

Si vous lisez l'article, vous remarquerez que plusieurs gènes impliqués sont des gènes actifs tout au long de la vie à différents niveaux. La figure 4 donne un bon exemple de la répartition de l'information.

Notez que les trois catégories de gènes qu'ils ont utilisées étaient même assez différentes : gènes spécifiques aux cellules souches, gènes des muscles, de la graisse et du tissu conjonctif, terme GO significativement enrichi

Ainsi, lorsque vous pensez à la diversité des gènes, il serait encore plus étrange qu'ils soient regroupés. Encore une fois, ils ne sont probablement pas vraiment aléatoires, mais ils ne semblent pas avoir de modèle.

Pour citer leur retour à la maison :

De plus, en comparant avec les données publiées, nous avons identifié trois groupes de gènes maternels avec des profils de régulation distincts au cours des semaines 4-9 de développement, qui ont fourni une base moléculaire pour les événements de développement anatomiquement distincts qui se produisent entre l'embryogenèse précoce et l'organogenèse et l'histogenèse ultérieures.

Plus important encore, notre profil de développement détaillé et à l'échelle du génome des modèles d'expression génique a révélé que les gènes impliqués dans les mêmes processus biologiques sont souvent régulés de manière coordonnée. Cette découverte nous a amenés à émettre l'hypothèse que les modèles d'expression des gènes, s'ils sont connus de manière suffisamment détaillée comme dans la présente étude, pourraient être utilisés pour prédire un rôle du gène dans un processus de développement.

Hong Yi, Lu Xue et Ming-Xiong Guo, et al. FASEB J. 2010 septembre ; 24(9) : 3341-3350. doi : 10.1096/fj.10-158782 PMCID : PMC2923361


Résumé

Le développement embryonnaire représente une phase de reproduction importante des espèces végétales à reproduction sexuée. La fusion de l'ovule et du sperme produit le zygote végétal, une cellule totipotente qui, par la division cellulaire et la spécification de l'identité cellulaire au début de l'embryogenèse, établit les principales lignées cellulaires et tissus de la plante adulte. La phase de morphogenèse ultérieure produit l'embryon de taille normale, tandis que le processus de maturation de l'embryogenèse tardive prépare la graine à la dormance et à la germination ultérieure, assurant la poursuite du cycle de vie de la plante. Dans cette revue sur l'embryogenèse, nous comparons le modèle eudicot Arabidopsis thaliana avec des cultures de monocotylédones, en se concentrant sur l'activation du génome, la régulation paternelle et maternelle du développement précoce des zygotes et les principaux organisateurs de la structuration, tels que les facteurs de transcription auxine et WOX. Alors que les premiers stades du développement embryonnaire sont apparemment conservés parmi les espèces végétales, les programmes de maturation embryonnaire se sont diversifiés entre eudicots et monocotylédones. Cette diversification des espèces cultivées reflète les effets probables de la domestication sur les caractères de qualité des semences qui sont déterminés au cours de la maturation embryonnaire, et assure également la germination des semences dans différentes conditions environnementales. Cette revue décrit les caractéristiques les plus importantes du développement embryonnaire des plantes, ainsi que la portée et les applications de la génomique dans les études sur les embryons végétaux.


Qu'est-ce que C. elegans ?

UNE INTRODUCTION POUR CEUX QUI NE CONNAISSENT PAS « LE VER ».

C. elegans est un nématode, membre du phylum Nematoda :

Les vers ronds et les nématodes, un phylum de vers à peau lisse et non segmentés avec un corps cylindrique long et effilé aux extrémités, comprennent des formes libres et parasites à la fois aquatiques et terrestres. (Dictionnaire de la presse académique de la science et de la technologie)

C. elegans est un organisme non dangereux, non infectieux, non pathogène et non parasitaire. Il est petit, mesure environ 1 mm de long et vit dans le sol, en particulier la végétation en décomposition, dans de nombreuses régions du monde, où il survit en se nourrissant de microbes tels que des bactéries. Elle n'a aucune importance économique pour l'homme.

Pourquoi étudier C. elegans?

Partout dans le monde, des milliers de scientifiques travaillent à plein temps à étudier la biologie de C. elegans. Entre octobre 1994 et janvier 1995, 73 articles scientifiques sur cette créature sont parus dans des revues scientifiques internationales. Actuellement, un consortium international de laboratoires collabore à un projet de séquençage de l'intégralité des 100 000 000 bases d'ADN de la C. elegans génome. Pourquoi investir tant d'efforts dans l'étude d'un organisme aussi insignifiant ?

C. elegans est à peu près aussi primitif un organisme existant qui partage néanmoins bon nombre des caractéristiques biologiques essentielles qui sont des problèmes centraux de la biologie humaine. Le ver est conçu comme une cellule unique qui subit un processus de développement complexe, commençant par le clivage embryonnaire, passant par la morphogenèse et la croissance jusqu'à l'adulte. Il a un système nerveux avec un «cerveau» (l'anneau nerveux circumpharyngé). Il présente un comportement et est même capable d'apprentissage rudimentaire. Il produit du sperme et des ovules, s'accouple et se reproduit. Après la reproduction, il vieillit progressivement, perd de sa vigueur et finit par mourir. Embryogenèse, morphogenèse, développement, fonction nerveuse, comportement et vieillissement, et comment ils sont déterminés par les gènes : la liste comprend la plupart des mystères fondamentaux de la biologie moderne. (Nous devons, hélas, supposer que la plus grande énigme biologique de toutes, la conscience, est absente de C. elegans— bien que cela reste à démontrer !) C. elegans présente ces phénomènes, mais ne mesure que 1 mm de long et peut être manipulé comme un micro-organisme - il est généralement cultivé sur des boîtes de Pétri ensemencées avec des bactéries. Les 959 cellules somatiques de son corps transparent sont visibles au microscope et sa durée de vie moyenne n'est que de 2-3 semaines. Ainsi C. elegans offre au chercheur le compromis idéal entre complexité et traçabilité.

Comment le C. elegans a été initié par le biologiste sud-africain Sydney Brenner peut être trouvé via le lien ci-joint.

Une esquisse biologique de C. elegans

C. elegans est un nématode vivant en liberté. Il existe deux sexes : un hermaphrodite autofécond et un mâle. L'adulte comprend essentiellement un tube, la cuticule extérieure, contenant deux tubes plus petits, le pharynx et l'intestin, et le système reproducteur. La majeure partie du volume de l'animal est absorbée par le système reproducteur. Sur les 959 cellules somatiques de l'hermaphrodite, quelque 300 sont des neurones. Les structures neurales comprennent une batterie d'organes sensoriels dans la tête qui interviennent dans les réponses au goût, à l'odorat, à la température et au toucher, et bien que C. elegans n'a pas d'yeux, il peut réagir légèrement à la lumière. Parmi les autres structures neurales se trouve un anneau nerveux antérieur avec un cordon nerveux ventral revenant le long du corps. (Il y a aussi un cordon nerveux dorsal plus petit.) Il y a 81 cellules musculaires. C. elegans se déplace au moyen de quatre bandes longitudinales de muscles appariées sous-dorsale et sous-ventrale. La flexion et la relaxation alternatives génèrent des ondes dorso-ventrales le long du corps, propulsant l'animal. Le développement et la fonction de cet organisme diploïde sont codés par environ 17 800 gènes distincts.


