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Comment le Guide RNA est-il créé pour Crispr ?


Il semble que pour modifier l'ADN un guide ARN et Cripr soient introduits.

Mais je suis incapable de comprendre comment l'ARN guide est fabriqué ou créé.

Est-ce une méthode simple qui peut être réalisée avec un équipement de laboratoire simple ou est-ce compliqué ?

Quel est le matériel nécessaire pour le créer ?


Nouveau type de technologie CRISPR pour cibler l'ARN, y compris les virus à ARN comme le coronavirus

Les criblages génétiques basés sur CRISPR ont aidé les scientifiques à identifier les gènes qui sont des acteurs clés de la drépanocytose, de l'immunothérapie du cancer, des métastases du cancer du poumon et de nombreuses autres maladies. Cependant, ces criblages génétiques ont une portée limitée : ils ne peuvent que modifier ou cibler l'ADN. Pour de nombreuses régions du génome humain, le ciblage de l'ADN peut ne pas être efficace, et d'autres organismes, tels que les virus à ARN comme le coronavirus ou la grippe, ne peuvent pas du tout être ciblés avec les écrans CRISPR de ciblage de l'ADN existants.

Maintenant, dans une nouvelle ressource importante pour la communauté scientifique publiée aujourd'hui dans Biotechnologie naturelle, des chercheurs du laboratoire de Neville Sanjana, PhD, du New York Genome Center et de l'Université de New York ont ​​développé un nouveau type de technologie de criblage CRISPR pour cibler l'ARN.

Les chercheurs ont capitalisé sur une enzyme CRISPR récemment caractérisée appelée Cas13 qui cible l'ARN au lieu de l'ADN. À l'aide de Cas13, ils ont conçu une plate-forme optimisée pour des criblages génétiques massivement parallèles au niveau de l'ARN dans les cellules humaines. Cette technologie de criblage peut être utilisée pour comprendre de nombreux aspects de la régulation de l'ARN et pour identifier la fonction des ARN non codants, qui sont des molécules d'ARN qui sont produites mais ne codent pas pour les protéines.

En ciblant des milliers de sites différents dans les transcrits d'ARN humains, les chercheurs ont développé un modèle prédictif basé sur l'apprentissage automatique pour accélérer l'identification des ARN guides Cas13 les plus efficaces. La nouvelle technologie est disponible pour les chercheurs via un site Web interactif et une boîte à outils open source pour prédire l'efficacité de l'ARN guide pour des cibles d'ARN personnalisées et fournit des ARN guides préconçus pour tous les gènes codant pour les protéines humaines.

"Nous prévoyons que les enzymes Cas13 ciblant l'ARN auront un impact important sur la biologie moléculaire et les applications médicales, mais on sait peu de choses sur la conception de l'ARN guide pour une efficacité de ciblage élevée", a déclaré le Dr Sanjana, auteur principal de l'étude. « Nous avons entrepris de changer cela grâce à une étude approfondie et systématique visant à développer des principes clés et une modélisation prédictive pour une conception de guide la plus efficace. »

Le Dr Sanjana est membre principal du corps professoral du New York Genome Center, professeur adjoint de biologie à l'Université de New York et professeur adjoint de neurosciences et de physiologie à la NYU School of Medicine.

Les enzymes Cas13 sont des enzymes CRISPR de type VI (répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster) qui ont récemment été identifiées comme des protéines de ciblage d'ARN guidées par l'ARN avec une activité nucléase qui permet l'inactivation du gène cible sans altérer le génome. Cette propriété fait de Cas13 une thérapeutique potentiellement importante pour influencer l'expression des gènes sans altérer de façon permanente la séquence du génome.

« C'est le genre d'innovation technologique que nous encourageons et développons au New York Genome Center. Cette dernière technologie CRISPR du Sanjana Lab a des implications passionnantes pour faire avancer les domaines de la génomique et de la médecine de précision », a déclaré Tom Maniatis, PhD, Evnin Family Directeur scientifique et chef de la direction, New York Genome Center.

Le chercheur postdoctoral Hans-Hermann Wessels et le doctorant Alejandro Méndez-Mancilla, qui sont les co-premiers auteurs de l'étude, ont développé une suite de nouveaux outils basés sur Cas13 et réalisé un écran de pavage et de permutation de transcriptions dans des cellules de mammifères. Au total, les chercheurs ont rassemblé des informations pour plus de 24 000 guides de ciblage d'ARN.

"Nous avons superposé des ARN de guidage à travers de nombreux transcrits différents, y compris plusieurs gènes humains où nous pouvions facilement mesurer le knock-down du transcrit via la coloration des anticorps et la cytométrie en flux", a déclaré le Dr Wessels. "En cours de route, nous avons découvert des informations biologiques intéressantes qui pourraient étendre l'application des enzymes Cas13 ciblant l'ARN." Parmi les découvertes de l'équipe, par exemple, figurent des informations sur les régions de l'ARN guide qui sont les plus importantes pour la reconnaissance d'un ARN cible. À l'aide de milliers d'ARN guides avec 1, 2 ou 3 mésappariements à une seule lettre avec leur ARN cible, ils ont identifié une région "graine" critique qui est extrêmement sensible aux mésappariements entre le guide CRISPR et la cible. Cette découverte aidera les scientifiques à concevoir des ARN de guidage pour éviter une activité hors cible sur des ARN cibles involontaires. Puisqu'une cellule humaine typique exprime environ 100 000 ARN, un ciblage précis de Cas13 uniquement sur la cible visée est vital pour le criblage et les applications thérapeutiques.

En plus d'approfondir notre compréhension des cibles hors-cibles Cas13, la région "graine" pourrait être utilisée pour les biocapteurs de nouvelle génération qui peuvent distinguer plus précisément les espèces d'ARN étroitement apparentées. Au total, cette étude augmente le nombre de points de données des études Cas13 précédentes dans les cellules de mammifères de plus de deux ordres de grandeur.

« Nous sommes particulièrement ravis d'utiliser le système de criblage optimisé Cas13 pour cibler les ARN non codants », a déclaré le co-premier auteur Méndez-Mancilla. "Cela élargit considérablement la boîte à outils CRISPR pour les criblages génétiques et transcriptomiques avancés." Dans l'étude, les chercheurs ont remarqué une différence marquée dans la précipitation des protéines lors du ciblage de différents éléments codant et non codant pour les protéines des ARN messagers, et ont trouvé des preuves que Cas13 est en concurrence avec d'autres protéines de liaison à l'ARN impliquées dans le traitement et l'épissage des transcrits.

