Informations

Pourquoi la lyse des érythrocytes de mouton est-elle considérée comme une voie d'activation du complément classique, et le lapin comme une alternative ?


Toutes les suggestions sont très appréciées.


La lyse des érythrocytes de mouton que vous mentionnez implique en fait sensibilisé les érythrocytes, c'est-à-dire les érythrocytes déjà revêtus d'anticorps. Les complexes antigène-anticorps sont bien connus pour leur activation de la voie classique du complément.

En effet, les érythrocytes de lapin recouverts d'anticorps activent également la voie classique du complément$^1$. Ainsi, les érythrocytes de mouton ne sont pas spéciaux à cet égard.

La différence vient lorsque nous incubons uniquement des érythrocytes - dépourvus de tout anticorps sensibilisant - avec du sérum contenant des facteurs du complément. Dans cette situation, les érythrocytes du lapin, mais pas ceux du mouton, sont lysés par activation alternée du complément. Pourquoi y a-t-il une telle différence ?

Fearon et Austen$^2$ ont montré que cela est dû à un effet protecteur de la membrane érythrocytaire du lapin sur C3b. Normalement, C3b est inhibé par le facteur I et le facteur H dans le sérum. Cet effet est perdu avec les érythrocytes de lapin (mais pas de mouton), ce qui explique la différence de lyse médiée par le complément.


Articles de revues cités :

  1. Dijk HV, Rademaker PM, Willers JMN. Estimation de la voie classique de l'activité du complément de souris à l'aide d'érythrocytes de lapin sensibilisés. Journal des méthodes immunologiques. 1980 22 décembre;39(3):257-268. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90060-5
  2. Fearon DT, Austen KF. Activation de la voie alternative du complément avec des érythrocytes de lapin par contournement de l'action régulatrice des protéines de contrôle endogènes. Journal de médecine expérimentale. 1 juillet 1997;146(1):22-33. https://doi.org/10.1084/jem.146.1.22

Le système du complément est une réponse immunitaire innée qui comporte trois voies - comme le montre l'image ci-dessous.

La dégradation des globules rouges évalue la capacité fonctionnelle du système du complément. Cette expérience est intitulée : « Activité du complément total », « CH50 » ou « CH100 ». C'est à ça que tu fais référence ?

Hémolyse de mouton les globules rouges se produisent via la voie classique du complément.

Plus d'informations : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360204/


Frontières en immunologie

Les affiliations de l'éditeur et des réviseurs sont les dernières fournies sur leurs profils de recherche Loop et peuvent ne pas refléter leur situation au moment de la révision.



PARTAGER SUR

Introduction

Le système du complément est une cascade protéolytique auto-propageante de protéines et de fonctions dans le cadre de l'immunité innée. Afin de répondre à de multiples schémas de danger, le complément peut être initié par trois voies principales : classique, lectine et alternative. Les deux premiers sont déclenchés lors de la détection de structures non-soi ou de soi altéré par des molécules capteurs capables de reconnaître divers modèles moléculaires (complexe C1, lectine liant le mannose (MBL) et ficolines) tandis que la dernière est constamment maintenue active à un faible niveau. et propagé uniquement en raison du manque d'inhibition par les propres régulateurs du corps [1], [2]. Toutes les voies convergent au niveau de la molécule C3, où les événements en aval peuvent être amplifiés par un mécanisme de rétroaction positive soutenu par les convertases du complément : la voie classique/lectine C3 convertase (C4b2a) ou la voie alternative C3 convertase (C3bBb) [3] . Ces convertases clivent en outre C3 en C3b et C3a, dont C3b se lie aux surfaces voisines, fournissant une nouvelle plate-forme d'assemblage de convertases, ou aux convertases C3 pré-assemblées, les transformant en convertases C5 (C4b2aC3b ou C3bBbC3b, respectivement) [4]. La convertase C5 clive les molécules C5 en C5a et C5b et ces dernières initient la formation du complexe d'attaque membranaire (MAC, C5b678polyC9) et son insertion dans une membrane cible. La lyse osmotique due au dépôt de MAC ainsi que la libération des anaphylatoxines C3a et C5a ainsi que l'opsonisation par C3b sont les mécanismes effecteurs du complément assurant la protection contre les agents pathogènes envahissants, l'élimination des complexes immuns, les cellules mourantes et même l'orchestration des réponses immunitaires innées [1], [ 2]. Cependant, le complément peut également endommager ses propres tissus lorsqu'il est mal contrôlé. Le besoin évident de maintenir le système bien équilibré est reflété par le fait que, en plus de 23 protéines reconnues jusqu'à présent comme impliquées dans l'initiation et la propagation de la cascade du complément, presque le même nombre d'inhibiteurs du complément a été identifié à ce jour [1 ]. Toute perturbation de cet équilibre délicat [5] peut entraîner une susceptibilité accrue aux infections [6], [7], [8], [9] ou aux maladies auto-immunes [10], [11], [12], [13], [14], [15] en raison d'un déficit en complément. De plus, une activation excessive ou malavisée du complément est impliquée dans la majorité des maladies inflammatoires chroniques et aiguës. De plus, de nombreuses bactéries et virus ont développé des stratégies pour échapper au système du complément, telles que la capture d'inhibiteurs de l'hôte ou l'expression de leurs propres inhibiteurs efficaces, ou la sécrétion de protéases qui épuisent le complément (revue dans [16]). La majorité des inhibiteurs du complément humains et microbiens décrits ciblent le complément au stade des convertases. Les inhibiteurs de la phase fluide les plus abondants présents dans le sérum à des concentrations de plusieurs centaines de microgrammes par millilitre tels que le facteur H (FH) [17] ou la protéine C4b-bidning (C4BP) [18] sont caractérisés par une activité d'accélération de la décroissance de la convertase, une capacité à accélérer désassemblage de la convertase, ainsi que l'activité du cofacteur, car ils agissent comme des cofacteurs soutenant le clivage par le facteur I (FI) des composants activés du complément C3b et/ou C4b nécessaires à la formation de la convertase. De plus, toutes les cellules humaines expriment au moins un inhibiteur membranaire présentant une activité d'accélération de la décroissance (CD35/CR1, CD55/DAF) ou une activité de cofacteur (CD35/CR1, CD46/MCP) [1]. Les études fonctionnelles des inhibiteurs du complément reconnus et putatifs et la dissection de leur influence sur la formation et le désassemblage de la convertase sont cruciales pour l'évaluation de leur importance globale dans l'ensemble de la cascade du complément.