Les premiers stades de l'embryogenèse ont été étudiés

Pour la première fois, des scientifiques de la Faculté de biologie de l'Université d'État Lomonossov de Moscou, en collaboration avec leurs collègues d'Autriche et des États-Unis, ont établi des cartes détaillées de l'organisation tridimensionnelle du génome dans des cellules individuelles et étudié les caractéristiques de l'organisation tridimensionnelle. des génomes maternels et paternels chez les zygotes de souris. Les résultats obtenus ont été publiés dans le La nature journal.

L'équipe de recherche internationale, y compris les biologistes de l'Université d'État Lomonossov de Moscou, a prouvé un modèle proposé plus tôt, arguant que l'emballage des fibrilles de chromatine pouvait varier considérablement dans les cellules individuelles. L'obtention de ces résultats est devenue possible grâce au développement d'une nouvelle approche expérimentale pour étudier l'organisation tridimensionnelle du génome dans les noyaux des cellules individuelles.

Les molécules d'ADN dans les noyaux cellulaires sont emballées dans des structures spéciales, des chromosomes, qui pourraient être compris comme des enchevêtrements complexes mais non aléatoires d'ADN génomique associé à des protéines et à de l'ARN. Les biologistes ont mis au point une nouvelle technique, permettant d'étudier comment ce complexe ADN-protéine appelé chromatine est emballé dans le noyau d'une cellule vivante. Cette technique est une version avancée de l'approche classique pour les études d'organisation tridimensionnelle du génome, appelée Hi-C (capture de conformation chromosomique à haut débit).

Sergey Ulianov, membre de l'équipe de recherche, a expliqué : « Prenons trois fragments d'ADN arbitraires : A, B, C. Les deux premiers, étant voisins, sont situés un à un dans le génome, et le troisième - disons - est situé sur une distance de plusieurs millions de paires de bases par rapport aux deux précédents. Cependant, un chromosome pourrait être emballé de telle sorte que le fragment C soit proche dans l'espace de A ou B. On peut identifier ce fait (pas pour ces trois fragments d'ADN mais simultanément pour l'ensemble du génome) et utiliser ces informations pour construire des cartes d'organisation tridimensionnelle de la chromatine dans une cellule vivante. C'est ainsi que fonctionne la méthode Hi-C.

La méthode Hi-C standard nécessite plusieurs centaines de milliers voire des millions de cellules pour réaliser une expérience. Cependant, la nouvelle technique permet aux chercheurs de travailler avec une seule cellule et de dessiner sa carte individuelle de l'organisation tridimensionnelle des chromosomes. La principale nouveauté de cette technique est la sélection de noyaux uniques à l'étape finale de l'expérience Hi-C avec amplification ultérieure du génome entier. Ce processus offre la possibilité d'obtenir des dizaines de milliers de copies d'ADN à partir d'un seul noyau en utilisant une enzyme spéciale.

Sergey Ulianov déclare : « C'est l'étape clé de notre expérience. L'amplification du génome entier permet des opérations directes avec les génomes de cellules individuelles. Nous pouvons les séquencer et effectuer toute autre manipulation, y compris des études de l'organisation tridimensionnelle de la chromatine dans une seule cellule. Les technologies dites unicellulaires, à savoir les études de cellules individuelles et les manipulations avec celles-ci, appartiennent désormais à un domaine en développement rapide de la biologie moléculaire. »

Cette nouvelle méthode a permis aux scientifiques d'étudier séparément les noyaux maternels et paternels des zygotes de souris et d'examiner en quoi l'organisation tridimensionnelle du génome maternel diffère de celle du génome paternel.

Ilya Flyamer, le premier auteur de l'article, commente : « Nous avons mené l'analyse de l'organisation tridimensionnelle du génome chez les zygotes de souris. Il s'est avéré que les noyaux maternel et paternel coexistant dans une cellule, dans un zygote, différaient considérablement la voie de l'emballage du génome. Dans le pronucleus paternel, formé à partir d'un noyau de spermatozoïdes, les parties actives du génome sont séparées dans l'espace des parties inactives. Étonnamment, nous ne voyons pas cela dans le pronucleus maternel. Ainsi, le pronucleus maternel est le premier type de noyaux de mammifères où les compartiments de chromatine actifs et réprimés ne sont pas spatialement séparés les uns des autres. »

Ainsi, la nouvelle méthode permet d'étudier les premiers stades de l'embryogenèse - juste après la fécondation.

Ilya Flyamer ajoute : « Le Zygote est une cellule totipotente, qui donne naissance à tout type de cellules dans un organisme. C'est pourquoi les résultats obtenus pourraient probablement aider à comprendre la nature de la totipotence et offrir une opportunité d'aborder une reprogrammation plus complète des cellules somatiques. , que cela n'est possible par la création de cellules souches pluripotentes induites."

L'organisation tridimensionnelle de la chromatine est un instrument de régulation important, utilisé par une cellule pour contrôler l'expression des gènes. Il existe de plus en plus de rapports dans la littérature scientifique qui révèlent un lien entre l'emballage anormal de l'ADN dans le noyau cellulaire et le développement de diverses maladies humaines, y compris certains cancers. À l'avenir, la technologie Hi-C monocellulaire permettra aux scientifiques d'étudier certaines sous-populations de cellules tumorales, y compris les plus rares. De plus, cela nous rapprochera probablement de la compréhension des mécanismes d'émergence des tumeurs malignes.

Le projet a été réalisé en coopération avec l'Institut de biologie génétique de l'Académie des sciences de Russie et des collègues d'Autriche et des États-Unis.

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Que peut nous dire un transcriptome ?

Une séquence d'ARN reflète la séquence de l'ADN à partir duquel elle a été transcrite. Par conséquent, en analysant toute la collection de séquences d'ARN dans une cellule (le transcriptome), les chercheurs peuvent déterminer quand et où chaque gène est activé ou désactivé dans les cellules et les tissus d'un organisme.

Selon la technique utilisée, il est souvent possible de compter le nombre de transcrits pour déterminer la quantité d'activité génique - également appelée expression génique - dans un certain type de cellule ou de tissu.

Chez l'homme et d'autres organismes, presque toutes les cellules contiennent les mêmes gènes, mais différentes cellules présentent des schémas d'expression génique différents. Ces différences sont responsables des nombreuses propriétés et comportements différents de diverses cellules et tissus, à la fois dans la santé et dans la maladie.

En collectant et en comparant les transcriptomes de différents types de cellules, les chercheurs peuvent mieux comprendre ce qui constitue un type de cellule spécifique, comment ce type de cellule fonctionne normalement et comment les changements dans le niveau normal d'activité des gènes peuvent refléter ou contribuer à la maladie. De plus, les transcriptomes peuvent permettre aux chercheurs de générer une image complète à l'échelle du génome des gènes actifs dans quelles cellules.

Une séquence d'ARN reflète la séquence de l'ADN à partir duquel elle a été transcrite. Par conséquent, en analysant toute la collection de séquences d'ARN dans une cellule (le transcriptome), les chercheurs peuvent déterminer quand et où chaque gène est activé ou désactivé dans les cellules et les tissus d'un organisme.

Selon la technique utilisée, il est souvent possible de compter le nombre de transcrits pour déterminer la quantité d'activité génique - également appelée expression génique - dans un certain type de cellule ou de tissu.