L'équipe a récemment tiré parti de son modèle prédictif d'ARN guide pour une analyse particulièrement critique : l'urgence de santé publique COVID-19 est due à un coronavirus, qui contient un ARN - et non de l'ADN - génome. En utilisant le modèle dérivé de leurs criblages massivement parallèles, les chercheurs ont identifié des ARN guides optimaux qui pourraient être utilisés pour de futures applications de détection et thérapeutiques.


ARN guide spécifique à la mutation pour la correction sans cicatrice sur cible de porphyrie hétérozygote composée par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches

CRISPR/Cas9 est une technologie prometteuse pour la correction génétique. Cependant, l'édition est souvent biallélique, et de petites insertions et suppressions incontrôlées (indels) concomitantes à une correction précise sont créées. Des ARN guides spécifiques à la mutation ont été récemment testés pour corriger les maladies héréditaires dominantes, en épargnant l'allèle de type sauvage. Nous avons testé une approche originale pour corriger les mutations récessives hétérozygotes composées. Nous avons comparé l'efficacité d'édition et la génotoxicité par l'ARN guide biallélique par rapport à l'ARN guide spécifique à l'allèle mutant dans les CSPi dérivées d'un patient atteint de porphyrie érythropoïétique congénitale porteur de mutations hétérozygotes composées entraînant l'invalidation du gène UROS. Nous avons obtenu le sauvetage de la fonction UROS et la correction métabolique avec les deux guides avec le potentiel d'utilisation pour l'intervention clinique de la porphyrie. Cependant, contrairement au guide biallélique, le guide spécifique à l'allèle mutant était exempt de dommages collatéraux sur la cible. Nous recommandons cette conception pour éviter la génotoxicité et pour obtenir une correction génique sans cicatrice sur la cible pour la maladie récessive avec des cas fréquents de mutations hétérozygotes composées.

Mots clés: CRISPR/Cas9 composé hétérozygote maladie récessive porphyrie érythropoïétique congénitale thérapie génique iPSCs mutation spécifique édition précise du génome.

Copyright © 2020 Les auteurs. Publié par Elsevier Inc. Tous droits réservés.


Systèmes CRISPR

Les bactéries et les archées possèdent une immunité adaptative contre les éléments génétiques étrangers à l'aide des systèmes CRISPR-Cas. Lors de l'infection, de nouvelles séquences d'ADN étranger sont capturées et intégrées dans le locus CRISPR hôte en tant que nouveaux espaceurs. Le locus CRISPR est transcrit et traité pour générer des ARN CRISPR matures, chacun codant pour une séquence d'espacement unique. Chaque ARNcr s'associe aux protéines effectrices Cas qui utilisent les ARNcr comme guides pour faire taire les éléments génétiques étrangers qui correspondent à la séquence de l'ARNcr. Nous sommes intéressés à élucider les mécanismes sous-jacents à l'immunité CRISPR-Cas, en particulier à comprendre les fonctions des protéines Cas et à développer de nouveaux outils basés sur CRISPR pour les applications biotechnologiques.

Les systèmes CRISPR-Cas sont très divers et ont été divisés en de nombreux sous-types. Le système de type I-E dans E. coli utilise le complexe Cascade pour le silençage guidé par l'ARN de l'ADN étranger. Cascade est composé de sous-unités Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e et Cas6e et d'un ARNcr, formant une structure qui lie et déroule l'ADNdb pour former une boucle R. Récemment, nous avons utilisé des reconstructions par microscopie électronique à particule unique de Cascade liée à l'ADNdb avec et sans Cas3 pour révéler que Cascade positionne l'extrémité proximale PAM du duplex d'ADN au niveau de la sous-unité Cse1 et près du site d'association Cas3. La découverte que la cible d'ADN et Cas3 colocalisent avec Cse1 implique cette sous-unité dans une étape clé de validation de cible lors d'une interférence d'ADN. Nous montrons biochimiquement que l'appariement des bases de la région PAM est inutile pour la liaison cible mais essentiel pour la dégradation médiée par Cas3. Ensemble, ces données montrent que la sous-unité Cse1 de Cascade fonctionne comme un partenaire essentiel de Cas3 en reconnaissant les sites cibles d'ADN et en positionnant Cas3 adjacent au PAM pour assurer le clivage (en collaboration avec Eva Nogales, UC Berkeley, HHMI).

Les systèmes CRISPR-Cas de type II utilisent une endonucléase d'ADN guidée par l'ARN, Cas9, pour générer des cassures double brin dans l'ADN invasif au cours d'une réponse immunitaire bactérienne adaptative. Le clivage médié par Cas9 dépend strictement de la présence d'un motif adjacent de protospacer (PAM) dans l'ADN cible. La capacité de programmer Cas9 pour le clivage de l'ADN sur des sites spécifiques définis par des ARN guides a conduit à son adoption en tant que plate-forme polyvalente pour l'ingénierie du génome et la régulation des gènes. Pour comprendre comment Cas9 utilise son ARN guide pour l'interrogation des séquences d'ADN cibles, nous avons résolu les structures moléculaires de Cas9 dans les états apo, guide lié à l'ARN et cible lié à l'ADN. Les structures cristallines de Cas9 liées à l'ARN à guide unique révèlent une conformation distincte des états apo et liés à l'ADN, dans laquelle la séquence de «graine» d'ARN à 10 nucléotides requise pour l'interrogation initiale de l'ADN est pré-ordonnée dans une conformation de forme A. Ce segment de l'ARN guide est essentiel pour que Cas9 forme une structure compétente pour la reconnaissance de l'ADN, prête à engager des séquences cibles d'ADN double brin. Nous interprétons cela comme une évolution convergente d'un mécanisme de « graine » rappelant celui utilisé par les protéines Argonaute lors de l'interférence ARN chez les eucaryotes.