Historiquement, les tests déterminant l'activité d'accélération de la décroissance ont été effectués sur des érythrocytes de mouton sensibilisés aux anticorps (voie classique) ou de lapin (voie alternative) dans des tampons véronaux permissifs pour les voies individuelles [19], [20], [21]. Le tampon DGVB ++ contenant les ions magnésium et calcium nécessaires à l'interaction C2-C4 [22] et à la formation du complexe C1q [23], respectivement, permet l'activation des voies classique et de la lectine ainsi que la voie alternative (à des concentrations sériques suffisamment élevées) . Seule la voie alternative peut se dérouler dans un tampon Mg 2+ -EGTA, contenant des ions magnésium et un agent chélateur du calcium [24]. Dans un essai typique, la convertase C3 classique est construite par étapes sur des érythrocytes en utilisant C1, C4 et C2 purifiés et appelée EAC142 (E signifie érythrocytes de mouton et A pour anticorps sensibilisant les ambocepteurs). Une incubation supplémentaire avec du C3 purifié entraîne la formation classique de C5 convertase (EAC1423). La même plate-forme peut être utilisée pour créer des convertases alternatives fonctionnelles. Dans ce cas, C4 et C2 sont dissociés du complexe par incubation dans un tampon contenant 10 mM d'EDTA suivie de l'ajout du facteur D, du facteur B (FB) et de la properdine [19]. Des études de la convertase alternative ont également été réalisées à l'aide de méthodes de microplaque, où C3b purifié (ou dimères C3b pour la convertase alternative C5) ont été appliqués sur la surface et suivis d'une incubation avec FB et D en présence d'ions nickel. La convertase restante a ensuite été quantifiée par détection du FB lié [19]. Une autre méthode utilisée avec succès pour déterminer le mode d'inhibition du complément de la convertase alternative du complément a utilisé des techniques de résonance plasmonique de surface [25].

Nous proposons ici une nouvelle méthode basée sur des dosages hémolytiques et des sérums appauvris en C3 ou C5. De tels sérums, dont C3 ou C5 ont été éliminés par chromatographie d'affinité, soutiennent le développement de la cascade du complément jusqu'au niveau de convertase souhaité. Il élimine le besoin d'une formation coûteuse, progressive et longue de complexe enzymatique à partir de composants purifiés. De plus, l'utilisation de sérum entier limite le risque d'inactivation des protéines pendant la procédure et donne des conditions beaucoup plus physiologiques que celles nécessitant une immobilisation des protéines sur une surface artificielle ou des ions de métaux lourds. La construction de convertases du complément sur les érythrocytes permet une lecture facile du dosage par quantification spectrophotométrique de l'hémoglobine libérée. Les principes de la méthode sont montrés et expliqués dans la Fig. 1.