Chez l'homme et d'autres organismes, presque toutes les cellules contiennent les mêmes gènes, mais différentes cellules présentent des schémas d'expression génique différents. Ces différences sont responsables des nombreuses propriétés et comportements différents de diverses cellules et tissus, à la fois dans la santé et dans la maladie.

En collectant et en comparant les transcriptomes de différents types de cellules, les chercheurs peuvent mieux comprendre ce qui constitue un type de cellule spécifique, comment ce type de cellule fonctionne normalement et comment les changements dans le niveau normal d'activité des gènes peuvent refléter ou contribuer à la maladie. De plus, les transcriptomes peuvent permettre aux chercheurs de générer une image complète à l'échelle du génome des gènes actifs dans quelles cellules.


Contenu

Les produits des gènes Hox sont des protéines Hox. Les protéines Hox sont un sous-ensemble de facteurs de transcription, qui sont des protéines capables de se lier à des séquences nucléotidiques spécifiques sur l'ADN appelées activateurs à travers lesquels elles activent ou répriment des centaines d'autres gènes. La même protéine Hox peut agir comme répresseur sur un gène et activateur sur un autre. La capacité des protéines Hox à se lier à l'ADN est conférée par une partie de la protéine appelée homéodomaine. L'homéodomaine est un domaine de liaison à l'ADN de 60 acides aminés (codé par sa séquence d'ADN correspondante de 180 paires de bases, l'homéoboîte). Cette séquence d'acides aminés se replie en un motif "hélice-tour-hélice" (c'est-à-dire repliement homéodomaine) qui est stabilisé par une troisième hélice. La chaîne polypeptidique consensus est illustrée ci-dessous :. [8] Les protéines Hox agissent souvent en partenariat avec des cofacteurs, tels que les protéines PBC et Meis codées par des types très différents de gène homeobox. [9]

Les gènes homéobox, et donc le motif protéique homéodomaine, se trouvent chez la plupart des eucaryotes. Les gènes Hox, étant un sous-ensemble des gènes homéobox, sont apparus plus récemment dans l'évolution au sein du règne animal ou des métazoaires. Dans le règne animal, les gènes Hox sont présents à travers les bilatéries [10] (animaux avec un axe tête-à-queue clair), et ont également été trouvés chez les Cnidaires comme les anémones de mer. [11] Cela implique que les gènes Hox sont apparus il y a plus de 550 millions d'années. Dans bilateria, les gènes Hox sont souvent organisés en groupes de gènes, bien qu'il existe de nombreuses exceptions où les gènes ont été séparés par des réarrangements chromosomiques. [12] La comparaison des séquences d'homéodomaines entre les protéines Hox révèle souvent une plus grande similitude entre les espèces qu'au sein d'une espèce, cette observation a conduit à la conclusion que les groupes de gènes Hox ont évolué tôt dans l'évolution animale à partir d'un seul gène Hox via une duplication en tandem et une divergence Un groupe de gènes Hox contenant au moins sept gènes Hox différents était présent chez l'ancêtre commun de tous les animaux bilatériens. [10] [13]

Chez la plupart des animaux bilatériens, les gènes Hox sont exprimés dans des domaines décalés le long de l'axe tête-queue de l'embryon, ce qui suggère que leur rôle dans la spécification de la position est une caractéristique ancienne partagée. [14] La conservation fonctionnelle des protéines Hox peut être démontrée par le fait qu'une mouche peut fonctionner dans une large mesure avec une protéine Hox de poulet à la place de la sienne. [15] Ainsi, malgré un dernier ancêtre commun qui a vécu il y a plus de 550 millions d'années, [16] les versions poulet et mouche du même gène Hox sont suffisamment similaires pour cibler les mêmes gènes en aval chez les mouches.

Drosophila melanogaster est un modèle important pour comprendre la génération et l'évolution du plan corporel. Les principes généraux de la fonction et de la logique du gène Hox élucidés chez les mouches s'appliqueront à tous les organismes bilatériens, y compris les humains. Drosophile, comme tous les insectes, possède huit gènes Hox. Ceux-ci sont regroupés en deux complexes, tous deux situés sur le chromosome 3. Le complexe Antennapedia (à ne pas confondre avec le Antp gène) se compose de cinq gènes : labial (laboratoire), proboscipédia (pb), déformé (Dfd), peignes sexuels réduits (Scr) et Antennapedia (Antp). Le complexe Bithorax, nommé d'après le gène Ultrabithorax, se compose des trois gènes restants : Ultrabithorax (Ubx), abdominale-A (abd-A) et abdominale-B (abd-B).

Labial Modifier

Les laboratoire Le gène est le gène exprimé le plus antérieurement. Il est exprimé dans la tête, principalement dans le segment intercalaire (un segment sans appendice entre l'antenne et la mandibule), et également dans l'intestin moyen. Perte de fonction de laboratoire entraîne l'échec de la Drosophile embryon pour intérioriser les structures buccales et céphaliques qui se développent initialement à l'extérieur de son corps (un processus appelé involution de la tête). L'échec de l'involution de la tête perturbe ou supprime les glandes salivaires et le pharynx. Les laboratoire Le gène a été initialement nommé ainsi parce qu'il a perturbé l'appendice labial, cependant, le gène de laboratoire n'est pas exprimé dans le segment labial et le phénotype de l'appendice labial est probablement le résultat de la désorganisation générale résultant de l'échec de l'involution de la tête. [17]

Probocipédia Modifier

Les pb Le gène est responsable de la formation des palpes labiaux et maxillaires. Certaines preuves montrent pb interagit avec Scr. [18]

Déformé Modifier

Les Dfd est responsable de la formation des segments maxillaire et mandibulaire dans la tête larvaire. [19] Les phénotypes mutants de Dfd sont semblables à ceux de labial. Perte de fonction de Dfd chez l'embryon entraîne un échec de l'involution de la tête (voir gène labial), avec une perte des structures de la tête larvaire. Les mutations chez l'adulte ont soit des suppressions de parties de la tête, soit des transformations de la tête en identité thoracique. [17]

Peignes sexuels réduits Modifier

Les Scr gène est responsable du développement céphalique et thoracique dans Drosophile embryon et adulte. [20]

Antennapedia Modifier

Le deuxième segment thoracique, ou T2, développe une paire de pattes et une paire d'ailes. Les Antp Le gène spécifie cette identité en favorisant la formation des pattes et en permettant (mais pas en activant directement) la formation des ailes. Une dominante Antp mutation, causée par une inversion chromosomique, provoque Antp à exprimer dans le disque imaginal antennaire, de sorte qu'au lieu de former une antenne, le disque forme une patte, ce qui fait qu'une patte sort de la tête de la mouche. [ citation requise ]

Ultrabithorax Modifier

Le troisième segment thoracique, ou T3, porte une paire de pattes et une paire de haltères (ailes très réduites qui fonctionnent en équilibre pendant le vol). Ubx motifs T3 en grande partie en réprimant les gènes impliqués dans la formation des ailes. Le limbe de l'aile est composé de deux couches de cellules qui adhèrent étroitement les unes aux autres et sont alimentées en nutriments par plusieurs nervures des ailes. L'un des nombreux gènes qui Ubx represses est cloqué, ce qui active les protéines impliquées dans l'adhésion cellule-cellule, et le spalt, qui modèle le placement des veines des ailes. Dans Ubx mutants à perte de fonction, Ubx ne réprime plus les gènes des ailes, et les haltères se développent comme une deuxième paire d'ailes, ce qui donne les fameuses mouches à quatre ailes. Lorsque Ubx est mal exprimé dans le deuxième segment thoracique, comme cela se produit chez les mouches avec la mutation amplificatrice "Cbx", il réprime les gènes des ailes, et les ailes se développent comme des haltères, ce qui donne une mouche à quatre licou. [ citation requise ]