Les complexes de surveillance guidée par ARN CRISPR ciblent l'ADN étranger pour la dégradation par appariement de bases ARN-ADN et reconnaissance d'une séquence unique adjacente à l'ADN cible appelée motif adjacent protospacer (PAM). Notre recherche a récemment porté sur la façon dont l'ADN se déroule au cours de cet événement de liaison et sur la manière dont les séquences cibles courtes de 20 à 30 paires de bases sont efficacement localisées et reconnues dans des génomes entiers. En collaboration avec le laboratoire d'Eric Greene à l'Université de Columbia, nous avons appliqué une combinaison d'expériences biochimiques à molécule unique et en masse pour résoudre le mécanisme d'interrogation de l'ADN pour deux complexes phylogénétiquement sans rapport : Cas9, la protéine de ciblage de l'ADN trouvée dans le type II CRISPR-Cas (S. pyogenes) et Cascade, le complexe de ciblage d'ADN trouvé dans les systèmes CRISPR-Cas de type IE (E. coli). Nos résultats ont révélé que la recherche de cible est guidée par PAM et que ces complexes distincts guidés par l'ARN ont convergé vers un mécanisme commun de reconnaissance de l'ADN cible.


Explication : Comment fonctionne CRISPR

Les scientifiques utilisent un outil appelé CRISPR/Cas9 pour modifier l'ADN.

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Les scientifiques hésitent généralement à utiliser le mot miracle. À moins qu'ils ne parlent de l'outil d'édition de gènes appelé CRISPR, bien sûr. « Vous pouvez tout faire avec CRISPR », disent certains. D'autres l'appellent simplement incroyable.

En effet, il a émerveillé tellement de monde et si rapidement que huit ans seulement après l'avoir découvert, Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier ont remporté le prix Nobel de chimie 2020.

CRISPR signifie "clustered regularly interspaced short palindrome répète. Ces répétitions se trouvent dans l'ADN des bactéries. Ce sont en fait des copies de petits morceaux de virus. Les bactéries les utilisent comme des collections de photos d'identité pour identifier les virus malveillants. Cas9 est un enzyme qui peut couper l'ADN. Les bactéries combattent les virus en envoyant l'enzyme Cas9 pour hacher les virus qui ont une photo d'identité dans la collection. Les scientifiques ont récemment découvert comment les bactéries font cela. Maintenant, en laboratoire, les chercheurs utilisent une approche similaire pour transformer le système de lutte contre les virus du microbe en le nouvel outil de laboratoire le plus en vogue.

Cet outil CRISPR/Cas9 a été décrit pour la première fois en 2012 et 2013. Les laboratoires scientifiques du monde entier ont rapidement commencé à l'utiliser pour modifier le génome d'un organisme - l'ensemble de ses instructions ADN.

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Cet outil peut rapidement et efficacement modifier presque n'importe quel gène dans n'importe quelle plante ou animal. Des chercheurs l'ont déjà utilisé pour soigner des maladies génétiques chez les animaux, lutter contre les virus et stériliser les moustiques. Ils l'ont également utilisé pour préparer des organes de porcs pour des greffes humaines et pour renforcer les muscles des beagles.

Jusqu'à présent, le plus grand impact de CRISPR a été ressenti dans les laboratoires de biologie fondamentale. Cet éditeur de gènes à faible coût est facile à utiliser. Cela a permis aux chercheurs d'approfondir les mystères fondamentaux de la vie. Et ils peuvent le faire d'une manière qui était difficile, voire impossible.

Robert Reed est un biologiste du développement à l'Université Cornell à Ithaca, N.Y. Il compare CRISPR à une souris d'ordinateur. "Vous pouvez simplement le pointer à un endroit du génome et vous pouvez faire tout ce que vous voulez à cet endroit."

Au début, cela signifiait tout ce qui impliquait de couper l'ADN. CRISPR/Cas9 dans sa forme originale est un dispositif d'autoguidage (la partie CRISPR) qui guide les ciseaux moléculaires (l'enzyme Cas9) vers une section cible d'ADN. Ensemble, ils fonctionnent comme un missile de croisière de génie génétique qui désactive ou répare un gène, ou insère quelque chose de nouveau là où les ciseaux Cas9 ont fait quelques coupures. Les versions plus récentes de CRISPR sont appelées « éditeurs de base ». Ceux-ci peuvent modifier le matériel génétique une base à la fois, sans couper. Ils ressemblent plus à un crayon qu'à des ciseaux.

Voilà comment cela fonctionne

Les scientifiques commencent par l'ARN. C'est une molécule qui peut lire l'information génétique dans l'ADN. L'ARN trouve la place dans le noyau d'une cellule où une certaine activité d'édition devrait avoir lieu. (Le noyau est un compartiment dans une cellule où la plupart du matériel génétique est stocké.) Ce guide ARN guide Cas9 jusqu'à l'endroit précis de l'ADN où une coupe est nécessaire. Cas9 se verrouille ensuite sur l'ADN double brin et le décompresse.

Cela permet à l'ARN guide de s'apparier avec une région de l'ADN qu'il a ciblée. Cas9 coupe l'ADN à cet endroit. Cela crée une rupture dans les deux brins de la molécule d'ADN. La cellule, sentant un problème, répare la cassure.

Corriger la cassure peut désactiver un gène (la chose la plus simple à faire). Alternativement, cette réparation peut corriger une erreur ou même insérer un nouveau gène (un processus beaucoup plus difficile).

Les cellules réparent généralement une rupture de leur ADN en recollant les extrémités libres ensemble. C'est un processus bâclé. Il en résulte souvent une erreur qui désactive certains gènes. Cela peut ne pas sembler utile, mais c'est parfois le cas.

Les scientifiques ont coupé l'ADN avec CRISPR/Cas9 pour modifier les gènes, ou mutation. En comparant les cellules avec et sans la mutation, les scientifiques peuvent parfois comprendre quel est le rôle normal d'une protéine. Ou une nouvelle mutation peut les aider à comprendre les maladies génétiques. CRISPR/Cas9 peut également être utile dans les cellules humaines en désactivant certains gènes, par exemple ceux qui jouent un rôle dans les maladies héréditaires.

« Le Cas9 original est comme un couteau suisse avec une seule application : c'est un couteau », explique Gene Yeo. Il est biologiste de l'ARN à l'Université de Californie à San Diego. Mais Yeo et d'autres ont boulonné d'autres protéines et produits chimiques sur les lames émoussées. Cela a transformé ce couteau en un outil multifonctionnel.