Les convertases du complément classiques sont assemblées sur des érythrocytes de mouton sensibilisés avec des anticorps et incubés avec du sérum appauvri en C3 ou C5. L'absence d'un composant particulier permet à la cascade du complément de passer uniquement au stade de la convertase C3 classique (C4b2a) ou de la convertase C5 classique (C4b2a3Cb). Une faible concentration sérique et une sensibilisation avec des anticorps permettent la voie classique du complément. La formation de convertases alternatives C3 (C3bBb) et C5 (C3bBbC3b) est réalisée sur des érythrocytes de lapin lors d'un traitement avec une concentration modérée de sérum appauvri en C5 dans du tampon Mg-EGTA (séquestrant le calcium mais pas le magnésium). L'ajout de sérum de cobaye (en tant que source de composant manquant du complément ainsi que de composants MAC) dilué dans l'EGTA initie la lyse uniquement à partir de complexes de convertase préformés, car la chélation des cations divalents empêche la formation de convertase de novo. Par conséquent, la quantité d'hémoglobine libérée est proportionnelle au nombre initial de convertases actives formées sur les érythrocytes.


Introduction

Les spirochètes appartenant à la Borrelia burgdorferi sensu lato complexe sont l'agent causal de la borréliose de Lyme et comprennent B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, et B. afzelii. B. burgdorferi sensu stricto (appelé B. burgdorferi ci-après) provoque 300 000 cas de maladie de Lyme aux États-Unis chaque année [1], tandis que B. garinii et B. afzelii sont l'agent étiologique le plus fréquent de la maladie de Lyme en Europe et en Asie [2]. B. burgdorferi sensu lato sont les principaux agents infectieux transmis par les arthropodes dans l'hémisphère nord et sont capables de dissémination hématogène par laquelle un large éventail de tissus hôtes distants sont colonisés. Pour survivre et persister chez les hôtes immunocompétents, les spirochètes associés à Lyme doivent échapper aux défenses immunitaires de l'hôte, y compris l'ancienne cascade protéolytique de l'immunité innée connue sous le nom de système du complément.

Le complément est un groupe de près de trois douzaines de protéines qui se combinent pour coordonner un ensemble étroitement contrôlé de réactions protéolytiques dirigées vers les surfaces cellulaires cibles [3,4]. L'activation du complément est initiée par des protéines de reconnaissance de formes solubles qui sont capables de discerner des surfaces moléculaires étrangères. Le mode spécifique de reconnaissance définit les trois voies conventionnelles du complément connues sous le nom de voie classique, voie lectine et voie alternative. Par exemple, la voie classique est activée lors de la liaison de la protéine du complément C1q aux anticorps liés à l'antigène (c'est-à-dire aux complexes immuns). De même, la voie de la lectine est activée suite à la liaison de la lectine ou des ficolines liant le mannose à des structures glucidiques étrangères, tandis que la voie alternative est constitutivement activée à de faibles niveaux via un mécanisme appelé « tick-over » [3,4]. Indépendamment de l'événement d'initiation moléculaire, les trois voies procèdent par l'activation d'une série de protéases à sérine spécialisées qui convergent vers la molécule centrale du complément, C3. C3 est clivé par des complexes enzymatiques appelés C3 convertases, ce qui entraîne une amplification du complément à la surface cible, l'activation de la voie terminale du complément et l'induction de fonctions effectrices en aval. L'activation du complément aboutit finalement à l'opsonisation des surfaces ciblées, au recrutement de phagocytes professionnels et à la lyse directe des membranes sensibles [3,4].

Les cellules hôtes expriment plusieurs protéines qui fonctionnent pour réguler le complément et sont donc généralement protégées d'un ciblage involontaire par la cascade. En revanche, les agents pathogènes qui circulent dans les fluides où le complément est présent à des concentrations élevées ont nécessairement développé des mécanismes pour échapper à la détection et à l'activation du complément. Par exemple, de nombreux agents pathogènes humains sécrètent des protéines associées à la membrane qui se lient aux régulateurs endogènes de l'hôte du complément [5]. À cet égard, une cible bactérienne de premier plan est le régulateur négatif dominant de la voie alternative, le facteur H. En effet, B. burgdorferi sensu lato les espèces elles-mêmes sont connues pour coder jusqu'à cinq protéines distinctes (CspA, CspZ, ErpP, ErpC et ErpA notent que ces trois dernières sont également appelées protéines liées à OspE Erps) qui se lient et recrutent le facteur H à la surface bactérienne, détournant ses activités de protection complémentaires [6–13]. En plus des protéines de liaison au facteur H, des protéines borréliales distinctes sont connues qui bloquent spécifiquement la formation du complexe d'attaque membranaire [14-16], recrutent le plasminogène hôte et dégradent les composants du complément [17-20], ou se lient directement à d'autres composants du complément [21,22]. Au total près d'une douzaine B. burgdorferi sensu lato ont maintenant été identifiées des protéines qui présentent des activités spécifiques d'inhibition du complément [23].