Abdominal-A Modifier

Dans Drosophile, abd-A est exprimé le long de la majeure partie de l'abdomen, des segments abdominaux 1 (A1) à A8. Expression de abd-A est nécessaire de préciser l'identité de la plupart des segments abdominaux. Une fonction majeure de abd-A chez les insectes est de réprimer la formation des membres. Dans abd-A mutants de perte de fonction, les segments abdominaux A2 à A8 sont transformés en une identité plus proche de A1. Lorsque abd-A est exprimé de manière ectopique dans tout l'embryon, tous les segments antérieurs à A4 sont transformés en une identité abdominale de type A4. [17] Le gène abd-A affecte également le modèle de génération de cuticules dans l'ectoderme et le modèle de génération de muscles dans le mésoderme. [18]

Abdominal-B Modifier

Gène abd-B est transcrit sous deux formes différentes, une protéine régulatrice et une protéine morphogène. Réglementaire abd-B supprimer les structures épidermiques ventrales embryonnaires dans les huitième et neuvième segments du Drosophile abdomen. La protéine régulatrice et la protéine morphogène sont toutes deux impliquées dans le développement du segment de queue. [18]

Les protéines avec un degré élevé de similitude de séquence sont également généralement supposées présenter un degré élevé de similitude fonctionnelle, c'est-à-dire que les protéines Hox avec des homéodomaines identiques sont supposées avoir des propriétés de liaison à l'ADN identiques (à moins que des séquences supplémentaires ne soient connues pour influencer la liaison à l'ADN). Pour identifier l'ensemble de protéines entre deux espèces différentes qui sont les plus susceptibles d'être les plus similaires en fonction, des schémas de classification sont utilisés. Pour les protéines Hox, il existe trois schémas de classification différents : basé sur l'inférence phylogénétique, basé sur la synténie et basé sur la similarité de séquence. [21] Les trois schémas de classification fournissent des informations contradictoires pour les protéines Hox exprimées au milieu de l'axe du corps (Hox6-8 et Antp, Ubx et abd-A). Une approche combinée a utilisé des informations basées sur l'inférence phylogénétique des différentes espèces et a tracé les types de séquences protéiques sur l'arbre phylogénétique de l'espèce. L'approche a identifié les protéines qui représentent le mieux les formes ancestrales (Hox7 et Antp) et les protéines qui représentent de nouvelles versions dérivées (ou ont été perdues dans un ancêtre et sont maintenant manquantes dans de nombreuses espèces). [22]

Les gènes Hox agissent à de nombreux niveaux au sein des hiérarchies génétiques développementales : au niveau « exécutif », ils régulent des gènes qui à leur tour régulent de grands réseaux d'autres gènes (comme la voie génique qui forme un appendice). Ils régulent également directement ce qu'on appelle les gènes réalisateurs ou les gènes effecteurs qui agissent au bas de ces hiérarchies pour former finalement les tissus, les structures et les organes de chaque segment. La segmentation implique des processus tels que la morphogenèse (différenciation des cellules précurseurs dans leurs cellules spécialisées terminales), l'association étroite de groupes de cellules avec des destins similaires, la sculpture des structures et des limites des segments via la mort cellulaire programmée, et le mouvement des cellules d'où elles sont d'abord nés là où ils fonctionneront finalement, il n'est donc pas surprenant que les gènes cibles des gènes Hox favorisent la division cellulaire, l'adhésion cellulaire, l'apoptose et la migration cellulaire. [5]

requis pour la morphologie viscérale normale

limite entre le maxillaire et la mandibule de la tête

membre distal qui formera les os des doigts, du carpe et du tarse

monocytes (globules blancs), avec arrêt du cycle cellulaire

La séquence d'ADN liée par la protéine homéodomaine contient la séquence nucléotidique TAAT, le T terminal 5' étant le plus important pour la liaison. [27] Cette séquence est conservée dans presque tous les sites reconnus par les homéodomaines et distingue probablement de tels emplacements comme des sites de liaison à l'ADN. Les paires de bases suivant cette séquence initiale sont utilisées pour distinguer les protéines homéodomaines, qui ont toutes des sites de reconnaissance similaires. Par exemple, le nucléotide suivant la séquence TAAT est reconnu par l'acide aminé en position 9 de la protéine homéodomaine. Dans la protéine maternelle Bicoid, cette position est occupée par la lysine, qui reconnaît et se lie au nucléotide guanine. Dans Antennapedia, cette position est occupée par la glutamine, qui reconnaît et se lie à l'adénine. Si la lysine dans Bicoid est remplacée par la glutamine, la protéine résultante reconnaîtra les sites activateurs de liaison à Antennapedia. [28]

Cependant, tous les facteurs de transcription contenant un homéodomaine se lient essentiellement à la même séquence d'ADN. La séquence liée par l'homéodomaine d'une protéine Hox ne fait que six nucléotides de long, et une séquence aussi courte serait trouvée au hasard plusieurs fois dans le génome, bien plus que le nombre de sites fonctionnels réels. Surtout pour les protéines Hox, qui produisent des changements morphologiques si spectaculaires lorsqu'elles sont mal exprimées, cela soulève la question de savoir comment chaque facteur de transcription peut produire des résultats aussi spécifiques et différents s'ils se lient tous à la même séquence. Un mécanisme qui introduit une plus grande spécificité de séquence d'ADN pour les protéines Hox est de lier les cofacteurs protéiques. Deux de ces cofacteurs Hox sont l'extradenticule (Exd) et l'homothorax (Hth). Exd et Hth se lient aux protéines Hox et semblent induire des changements de conformation de la protéine Hox qui augmentent sa spécificité. [29]

Tout comme les gènes Hox régulent les gènes réalisateurs, ils sont à leur tour régulés par d'autres gènes. Chez la drosophile et certains insectes (mais pas la plupart des animaux), les gènes Hox sont régulés par les gènes gap et les gènes pair-rule, qui sont à leur tour régulés par l'ARNm fourni par la mère. Il en résulte une cascade de facteurs de transcription : les facteurs maternels activent les gènes gap ou pair-rule gap et les gènes pair-rule activent les gènes Hox puis, enfin, les gènes Hox activent les gènes réalisateurs qui provoquent la différenciation des segments dans l'embryon en développement. La régulation est réalisée via des gradients de concentration en protéines, appelés champs morphogéniques. Par exemple, des concentrations élevées d'une protéine maternelle et de faibles concentrations d'autres protéines activeront un ensemble spécifique de gènes gap ou pair-rule. Chez les mouches, la bande 2 dans l'embryon est activée par les protéines maternelles Bicoid et Bossu, mais réprimée par les protéines gap Giant et Kruppel. Ainsi, la bande 2 ne se formera que là où il y a du Bicoïde et du Bossu, mais ne pas où il y a Giant et Kruppel. [30]

Il a été démontré que les brins de microARN situés dans les clusters Hox inhibent plus de gènes hox antérieurs ("phénomène de prévalence postérieure"), peut-être pour mieux affiner son modèle d'expression. [31]

L'ARN non codant (ARNnc) s'est avéré abondant dans les clusters Hox. Chez l'homme, 231 ARNnc peuvent être présents. L'un d'eux, HOTAIR, fait taire en trans (il est transcrit à partir du cluster HOXC et inhibe les gènes HOXD tardifs) en se liant aux protéines du groupe Polycomb (PRC2). [32]

La structure de la chromatine est essentielle pour la transcription, mais elle nécessite également que le cluster sorte en boucle du territoire chromosomique. [33]

Chez les animaux supérieurs, y compris les humains, l'acide rétinoïque régule l'expression différentielle des gènes Hox le long de l'axe antéropostérieur. [34] Les gènes des extrémités 3' des clusters Hox sont induits par l'acide rétinoïque, ce qui entraîne des domaines d'expression qui s'étendent plus en avant dans le corps par rapport aux gènes 5' Hox qui ne sont pas induits par l'acide rétinoïque, ce qui entraîne des domaines d'expression qui restent plus postérieurs.