CRISPR/Cas9 et les outils associés peuvent désormais être utilisés de nouvelles manières, telles que la modification d'une seule base nucléotidique - une seule lettre dans le code génétique - ou l'ajout d'une protéine fluorescente pour marquer un point de l'ADN que les scientifiques souhaitent suivre. Les scientifiques peuvent également utiliser cette technologie génétique de copier-coller pour activer ou désactiver les gènes.

Cette explosion de nouvelles façons d'utiliser CRISPR n'est pas terminée. Feng Zhang est biologiste moléculaire au Massachusetts Institute of Technology de Cambridge. Il a été l'un des premiers scientifiques à utiliser les ciseaux Cas9. « Le domaine avance si rapidement », dit-il. « Juste en regardant le chemin parcouru… Je pense que ce que nous verrons arriver dans les prochaines années sera tout simplement incroyable. »

Cette histoire a été mise à jour le 8 octobre 2020 pour noter la décision du comité Nobel d'attribuer à la découverte de CRISPR le prix 2020 de chimie.

Mots de pouvoir

application Une utilisation ou une fonction particulière de quelque chose.

base (en génétique) Une version abrégée du terme nucléobase. Ces bases sont des éléments constitutifs des molécules d'ADN et d'ARN.

la biologie L'étude des êtres vivants. Les scientifiques qui les étudient sont connus comme biologistes.

Cas9 Une enzyme que les généticiens utilisent maintenant pour aider à modifier les gènes. Il peut couper l'ADN, lui permettant de réparer des gènes brisés, d'en épisser de nouveaux ou de désactiver certains gènes. Cas9 est dirigé vers l'endroit où il est censé effectuer des coupes par les CRISPR, un type de guides génétiques. L'enzyme Cas9 provient de bactéries. Lorsque des virus envahissent une bactérie, cette enzyme peut hacher l'ADN du germe, le rendant inoffensif.

cellule La plus petite unité structurelle et fonctionnelle d'un organisme. Généralement trop petit pour être vu à l'œil nu, il se compose d'un liquide aqueux entouré d'une membrane ou d'une paroi. Les animaux sont constitués de milliers à des milliards de cellules, selon leur taille. Certains organismes, comme les levures, les moisissures, les bactéries et certaines algues, sont composés d'une seule cellule.

chimique Substance formée de deux atomes ou plus qui s'unissent (se lient ensemble) dans une proportion et une structure fixes. Par exemple, l'eau est un produit chimique composé de deux atomes d'hydrogène liés à un atome d'oxygène. Son symbole chimique est H2O.

CRISPR Abréviation – prononcée plus nette – pour le terme « répétitions palindromiques courtes regroupées régulièrement espacées ». Ce sont des morceaux d'ARN, une molécule porteuse d'informations. Ils sont copiés à partir du matériel génétique des virus qui infectent les bactéries. Lorsqu'une bactérie rencontre un virus auquel elle a été précédemment exposée, elle produit une copie d'ARN du CRISPR qui contient les informations génétiques de ce virus. L'ARN guide ensuite une enzyme, appelée Cas9, pour découper le virus et le rendre inoffensif. Les scientifiques construisent maintenant leurs propres versions des ARN CRISPR. Ces ARN fabriqués en laboratoire guident l'enzyme pour couper des gènes spécifiques dans d'autres organismes. Les scientifiques les utilisent, comme des ciseaux génétiques, pour modifier - ou modifier - des gènes spécifiques afin qu'ils puissent ensuite étudier le fonctionnement du gène, réparer les dommages causés aux gènes brisés, insérer de nouveaux gènes ou désactiver les gènes nocifs.

du développement (en biologie) Un adjectif qui fait référence aux changements qu'un organisme subit de la conception à l'âge adulte. Ces changements impliquent souvent la chimie, la taille et parfois même la forme.

ADN (abréviation d'acide désoxyribonucléique) Une longue molécule à double brin et en forme de spirale à l'intérieur de la plupart des cellules vivantes qui porte des instructions génétiques. Il est construit sur une épine dorsale d'atomes de phosphore, d'oxygène et de carbone. Dans tous les êtres vivants, des plantes et des animaux aux microbes, ces instructions indiquent aux cellules quelles molécules fabriquer.

ingénierie Domaine de recherche qui utilise les mathématiques et les sciences pour résoudre des problèmes pratiques.

champ Un domaine d'étude, comme dans : Son domaine de recherche était la biologie. Également un terme pour décrire un environnement réel dans lequel certaines recherches sont menées, comme en mer, dans une forêt, au sommet d'une montagne ou dans une rue de la ville. C'est le contraire d'un cadre artificiel, comme un laboratoire de recherche.

fluorescent Capable d'absorber et de réémettre la lumière. Cette lumière réémise est connue sous le nom de fluorescence.

gène (adj. génétique) Un segment d'ADN qui code, ou contient des instructions, pour produire une protéine. Les descendants héritent des gènes de leurs parents. Les gènes influencent l'apparence et le comportement d'un organisme.

génome Ensemble complet de gènes ou de matériel génétique dans une cellule ou un organisme. L'étude de cet héritage génétique logé dans les cellules est connue sous le nom de génomique.

muscle Type de tissu utilisé pour produire un mouvement en contractant ses cellules, appelées fibres musculaires. Le muscle est riche en protéine, c'est pourquoi les espèces prédatrices recherchent des proies contenant beaucoup de ce tissu.

mutation (v. muter) Un changement qui se produit dans un gène dans l'ADN d'un organisme. Certaines mutations se produisent naturellement. D'autres peuvent être déclenchés par des facteurs extérieurs, tels que la pollution, les radiations, les médicaments ou quelque chose dans l'alimentation. Un gène avec ce changement est appelé un mutant.

noyau Le pluriel est noyaux. (en biologie) Structure dense présente dans de nombreuses cellules. Typiquement une seule structure arrondie enfermée dans une membrane, le noyau contient l'information génétique.

organe (en biologie) Diverses parties d'un organisme qui remplissent une ou plusieurs fonctions particulières. Par exemple, un ovaire est un organe qui fabrique des œufs, le cerveau est un organe qui interprète les signaux nerveux et les racines d'une plante sont des organes qui absorbent les nutriments et l'humidité.

palindrome (adj. palindrome) Un mot, un nom ou une phrase qui a le même ordre de lettres lorsqu'il est lu vers l'avant ou vers l'arrière. Par exemple, père et maman sont tous deux des palindromes.

protéine Composé constitué d'une ou plusieurs longues chaînes d'acides aminés. Les protéines sont une partie essentielle de tous les organismes vivants. Ils forment la base des cellules vivantes, des muscles et des tissus, ils font également le travail à l'intérieur des cellules. L'hémoglobine dans le sang et les anticorps qui tentent de combattre les infections font partie des protéines autonomes les plus connues. Les médicaments agissent souvent en s'accrochant aux protéines.