La PCR quantitative a montré plusieurs tendances concernant la colinéarité : le système est en équilibre et le nombre total de transcrits dépend du nombre de gènes présents selon une relation linéaire. [35]

Chez certains organismes, notamment les vertébrés, les différents gènes Hox sont situés très près les uns des autres sur le chromosome en groupes ou en amas. L'ordre des gènes sur le chromosome est le même que l'expression des gènes dans l'embryon en développement, le premier gène étant exprimé à l'extrémité antérieure de l'organisme en développement. La raison de cette colinéarité n'est pas encore complètement comprise, mais pourrait être liée à l'activation des gènes Hox dans une séquence temporelle par un déballage progressif de la chromatine le long d'un groupe de gènes. Le diagramme ci-dessus montre la relation entre les gènes et l'expression des protéines chez les mouches. [ citation requise ]

Les gènes Hox sont nommés pour les phénotypes homéotiques qui se produisent lorsque leur fonction est perturbée, dans lesquels un segment se développe avec l'identité d'un autre (par exemple, les pattes où les antennes devraient être). Les gènes Hox dans différents phylums ont reçu des noms différents, ce qui a conduit à une confusion sur la nomenclature. Le complément des gènes Hox dans Drosophile est composé de deux groupes, le complexe Antennapedia et le complexe Bithorax, qui, ensemble, étaient historiquement appelés HOM-C (pour Homeotic Complex). Bien qu'historiquement les gènes HOM-C aient fait référence à Drosophile homologues, alors que les gènes Hox faisaient référence à des homologues vertébrés, cette distinction n'est plus faite, et les gènes HOM-C et Hox sont appelés gènes Hox. [ citation requise ]

Vertébrés Modifier

Les souris et les humains ont 39 gènes Hox répartis en quatre groupes : [36] [37]

Grappe Chromosome humain Gènes
[email protected] chromosome 7 HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXA11, HOXA13
[email protected] chromosome 17 HOXB1, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXB13
[email protected] chromosome 12 HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13
[email protected] chromosome 2 HOXD1, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13

The ancestors of vertebrates had a single Hox gene cluster, [38] [39] [ citation requise ] which was duplicated (twice) early in vertebrate evolution by whole genome duplications to give four Hox gene clusters: Hoxa, Hoxb, Hoxc and Hoxd. It is currently unclear whether these duplications occurred before or after divergence of lampreys and hagfish from the rest of vertebrates. [40] Most mammals, amphibians, reptiles and birds have four HOX clusters, while most teleost fish, including zebrafish and medaka, have seven or eight Hox gene clusters because of an additional genome duplication which occurred in their evolutionary history. [41] [36] In zebrafish, one of the eight Hox gene clusters (a Hoxd cluster) has lost all protein-coding genes, and just a single microRNA gene marks the location of the original cluster. [42] In some teleost fish, such as salmon, an even more recent genome duplication occurred, doubling the seven or eight Hox gene clusters to give at least 13 clusters [43]

Hox genes, especially those of the HoxA and HoxD clusters, are implicated in the limb regeneration abilities of Amphibians and Reptiles. [44] In addition, one of the bat accelerated regions (analogous to human accelerated regions) called BAR116 is an enhancer that defines a unique expression pattern of HoxD genes in the fore and hind limbs, possibly playing a role in the evolution of wings. [45]

Amphioxus Edit

Amphioxus such as Branchiostoma floridae have a single Hox cluster with 15 genes, known as AmphiHox1 à AmphiHox15. [46]

Other Invertebrates Edit

Six Hox genes are dispersed in the genome of Caenorhabditis elegans, a roundworm. [10] ( fig. 3 ) Hydra et Nematostella vectensis, both in the Phylum Cnidaria, have a few Hox/ParaHox-like homeobox genes. [47] [11] Hox gene expression has also been studied in brachiopods, [48] annelids, [49] and a suite of molluscs. [50]

The Hox genes are so named because mutations in them cause homeotic transformations. Homeotic transformations were first identified and studied by William Bateson in 1894, who coined the term "homeosis". After the rediscovery of Mendel's genetic principles, Bateson and others realized that some examples of homeosis in floral organs and animal skeletons could be attributed to variation in genes.

Definitive evidence for a genetic basis of some homeotic transformations was obtained by isolating homeotic mutants. The first homeotic mutant was found by Calvin Bridges in Thomas Hunt Morgan's laboratory in 1915. This mutant shows a partial duplication of the thorax and was therefore named Bithorax (bx). It transforms the third thoracic segment (T3) toward the second (T2). Bithorax arose spontaneously in the laboratory and has been maintained continuously as a laboratory stock ever since. [51]

The genetic studies by Morgan and others provided the foundation for the systematic analyses of Edward B. Lewis and Thomas Kaufman, which provided preliminary definitions of the many homeotic genes of the Bithorax and Antennapedia complexes, and also showed that the mutant phenotypes for most of these genes could be traced back to patterning defects in the embryonic body plan.

Ed Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard and Eric F. Wieschaus identified and classified 15 genes of key importance in determining the body plan and the formation of body segments of the fruit fly D. melanogaster in 1980. [52] For their work, Lewis, Nüsslein-Volhard, and Wieschaus were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1995. [53]

In 1983, the homeobox was discovered independently by researchers in two labs: Ernst Hafen, Michael Levine, and William McGinnis (in Walter Gehring's lab at the University of Basel, Switzerland) and Matthew P. Scott and Amy Weiner (in Thomas Kaufman's lab at Indiana University in Bloomington).