ARN Une molécule qui aide à « lire » l'information génétique contenue dans l'ADN. La machinerie moléculaire d'une cellule lit l'ADN pour créer de l'ARN, puis lit l'ARN pour créer des protéines.

étiqueter (en biologie) Attacher une bande ou un paquet d'instruments robustes sur un animal. Parfois, l'étiquette est utilisée pour donner à chaque individu un numéro d'identification unique. Une fois attaché à la patte, à l'oreille ou à une autre partie du corps d'une créature, il peut effectivement devenir le "nom" de l'animal. Dans certains cas, une étiquette peut également collecter des informations sur l'environnement autour de l'animal. Cela aide les scientifiques à comprendre à la fois l’environnement et le rôle de l’animal en son sein.

Citations

Revue :​ S. Wang et al. Un système de marquage CRISPR bicolore basé sur l'ARN-aptamère. Rapports scientifiques. Vol. 6, 27 mai 2016, p. 26857. doi : 10.1038/srep26857.

Revue :​ A. C. Komor et al. Édition programmable d'une base cible dans l'ADN génomique sans clivage d'ADN double brin. La nature. Vol. 533, 19 mai 2016, publié en ligne le 20 avril 2016, p. 420. doi: 10.1038/nature17946.

Revue :​ D.A. Nelles et al. Suivi d'ARN programmable dans des cellules vivantes avec CRISPR/Cas9. Cellule. Vol. 165, 7 avril 2016, p. 488. doi : 10.1016/j.cell.2016.02.054.

À propos de Tina Hesman Saey

Tina Hesman Saey est la rédactrice principale et rapporte sur la biologie moléculaire. Elle a un doctorat. en génétique moléculaire de l'Université de Washington à St. Louis et une maîtrise en journalisme scientifique de l'Université de Boston.

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La découverte de CRISPR ouvre la voie à une nouvelle méthode de test COVID-19

La nouvelle plate-forme LEOPARD a le potentiel de détecter une variété de biomarqueurs liés à la maladie en un seul test. Crédit : Sandy Westermann / HIRI

La plupart des diagnostics moléculaires conventionnels ne détectent généralement qu'un seul biomarqueur lié à la maladie. De bons exemples sont les tests PCR actuellement utilisés pour diagnostiquer le COVID-19 en détectant une séquence spécifique du SARS-CoV-2. Ces méthodes dites singleplex fournissent des résultats fiables car elles sont calibrées sur un seul biomarqueur. Cependant, pour déterminer si un patient est infecté par une nouvelle variante du SRAS-CoV-2 ou par un agent pathogène complètement différent, il faut sonder de nombreux biomarqueurs différents à la fois.

Des scientifiques de l'Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections à base d'ARN (HIRI) et de l'Université Julius Maximilians (JMU) de Würzburg ont maintenant ouvert la voie à une toute nouvelle plate-forme de diagnostic avec LEOPARD. Il s'agit d'une méthode basée sur CRISPR qui est hautement multiplexable, avec le potentiel de détecter une variété de biomarqueurs liés à la maladie en un seul test.

LEOPARD, qui signifie "Leaving Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PARallel RNA Detection", est basé sur la découverte que la coupure d'ADN par Cas9 pourrait être liée à la présence d'un acide ribonucléique (ARN) spécifique. Ce lien permet à LEOPARD de détecter plusieurs ARN à la fois, ouvrant des opportunités pour la détection simultanée d'ARN de virus et d'autres agents pathogènes dans un échantillon de patient.

L'étude publiée aujourd'hui dans Science a été initié par Chase Beisel, professeur à JMU et chef de groupe de recherche à HIRI, et le professeur Cynthia Sharma de l'Institut de biologie des infections moléculaires (IMIB) de JMU. "Avec LEOPARD, nous avons réussi à détecter des fragments d'ARN de neuf virus différents", explique Beisel. "Nous avons également pu différencier le SARS-CoV-2 et l'une de ses variantes dans un échantillon de patient tout en confirmant que chaque échantillon a été correctement collecté à partir du patient."

CRISPR-Cas9 est principalement connu comme un outil biomoléculaire pour l'édition du génome. Ici, CRISPR-Cas9 fonctionne comme des ciseaux moléculaires qui coupent des séquences d'ADN spécifiques. Ces mêmes ciseaux sont naturellement utilisés par les bactéries pour couper l'ADN associé aux virus envahissants. Qu'il s'agisse d'éditer des génomes ou d'éliminer des virus, la coupe Cas9 est dirigée par des ARN guides. Les ARN guides trouvés dans les bactéries doivent s'apparier à un ARN distinct appelé tracrRNA. Le couple d'ARN peut alors travailler avec Cas9 pour diriger la coupe d'ADN.

Une découverte inattendue

On pensait que le tracrRNA ne s'apparie qu'avec des ARN guides provenant du système antiviral. Cependant, les scientifiques de Würzburg ont découvert que le tracrRNA s'apparie avec d'autres ARN, les transformant en ARN guides. Cynthia Sharma, présidente de biologie des infections moléculaires II à l'IMIB et porte-parole du Centre de recherche sur les maladies infectieuses (ZINF) à JMU a été stupéfaite par cette découverte : « Quand nous avons recherché des ARN se liant à Cas9 dans notre organisme modèle Campylobacter, nous avons étonnamment trouvé que nous avons détecté non seulement des ARN guides, mais également d'autres fragments d'ARN dans la cellule qui ressemblaient à des ARN guides. Le tracrRNA s'apparie à ces ARN, ce qui donne des ARN guides « non canoniques » qui pourraient diriger la coupe d'ADN par Cas9. »

La plate-forme de diagnostic LEOPARD s'appuie sur cette découverte. "Nous avons compris comment reprogrammer les ARNtracr pour décider quels ARN deviennent des ARN guides", explique Beisel. "En surveillant un ensemble d'ADN correspondants, nous pouvons déterminer quels ARN étaient présents dans un échantillon en fonction des ADN coupés. Dans le cadre de la pandémie en cours, LEOPARD pourrait permettre à un médecin de déterminer si le patient est infecté par le SRAS-CoV -2, s'il s'agit d'une variante unique, et si l'échantillon a été correctement prélevé ou doit être répété, le tout en un seul test."

À l'avenir, les performances de LEOPARD pourraient éclipser même les tests PCR multiplexés et d'autres méthodes. "La technologie a le potentiel de révolutionner le diagnostic médical non seulement pour les maladies infectieuses et les résistances aux antibiotiques, mais aussi pour le cancer et les maladies génétiques rares", a déclaré Oliver Kurzai, directeur de l'Institut d'hygiène et de microbiologie de JMU, qui a fourni des échantillons de patients pour l'étude.

"Le travail met en évidence l'excellente recherche collaborative et interdisciplinaire qui se déroule ici à Würzburg", a déclaré Jörg Vogel, directeur d'IMIB et de HIRI, une installation commune de JMU avec le Helmholtz Center for Infection Research à Braunschweig. « LEOPARD démontre de manière impressionnante que nous pouvons couvrir tout le spectre de la recherche complémentaire de pointe à Würzburg, des principes fondamentaux de la recherche sur l'ARN aux applications cliniques.


Comment l'ARN guide est-il créé pour Crispr ? - La biologie

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Les ARN guides programment les nucléases Cas9 pour couper à un emplacement génomique spécifique. La conception d'un ARN guide efficace est essentielle à l'élimination efficace des gènes.

Tous les produits d'ARN guide préconçus Edit-R sont conçus avec un algorithme validé pour maximiser la probabilité d'inactivation fonctionnelle de la protéine, et pas seulement pour créer une cassure double brin. En évaluant les phénotypes pour des milliers de conceptions, puis en validant nos règles de conception dans d'autres systèmes d'essai, nous avons établi des normes pour déterminer les sites cibles qui sont plus susceptibles d'atteindre un knock-out fonctionnel avec une spécificité élevée.

Les ARN guides synthétiques et lentiviraux peuvent également être conçus sur mesure pour des espèces supplémentaires, des nucléases alternatives ou toute région spécifique d'un gène à l'aide de l'outil de conception CRISPR. Pour ceux qui conçoivent un ARN guide qui utilise Staph aureus Cas9 pour le clivage, Horizon recommande NEB EnGen & reg Sau Cas9 pour votre nucléase.

Guider les ARN dans le système CRISPR-Cas9

En plus de l'expression de la nucléase Cas9, le système CRISPR-Cas9 nécessite une molécule d'ARN spécifique pour recruter et diriger l'activité de la nucléase vers la région d'intérêt. Ces ARN guides prennent l'une des deux formes suivantes :

  1. Un ARN CRISPR synthétique transactivant (tracrRNA) plus un ARN CRISPR synthétique (crRNA) conçu pour cliver le site cible du gène d'intérêt (Figure 1a)
  2. Un ARN guide unique synthétique ou exprimé (sgRNA) qui se compose à la fois du crRNA et du tracrRNA en tant que construction unique (Figure 1b)

Figure 1a. Illustration de la nucléase Cas9 programmée par le complexe crRNA:tracr coupant les deux brins d'ADN génomique 5' du PAM

Guide de sélection d'ARN

La détermination du type d'ARN guide le plus approprié pour votre expérience dépendra de votre application particulière et du type de cellule. Utilisez ce tableau pour commencer à sélectionner le bon format d'ARN guide pour vos conditions expérimentales spécifiques.

ARNc synthétique sgRNA synthétique sgRNA lentiviral Lentiviral tout-en-un sgRNA
Garanti de modifier votre gène d'intérêt
Peut être conçu sur mesure pour n'importe quelle espèce, nucléase ou lieu d'édition
Compatible RNP pour l'électroporation
Transduire en cellules difficiles à éditer qui ne peuvent pas être électroporées
Enrichissement de la population avec des marqueurs de résistance aux antibiotiques
Disponible en vecteur tout-en-un (sgRNA + Cas9) pour un flux de travail simplifié

Données à l'appui

Les scores de l'algorithme Edit-R sont en corrélation avec l'efficacité du clivage

10 crRNAs with high functional scores for 10 genes (blue bars) and 10 crRNAs with low functional scores for the same genes (yellow bars) were tested for editing by Next Generation Sequencing. 93% of the high-scoring crRNAs and 32 % of the low scoring crRNAs showed > 40% of editing (indel formation). The Cas9-HEK293T cell line was transfected with 50 nM crRNA:tracrRNA, using 0.25 µL/well of DharmaFECT 1. Seventy-two hours post-transfection, cells were lysed and Nextera transposon-adapted amplicons spanning each crRNA site were generated for every treated sample as well as for a matched control amplicon from untransfected samples. Samples were indexed using the Nextera 96-well index kit and pooled for sequencing on a MiSeq instrument (paired end reads, 2 x 300 length). Reads that passed NGS quality filtering criteria were aligned to the reference file (Bowtie2 v2.1.0). Percent perfect reads were calculated and normalized to the control untransfected samples (Samtools v0.1.12a) the data is presented as normalized percent edited.

CrRNAs with high algorithm functional scores have also perform well in other functional assays

U2OS-Proteasome cells with integrated Cas9 (under CAG promoter) were plated in 96-well plates at 10,000 cells per well. 24h after plating, cells were transfected with 25 nM crRNA:tracrRNA using 0.2 µg/well of DharmaFECT4. Cell were analyzed for apoptosis 48 h after transfection using the ApoONE homogeneous assay (Promega). Shown is a box plot representation of the functionality of crRNAs targeting BCL2L1, PLK1 or WEE1 in ApoONE assay. To generate the box plot, the crRNAs were divided into bottom half (H1) and top half (h2) based on their functional score. The medians, distribution of data between the lower and upper quartile and the minimum and maximum values demonstrate that high-scoring crRNAs have increased functionality.

Edit-R synthetic guide RNA products

Predesigned synthetic sgRNA

Genome wide synthetic sgRNA designs guaranteed to edit your gene of interest. The design algorithm maximizes the potential for functional protein knockout while minimizing off-target editing through stringent specificity checks.