Hox genes play critical roles in the development of structures such as limbs, lungs, the nervous system, and eyes. As T. R. Lappin and colleagues observed in 2006, "Evolutionary conservation provides unlimited scope for experimental investigation of the functional control of the Hox gene network which is providing important insights into human disease." In the future, more research can be done in investigating the roles of Hox genes in Leukaemia and cancer (such as EOC). [36]


Méthodes

Database Searches and Retrieval of Protein Sequences

Thorough TBlastN searches with several divergent homeodomain proteins of plants and animals were performed to retrieve homeobox genes of Arabidopsis through the TAIR database server (http://www.arabidopsis.org) and of rice through the Gramene database server (http://www.gramene.org). Likewise, analogous searches were performed for the maize genome, through the TAIR maize genome server (http://tigrblast.tigr.org/tgi_maize/) as well as the Plant Genome Database server (http://www.plantgdb.org/PlantGDB-cgi/blast/PlantGDBblast). The plant genome database server was also used to retrieve homeodomain sequences from other plants. The JGI Blast server (http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/) was used to retrieve all the Selaginella, moss, and poplar homeobox genes using TBlastN searches against the genomic sequence. Similarly, the TIGR Medicago genome server (http://tigrblast.tigr.org/er-blast/index.cgi?project=mtbe) was used to retrieve Medicago homeodomain sequences. A local database was created using Filemaker Pro 5 (Filemaker, Inc.) to store the retrieved sequences, annotations, accession numbers, expressed sequence tags (ESTs), and chromosomal location. Les National Center for Biotechnology Information (NCBI) version of Mac Os X Blast (ftp.ncbi.nih.gov) was installed on a PowerMacG4 computer. The protein sequences in the Filemaker Pro 5 database were exported and reformatted for the local Blast. In order to remove the redundancy in the database, each sequence in the database was blasted against the database, and redundant entries were consolidated. New rounds of BlastP and TBlastN searches of the nr protein and GenBank databases at NCBI restricted to Arabidopsis thaliana using default values were carried out using representative homeodomains of different classes from plants and animals as a query (e.g., POU, LIM, CUT, Antp, HD-ZIP, BEL [ Bürglin 1994]). Hits from these searches were checked against data in the local Filemaker database using the “Search” feature (e.g., accession numbers, or N-terminal protein sequences), or a local Blast search of a retrieved hit was performed against the local database. New sequences identified in this fashion were added to the database. A preliminary Neighbor-Joining tree was generated, and PSI-Blast searches with a member of each evolutionary group used as a query were carried out against the nr protein database at NCBI, and iterations were stopped when no new sequences were detected. Every hit for the BlastP, TBlastN, and PSI-Blast searches was manually examined for its potential to be a homeodomain, according to the criteria outlined in the text. No particular e value was taken as an automatic cut-off point, as the goal was to detect as many homeobox genes as possible. In a few instances, Blast matrix and expected value were relaxed to include additional sequences, which were then checked manually for their potential as homeodomain sequences. Arabidopsis thaliana ESTs at NCBI were searched using each entry of our local database as a query using TBlastN. Searches of newly discovered conserved domains/motifs linked to homeobox genes were carried out using BlastP with default values and without species restriction, unless the results would lead to too many hits (e.g., PHD, DDT). All A. thaliana homeodomain protein entries (mislabeled as Hox) in the SMART database were also checked against the local database.

For rice, maize, and poplar, the genomic sequences of the few thousand nucleotides upstream and downstream of the homeodomain were analyzed to predict the complete homeodomain protein sequences using either the MIT Genescan server or the softberry FGENESH+ server, using the most similar plant gene from the blast searches as a guide. In the multiple sequence alignment, if the homeodomain showed obvious misalignment, the most similar plant sequence was used as a guide to correct the homeodomain following a three-frame translation of the sequence and manual determination of potential intron and exon boundaries. A similar procedure was used in some sequences that showed obvious gaps and misalignments within conserved domains upon sequence alignment. In those cases, the genomic sequence was examined, and it was compared either as three-frame translation with a closely related protein sequence or as DNA against a closely related DNA sequence, using the dot matrix program PPCMatrix ( Bürglin 1998b). The genomic sequence was translated in all three frames in PPCMatrix and examined for splice sites in the regions where the sequence similarity terminated. In the case of maize, part of the homeodomain could be found in one contig and the other part in a different contig. In this case, manual contig assemblies were carried out and finally confirmed by Blast searches. In several cases, Arabidopsis homeobox genes were repredicted with FGENSH+ using the most similar gene ortholog as a guide to obtain the full-length protein.

The European Molecular Biology Open Software suite was used for pairwise alignment and for locating the homeodomain sequence within a protein sequence. Sequences were submitted also to the SMART and NCBI CDD ( Schultz et al. 1998 Marchler-Bauer et al. 2003) to identify conserved domains. These databases did not contain or identify many of the conserved motifs and unusual homeodomain sequences.

The homeodomain DNA from representative members of each class were blasted against the JGI Chlamydomonas project Blast server (http://genome.jgi-psf.org/Chlre3/Chlre3.home.html) to retrieve the Chlamydomonas reinhardtii homeodomain sequences. Similarly, to recover the homeodomain protein sequences of Physcomitrella patens, TBlastN searches were performed at JGI (http://genome.jgi-psf.org/).

Multiple Sequence Alignment and Phylogenetic Analysis

The multiple sequence alignment tool MUSCLE ( Edgar 2004) was used for multiple protein sequence alignment. Sequences were further edited and aligned manually, when necessary, using the “Seaview” multiple sequence editor ( Galtier et al. 1996). For phylogenetic analyses of conserved domains, sequences were trimmed so that only the relevant protein domains remained in the alignment. Phylogenetic relationships were inferred using the maximum likelihood (ML) method as implemented in PHYML ( Guindon and Gascuel 2003). For the ML trees, the JTT ( Jones et al. 1992) substitution model was used and results were evaluated with 100 or 1,000 bootstrap replicates. Use of alternative substitution models (WAG, LG) did not affect the results in any of the cases tested (results not shown). The generated trees were displayed using TREEVIEW 1.6.6 (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html) and NJPLOT by M. Gouy (http://pbil.univ-lyon1.fr/software/njplot.html).

Secondary Structure Prediction and Protein Homology Modeling

We predicted the secondary structures of several divergent homeodomain sequences using the PHD, JPRED, and Predict Protein servers ( Rost and Sander 1993 Cuff et al. 1998). For homology modeling, the crystal structure of the engrailed homeodomain (PDB id: 1enh) obtained from Protein Data Bank (PDB) was used as a template. The aligned sequences were submitted to SWISS-MODEL (http://www.expasy.org/swissmod/) to obtain the 3D structure of some of the atypical homeodomains. The model was viewed in Swiss-PDB Viewer ( Kaplan and Littlejohn 2001), and the quality of the model was judged by the phi–psi angle represented in Ramachandran Plots.


GPS for chromosomes: Reorganization of the genome during development

The spatial arrangement of genetic material within the cell nucleus plays an important role in the development of an organism. A research team from the University of Basel, in collaboration with scientists from Harvard University, has developed a method to trace the chromosomes in individual cells. Using this method, they have now been able to demonstrate that chromosomes reorganize during embryonic development. The study has recently been published in Cellule moléculaire.

Our body is made up of a wide variety of cells with the most diverse functions. Irrespective of being heart, liver or nerve cells, however, they all contain the same genetic information. The reason why cells develop differently is that only parts of their chromosomes are read. This results in some genes being active while others, in contrast, are silent.

For gene activation, both the way the genes are packaged as well as their spatial organization in the cell nucleus play a decisive role. Prof. Susan Mango's team at the Biozentrum of the University of Basel has now investigated this 3D architecture more closely. Using a novel technique, they were able to trace individual chromosomes during embryonic development in nematodes and show that they rearrange themselves during the early phase.

Chromosome arrangement is not random

If stretched out, all the DNA molecules of a cell would reach about two meters in length. So the DNA must be densely packed to fit into a cell nucleus of only few micrometers in size. The DNA strands are very tightly coiled and twisted to form space-saving structures, called chromosomes. The packaging and the arrangement of the DNA of the chromosomes determines the activity of genes.

In their study, the researchers led by Prof. Susan Mango traced individual chromosomes and investigated their organization during early embryonic development. Embryonic cells of the nematode C. elegans served as a model. "Using a novel technique, we were able to follow the spatial rearrangement of chromosomes in single cells at the beginning of embryogenesis," says Mango. "The advantage of this method is that the cells and tissue remain completely intact."

Early chromosomes resemble a barbell

It is well know that chromosome regions with similar functional properties contact each other and interact. This means that chromosome domains segregated into two compartments, active and inactive. "During early embryogenesis, however, the chromosomes are organized differently," says Ahilya Sawh, first author of the study. "In the early embryo, they are organized into an unconventional barbell-like structure, with inactive compartments separated by a central active region." The researchers discovered that the nuclear lamina -- a protein mesh lining the inner surface of the cell nucleus -- is required to achieve this barbell arrangement. The lamina is attached to the inactive sections and stretches the chromosome.

Chromosomes reorganize during embryogenesis

"Only at a later stage of embryonic development, when the germ layers develop, we actually see the well-known segregation into an active and inactive region," explains Mango. "Using chromosome tracing, we were able to map the whole 3D chromosome architecture and could show for the first time that chromosomes rearrange during early development, a maturation process that requires the nuclear lamina."

The reorganization of the chromosomes accompanies cell maturation and represents a milestone in the development of a complex organism. The correct chromosomal architecture is crucial to prevent developmental disorders.


Cell Growth and Cell Division

Growth is defined as an irreversible increase in mass that is typically associated with an increase in volume. Plant cell growth is associated with meristems and must be carefully regulated in order for organogensis and histogenesis to occur in the appropriate patterns. The plant regulates growth by regulating the extensibility of its cell walls. A cell that has nonextensible cells walls can take up some water, but eventually the physical pressure of the water inside the cell pressing out on the cell wall (the turgor pressure) prevents the entry of additional water and any further change in volume. In contrast, a cell that has extensible cell walls can take up a substantial volume of water and thus increase in size. Turgor pressure that would otherwise prevent water entry momentarily decreases because the walls keep stretching.

Typically cell growth occurs in small increments: (1) wall extensibility increases, reducing turgor pressure (2) reduced turgor pressure allows water to enter the cell, increasing cell volume (3) wall extensibility decreases, allowing the cell to build up turgor and preventing further water entry and (4) the cell undergoes a cycle of synthesis of cytoplasmic and wall components, adding to the cell's mass. This cycle of incremental growth is repeated many times until the cell reaches its final size.

The plant hormones auxin and gibberellin are produced in the vicinity of the apical meristems and usually act in concert to induce cell growth. Both hormones regulate wall extensibility, but carry out this function in different ways. Auxin induces the activity of cell membrane H + adenosine triphosphatase (ATPase) molecules. Proton (H + ) extrusion lowers the pH of the cell wall, thus activating the cell wall enzyme expansin. Expansin cleaves the hydrogen bonds between two cell wall components: The cellulose microfibrils and the hemicellulose molecules that link adjacent cellulose microfibrils. Breakage of these bonds allows these structural wall components to reposition themselves farther apart, increasing wall extensibility. Gibberellic acid, on the other hand, stimulates the activity of another cell wall enzyme called xyloglucan endotransglycosylase (XET). Xyloglucans are a type of hemicellulose that is cleaved by the XET enzyme. Breakage of the

Cell division and cell growth are often tightly linked. When the rate of cell division is balanced by cell growth, as in the apical meristems, average cell size does not increase. As the meristem grows away from earlier formed cells, the ratio of growth to division increases, resulting in overall cell enlargement. As the tissues mature further, cell division ceases completely, giving rise to zones of pure cell enlargement where most of the visible growth of the plant occurs. This relationship between division and growth, coupled with observations of the predictable planes of cell division during histogenesis, indicates that cell division is carefully regulated during plant development.

Molecules called cyclin-dependent kinases (CDKs) are key regulators of cell cycling (including cell division) in plants. CDKs are activated by association with a regulatory subunit called a cyclin and by phosphorylation and dephosphorylation events. The plant hormone cytokinin appears to regulate the cell cycle by interacting with the CDKs. Cytokinins enhance the synthesis of the cyclin subunits that are required for the cell to enter the deoxyribonucleic acid (DNA) synthesis phase of the cell cycle. Cytokinins also enhance the CDK dephosphorylation step that is required for the cell to progress into mitosis . Both of these processes are inhibited by the hormone abscisic acid thus a ⋞velopmental tug-of-war" occurs between a division-enhancing hormone and a division-suppressing hormone. The delicate balance between them determines the rate of cell division and this type of interaction is probably typical of the hormonal regulation of many aspects of plant development.


DNA Sequencing Techniques

DNA sequencing techniques are used to determine the order of nucleotides (A,T,C,G) in a DNA molecule.

Objectifs d'apprentissage

Differentiate among the techniques used to sequence DNA

Points clés à retenir

Points clés

  • Genome sequencing will greatly advance our understanding of genetic biology and has vast potential for medical diagnosis and treatment.
  • DNA sequencing technologies have gone through at least three “generations”: Sanger sequencing and Gilbert sequencing were first-generation, pyrosequencing was second-generation, and Illumina sequencing is next-generation.
  • Sanger sequencing is based on the use of chain terminators, ddNTPs, that are added to growing DNA strands and terminate synthesis at different points.
  • Illumina sequencing involves running up to 500,000,000 different sequencing reactions simultaneously on a single small slide. It makes use of a modified replication reaction and uses fluorescently-tagged nucleotides.
  • Shotgun sequencing is a technique for determining the sequence of entire chromosomes and entire genomes based on producing random fragments of DNA that are then assembled by computers which order fragments by finding overlapping ends.

Mots clés

  • DNA sequencing: a technique used in molecular biology that determines the sequence of nucleotides (A, C, G, and T) in a particular region of DNA
  • dideoxynucleotide: any nucleotide formed from a deoxynucleotide by loss of an a second hydroxyl group from the deoxyribose group
  • in vitro: any biochemical process done outside of its natural biological environment, such as in a test tube, petri dish, etc. (from the Latin for “in glass”)

DNA Sequencing Techniques

While techniques to sequence proteins have been around since the 1950s, techniques to sequence DNA were not developed until the mid-1970s, when two distinct sequencing methods were developed almost simultaneously, one by Walter Gilbert’s group at Harvard University, the other by Frederick Sanger’s group at Cambridge University. However, until the 1990s, the sequencing of DNA was a relatively expensive and long process. Using radiolabeled nucleotides also compounded the problem through safety concerns. With currently-available technology and automated machines, the process is cheaper, safer, and can be completed in a matter of hours. The Sanger sequencing method was used for the human genome sequencing project, which was finished its sequencing phase in 2003, but today both it and the Gilbert method have been largely replaced by better methods.

Sanger Method: In Frederick Sanger’s dideoxy chain termination method, fluorescent-labeled dideoxynucleotides are used to generate DNA fragments that terminate at each nucleotide along the template strand. The DNA is separated by capillary electrophoresis on the basis of size. From the order of fragments formed, the DNA sequence can be read. The smallest fragments were terminated earliest, and they come out of the column first, so the order in which different fluorescent tags exit the column is also the sequence of the strand. The DNA sequence readout is shown on an electropherogram that is generated by a laser scanner.