Positive synthetic sgRNA controls and detection primers

Species-specific synthetic sgRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

Synthetic sgRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific sgRNA.

Predesigned synthetic crRNA

Guaranteed to edit your target! Algorithm-optimized crRNA for genome-wide coverage of human and mouse genes. Modifications for nuclease resistance improve DNA-free editing.

Positive synthetic crRNA controls and detection primers

Species-specific synthetic crRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

Synthetic crRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific crRNA.

TracrRNA

Trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) is synthetic, HPLC-purified, long RNA required for use with Edit-R synthetic crRNA to form the complex that programs Cas9 nuclease. It is modified for nuclease resistance and can be used with modified or unmodified Edit-R crRNA.

CrRNA libraries

Plated pre-defined collections of popular gene families for arrayed knockout screening

Cherry-pick libraries

Have a favorite gene list? Customize and order plates of predesigned guide RNAs for knockout studies in your targets of interest

Edit-R all-in-one lentiviral sgRNA products

All-in-one lentiviral sgRNA

Genome-wide combined Cas9 and sgRNAs for efficient gene knockout & unparalleled specificity available as glycerol stocks and high-titer purified particles.

All-in-one lentiviral sgRNA positive controls and kits

All-in-one lentiviral sgRNA controls to verify DNA double-strand breaks and gene editing efficiencies.

All-in-one lentiviral sgRNA non-targeting controls

All-in-one lentiviral sgRNA constructs bioinformatically designed to not target any gene in human or mouse genomes.

Edit-R Lentiviral sgRNA products

Predesigned lentiviral sgRNA

Guaranteed to edit your target, algorithm-optimized sgRNA for genome-wide coverage of human or mouse genes. Provided as high-titer lentiviral particles or glycerol stocks.

Lentiviral sgRNA positive controls

Species-specific sgRNAs targeting well-characterized genes to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximum efficiency.

Lentiviral sgRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene-specific sgRNA.

Pooled lentiviral sgRNA libraries

High-titer pooled screening libraries for pre-defined gene sets in human and mouse.

Arrayed lentiviral sgRNA libraries

Arrayed collections of lentiviral sgRNA libraries for high-throughput knockout screening across entire human gene families.

Custom guide RNA design & ordering tools

CRISPR Design Tool

Place a custom guide RNA order, or design and order your own synthetic sgRNA, crRNA, or lentiviral sgRNA with our easy-to-use interface.

Edit-R HDR donor template design, ordering tools & kits

HDR Donor Designer - oligo

Design and order a single-strand DNA donor (&le 150 nt) for insertion, deletion, or other alteration.

HDR Donor Designer - plasmid

Design and order a plasmid DNA donor kit for insertion of a mKate2 or EGFP fluorescent marker, or other a custom insert.

HDR plasmid donor kits

Rapidly and easily assemble a plasmid donor for HDR

HDR plasmid donor components

Quickly and efficiently build a HDR donor plasmid

HDR plasmid donor primers

PCR components for Edit-R Plasmid Donor Kits

The Edit-R predesigned guide RNA guarantee

We guarantee that EVERY predesigned guide RNA will provide successful editing at the target site when delivered as described in the Edit-R technical manuals.

The Edit-R guide RNA guarantee is valid when used with any wild type S. pyogenes Cas9 nuclease, including mRNA, expression plasmid, protein, or stable Cas9 expression, and Edit-R crRNAs must be used with Edit-R tracrRNA for the guarantee to apply.

Analysis of editing of the treated cell population must be shown using a T7EI or Surveyor mismatch detection assay. If successful editing is not observed for a predesigned Edit-R guide RNA while an appropriate side-by-side Edit-R positive control is successful, a one-time replacement of a different predesigned Edit-R guide RNA of the same format and quantity will be provided at no cost.

A replacement will only be approved upon discussion with our Technical Support team.

Successful editing at the DNA level does not always lead to functional gene knockout it is recommended to test multiple guide RNAs to determine the most effective guide RNA for knockout of your target gene.

This guarantee does not extend to any accompanying experimental costs, does not apply to guide RNAs ordered via the CRISPR Design Tool, and will not be extended to the replacement guide RNA.


Mis en exergue

Points forts

CRISPR is an incredibly useful tool for geneticists and microbiologists. Short for clustered regularly interspaced short palindromic repeats, it sounds intimidating on the basis of name alone. Yet it’s a tool that Annie Taylor—a senior applied and engineering physics major at Cornell University—uses extensively in her research. What she does with CRISPR showcases some of its powers.

“I can write out a nucleotide sequence on my computer, buy a custom-made DNA fragment for that sequence, and use it to program the CRISPR system to target practically any DNA sequence I want with high specificity.” She explains. Hearing how she uses it, it’s easy to imagine that CRISPR has had a tremendous impact in biological research, with applications in countless subdisciplines.

Creating Genetic Circuits to Operate Like Computer Circuits

Taylor conducts her research in Guillaume Lambert’s lab, Applied and Engineering Physics, which focuses on creating genetic circuits in cells—an application of CRISPR in synthetic biology. Genetic circuits are analogous to logic circuits in electrical engineering. Logic circuits are comprised of many logic gates they alter the voltage and current of a system as it passes through them. Similarly to how computers function, genetic circuits may eventually be used to perform complex logic functions in a cell.

Many types of logic gates perform a variety of functions. Taylor is working on a particular type of logic gate known as a NOT gate, or an inverter. The input of the gate is at a high voltage, while the output of the gate is at a low voltage (or vice versa). In electrical engineering, high voltage is represented by one, while low voltage is zero. A one at the input of a NOT gate would produce a zero at the output. The same is true the other way around.

In biological systems, there is no high voltage or low voltage. Instead, one and zero would correspond to high and low protein expression. A one would mean that a certain protein is expressed, while a zero would mean the protein is inactive.

“While the systems and the techniques are biological, a lot of the underlying theories of our work revolve around physics.”

In a cell, protein expression can be easily examined. One can insert marker genes such as the green fluorescent protein (GFP) gene. A cell that is expressing GFP will glow green in ultraviolet light or blue light, so one can tell whether or not GFP is being expressed by simply shining a blue light over the colonies. Taylor inserts these marker genes into a cell by inserting them into a plasmid, a structure that carries genetic information, which is then absorbed and incorporated into bacterial cells. The end result is a colony of cells that glows green in blue light. Taylor then uses the CRISPR system to target this inserted GFP gene.

How CRISPR Works

“The CRISPR system, in nature, is a bacterial immune system. Bacteria are trying to protect themselves from viruses, which are basically sequences of foreign DNA. They have to be able to recognize what genetic information is foreign and what genetic information is their own.”

To do this, bacterial cells produce Cas proteins, which bind to a guide RNA sequence. Then the Cas protein inspects any DNA it encounters. If any sequences on the DNA match with the guide RNA sequence, the Cas protein recognizes it as being foreign DNA and destroys it.

The most commonly used Cas protein for gene editing, Cas9, natively acts to cut DNA at the place where it is identical to the guide RNA sequence, but Cas9 can be modified in many ways. For instance, the Lambert lab often uses dead Cas9—known as dCas9)—which has been modified so that it is catalytically inactive. When it recognizes a DNA sequence, instead of cutting the DNA, dCas9 binds to that sequence and inhibits transcription. The target DNA sequence is not cleaved but becomes unable to express the protein for which it codes.

The power of the CRISPR system lies in the fact that one can modify the 20-base pair guide RNA sequence that the Cas9 protein binds to. If one knows a critical sequence of DNA on a gene of interest, they can create a corresponding guide RNA sequence that will cause the Cas9 protein to target that area of DNA. If it is dCas9 protein, then it will bind to that sequence of DNA and inhibit transcription, the expression of a protein at that site.

Taylor can design a guide RNA sequence that she knows will correspond to a sequence on one of the marker genes she inserts. For example, she can create a sequence of RNA that corresponds to a critical part of the GFP gene. Before she inserts the guide RNA sequence, the bacterial cells will express the GFP gene. Afterward when the dCas9 has bound to the RNA sequence, recognized the corresponding sequence on the DNA, and deactivated it, the colonies will no longer produce GFP and will no longer glow under ultraviolet light.

“There are a variety of Cas proteins,” Taylor explains. “Each Cas protein may have a different guide RNA structures or may deactivate genes in different ways. And while dead Cas9 inhibits transcriptions, there are other ways to modify Cas proteins to activate genes. It gives us control over which genes are expressed in a cell and which are inhibited.”

Creating Genetics Circuits

One of the aims of the Lambert lab is to use this control over gene expression in order to generate a genetic circuit. They want to develop a system in which they can submit certain inputs, and knowing how the logic gates in the cell will interact with the inputs, be able to obtain a predictable result.

Living systems are incredibly complex, however. Having multiple logic gates might cause them to interfere with each other’s function. The Lambert lab is working to understand the limitations of the system. How many logic gates can be inserted until their behavior is no longer predictable and stable? What are the off-target effects of the CRISPR system?

“If you have a genome that is millions or billions of base pairs long, there might be several locations that the Cas protein will unintendedly target, because they match the 20-base pair guide RNA sequence simply by chance,” Taylor says. “This might be disastrous for the cell, or the cell might appear to be unaffected. It just depends on where those off-target sequences are and what they code for.”

The Fusion of Physics and Biology

Taylor appreciates the intersection between sciences, which is the focus of the Lambert lab. She entered Cornell interested in aerospace engineering, yet in her senior year she has found a passion for combining physics and biology. Minoring in biological sciences, Taylor has been able to apply her coursework to her lab work.

“While the systems and the techniques are biological, a lot of the underlying theories of our work revolve around physics,” she says. She hopes to use the gene editing and manipulation tools that she has learned through her work with the Lambert lab in her future research.

CRISPR is both a scary name and a powerful tool, and as Taylor has learned through her work with the Lambert lab, its applications to scientific research are widespread. It has the potential to turn genetic loci into logic gates and cells into circuits, to turn proteins on or off at will, and to inform our growing knowledge of how cells—and life—function.


Our Role in Developing CRISPR/Cas9

We are proud to offer our newest line of CRISPR genome editing tools to the global research community. As the first company to commercially offer targeted genome editing technology nearly ten years ago, no one has more expertise in this field than us. This experience is especially important when it comes to crafting genome editing tools that possess the critical requirements of having specific targeting and robust cutting activity. We provide both in our new CRISPR product line, and now we put our skill into your hands with a quick and simple web-based design platform. Our CRISPR products can be ordered directly through the link below or browse the CRISPR content on this page to learn more about the technology.


Mitosis and Meiosis Part A

Kara L. McKinley , in Methods in Cell Biology , 2018

3.3 Generation of sgRNA-Expressing Plasmids

3.3.1 Considerations for selection of targeting sequences

The sgRNA should target within 100 bp of the insertion site. It can be in either a coding sequence, or in an untranslated region. For an N-terminal tag, either the 5′ UTR can be targeted, or the first coding exon can be targeted if it is desirable to knock out the other allele as described in Section 3.2 . For a C-terminal tag, the 3′ UTR should be targeted. The targeting sequence should be selected to be (1) feasible (i.e., directly upstream of a PAM sequence) and (2) specific (i.e., with maximal number of mismatches to other sequences) as outlined in Section 2.2.2 .

3.3.2 Cloning targeting sequences into transient vectors

To introduce sequences at specified sites, the Cas9, sgRNA, and repair template only need to be temporarily present within the cells to be targeted. Therefore, for this application we will introduce them by transient transfection. We will transfect two plasmids ( Fig. 7 ): one that constitutively expresses both Cas9 and the sgRNA, and one that carries the repair sequence.

For transient expression of Cas9 and the sgRNA, we use the plasmid pX330 from Feng Zhang's laboratory (Addgene #42230). The cloning for pX330 uses the same overhangs as the pLenti-sgRNA/pKM808 plasmids used in Section 2.2.3 . Therefore, the protocol for cloning is the same as in Section 2.2.3 with one important exception: in this case, the plasmid is cut with BbsI, also marketed as Fast Digest BpiI (Thermo Fisher 10569110). We recommend use of the Fast Digest BpiI, as traditional formulations of BbsI are poorly stable at − 20°C.

As described in Section 2.2.2 , the cleavage efficiency of sgRNAs is variable. Therefore, we recommend designing two sgRNAs per target. If tag insertion fails, cleavage efficiency can be validated using T7 endonuclease I or Surveyor assays.


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