Sanger Sequencing

The Sanger method is also known as the dideoxy chain termination method. This sequencing method is based on the use of chain terminators, the dideoxynucleotides (ddNTPs). The dideoxynucleotides, or ddNTPSs, differ from deoxynucleotides by the lack of a free 3′ OH group on the five-carbon sugar. If a ddNTP is added to a growing DNA strand, the chain is not extended any further because the free 3′ OH group needed to add another nucleotide is not available. By using a predetermined ratio of deoxyribonucleotides to dideoxynucleotides, it is possible to generate DNA fragments of different sizes when replicating DNA in vitro.

A Sanger sequencing reaction is just a modified in vitro DNA replication reaction. As such the following components are needed: template DNA (which will the be DNA whose sequence will be determined), DNA Polymerase to catalyze the replication reactions, a primer that basepairs prior to the portion of the DNA you want to sequence, dNTPs, and ddNTPs. The ddNTPs are what distinguish a Sanger sequencing reaction from just a replication reaction. Most of the time in a Sanger sequencing reaction, DNA Polymerase will add a proper dNTP to the growing strand it is synthesizing in vitro. But at random locations, it will instead add a ddNTP. When it does, that strand will be terminated at the ddNTP just added. If enough template DNAs are included in the reaction mix, each one will have the ddNTP inserted at a different random location, and there will be at least one DNA terminated at each different nucleotide along its length for as long as the in vitro reaction can take place (about 900 nucleotides under optimal conditions.)

The ddNTPs which terminate the strands have fluorescent labels covalently attached to them. Each of the four ddNTPs carries a different label, so each different ddNTP will fluoresce a different color.

After the reaction is over, the reaction is subject to capillary electrophoresis. All the newly synthesized fragments, each terminated at a different nucleotide and so each a different length, are separated by size. As each differently-sized fragment exits the capillary column, a laser excites the flourescent tag on its terminal nucleotide. From the color of the resulting flouresence, a computer can keep track of which nucleotide was present as the terminating nucleotide. The computer also keeps track of the order in which the terminating nucleotides appeared, which is the sequence of the DNA used in the original reaction.

Second Generation and Next-generation Sequencing

The Sanger and Gilbert methods of sequencing DNA are often called “first-generation” sequencing because they were the first to be developed. In the late 1990s, new methods, called second-generation sequencing methods, that were faster and cheaper, began to be developed. The most popular, widely-used second-generation sequencing method was one called Pyrosequencing.

Today a number of newer sequencing methods are available and others are in the process of being developed. These are often called next-generation sequencing methods. The most widely-used sequencing method currently is one called Illumina sequencing (after the name of the company which commercialized the technique), but numerous competing methods are in the developmental pipeline and may supplant Illumina sequencing.

In Illumina sequencing, up to 500,000,000 separate sequencing reactions are run simultaneously on a single slide (the size of a microscope slide) put into a single machine. Each reaction is analyzed separately and the sequences generated from all 500 million DNAs are stored in an attached computer. Each sequencing reaction is a modified replication reaction involving flourescently-tagged nucleotides, but no chain-terminating dideoxy nucleotides are needed.

When the human genome was first sequenced using Sanger sequencing, it took several years, hundreds of labs working together, and a cost of around $100 million to sequence it to almost completion. Next generation sequencing can sequence a comparably-sized genome in a matter of days, using a single machine, at a cost of under $10,000. Many researchers have set a goal of improving sequencing methods even more until a single human genome can be sequenced for under $1000.

Shotgun Sequencing

Sanger sequence can only produce several hundred nucleotides of sequence per reaction. Most next-generation sequencing techniques generate even smaller blocks of sequence. Genomes are made up of chromosomes which are tens to hundreds of millions of basepairs long. They can only be sequenced in tiny fragments and the tiny fragments have to put in the correct order to generate the uninterrupted genome sequence. Most genomic sequencing projects today make use of an approach called whole genome shotgun sequencing.

Whole genome shotgun sequencing involves isolating many copies of the chromosomal DNA of interest. The chromosomes are all fragmented into sizes small enough to be sequenced (a few hundred basepairs) at random locations. As a result, each copy of the same chromosome is fragmented at different locations and the fragments from the same part of the chromosome will overlap each other. Each fragment is sequenced and sophisticated computer algorithms compare all the different fragments to find which overlaps with which. By lining up the overlapped regions, a process called tiling, the computer can find the largest possible continuous sequences that can be generated from the fragments. Ultimately, the sequence of entire chromosomes are assembled.

Whole genome shotgun sequencing.: In shotgun sequencing, multiple copies of the same chromosome are isolated and then fragmented in random locations. The different copies of the chromosome end up generating different length fragments. When the complete collection of fragments has been sequenced, comparing the sequences of all the fragments will reveal which fragments have ends that overlap with other fragments. The complete sequence from one end of the original DNA to the other can be assembled by following the sequence from the first overlapping fragment to the last.

Genome sequencing will greatly advance our understanding of genetic biology. It has vast potential for medical diagnosis and treatment.


The Late Embryogenesis Abundant Protein Family in Cassava ( Manihot esculenta Crantz): Genome-Wide Characterization and Expression during Abiotic Stress

Late embryogenesis abundant (LEA) proteins, as a highly diverse group of polypeptides, play an important role in plant adaptation to abiotic stress however, LEAs from cassava have not been studied in cassava. In this study, 26 LEA members were genome-wide identified from cassava, which were clustered into seven subfamily according to evolutionary relationship, protein motif, and gene structure analyses. Chromosomal location and duplication event analyses suggested that 26 MeLEAs distributed in 10 chromosomes and 11 MeLEA paralogues were subjected to purifying selection. Transcriptomic analysis showed the expression profiles of MeLEAs in different tissues of stem, leaves, and storage roots of three accessions. Comparative transcriptomic analysis revealed that the function of MeLEAs in response to drought may be differentiated in different accessions. Compared with the wild subspecies W14, more MeLEA genes were activated in cultivated varieties Arg7 and SC124 after drought treatment. Nombreuses MeLEA genes showed induction under various stresses and related signaling treatments. Taken together, this study demonstrates the transcriptional control of MeLEAs in tissue development and the responses to abiotic stress in cassava and identifies candidate genes for improving crop resistance to abiotic stress.

Mots clés: abiotic stress cassava characterization genome-wide analysis late embryogenesis abundant (LEA) protein.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Les figures

Evolutionary analysis of the LEAs…

Evolutionary analysis of the LEAs from cassava, rice, and Arabidopsis . A total…

The conserved motifs of the…

The conserved motifs of the MeLEAs according to the evolutionary classification. The conserved…

The exon-intron structure of the…

The exon-intron structure of the MeLEAs based on the evolutionary relationship. Exon-intron analysis…

Distribution of the MeLEAs on…

Distribution of the MeLEAs on chromosomes. The 26 MeLEAs were mapped to 10…

Segmental duplication of LEA genes…

Segmental duplication of LEA genes in cassava. Chromosomes are illustrated in different colour…

Expression patterns of MeLEAs in…

Expression patterns of MeLEAs in different tissues and in response to drought stress.…

Expression profiles of the MeLEAs…

Expression profiles of the MeLEAs in leaves under salt, osmotic, cold, H 2…


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