Dans le petit arsenal des inhibiteurs du complément borrélial, la lipoprotéine exprimée en surface B. burgdorferi BBK32 reste le seul inhibiteur classique spécifique de la voie identifié et caractérisé [22]. La voie classique est contrôlée par l'action du premier composant du complément, C1, qui est un complexe multiprotéique composé de C1q lié à un hétérotétramère de deux sérine protéases, C1r et C1s (S1 Figue). C1 fonctionne ainsi à la fois comme molécule de reconnaissance de formes et comme zymogène initiateur de la voie classique. Le complexe C1 circule dans le sang sous une forme inactive jusqu'à ce que C1q soit recruté à la surface via la reconnaissance de récepteurs tels que les complexes immuns. La liaison C1q favorise l'activation autocatalytique de la protéase C1r au sein du complexe C1 qui clive ensuite les C1 pour former C1 entièrement activé. A cette étape, l'enzyme Cls clive les composants du complément C2 et C4, et la voie classique croise la voie des lectines lors de la formation des convertases C3 de la voie classique/lectine (C4b2a). Les convertases C3 convertissent ensuite le complément C3 en ses formes activées, qui à leur tour entraînent des réactions en aval de la cascade. Auparavant, nous avons montré que le domaine globulaire C-terminal de B. burgdorferi BBK32 (appelé BBK32-C) bloque l'activation de la voie classique en se liant avec une haute affinité à la sérine protéase d'initiation C1r et en empêchant à la fois ses activités de clivage autocatalytique et C1s au sein du complexe C1 [22] (S1 Fig).

Dans cette étude, nous avons étudié l'activité des orthologues BBK32 codés par le B. burgdorferi sensu lato espèce B. garinii et B. afzelii pour mieux comprendre la base structurelle et mécanique de l'inhibition du C1r médiée par BBK32. Nous rapportons ici la première structure cristalline du domaine anti-complément de BBK32 qui révèle un nouveau pli de faisceau hélicoïdal. Une stratégie de mutagenèse chimérique a fourni des informations supplémentaires sur la réduction in vitro activités de B. garinii BBK32 orthologue BGD19 relatif au B. afzelii BBK32 orthologue BAD16 et B. burgdorferi BBK32 lui-même. Des études biochimiques ont ensuite été utilisées pour cartographier le site de liaison BBK32 sur le C1r humain et ont démontré que le domaine de la sérine protéase (SP) était requis pour la formation du complexe BBK32/C1r. Les résultats de cette étude améliorent considérablement notre compréhension des propriétés uniques d'inhibition de la voie classique de BBK32 et suggèrent que l'activité d'évasion du complément médiée par BBK32 est partagée entre les principales espèces de spirochètes associés à la maladie de Lyme.


RÉSULTATS

Le plasminogène lié à la PGK est activé en plasmine et clive C3b

L'enzyme glycolytique pneumococcique PGK se lie au plasminogène et à son activateur tPA (31). Cependant, il n'est pas clair si la PGK peut également recruter du plasminogène à partir du sérum humain. Pour évaluer cela, des plaques de microtitration recouvertes de PGK ont été incubées avec plusieurs dilutions de sérum humain, et la liaison du plasminogène a été détectée avec des Ab spécifiques. Une augmentation dose-dépendante de la liaison du plasminogène proportionnelle à la concentration sérique a été obtenue (Fig. 1 UNE).

Le plasminogène lié à la PGK est fonctionnellement actif. UNE, des plaques de microtitration ont été recouvertes de PGK (5 &# 003bcg/ml) et des quantités croissantes de sérum ont été ajoutées. Le plasminogène lié a été détecté en utilisant un Ab polyclonal spécifique. La gélatine a été utilisée comme témoin négatif. Les données sont présentées sous forme de moyenne et S.D. de trois expériences indépendantes réalisées en double. La signification statistique a été calculée en utilisant une ANOVA à deux facteurs. ***, p < 0,001. B, le plasminogène lié à la PGK clive la protéine du complément C3b. Des plaques de microtitration recouvertes de PGK (5 x003bcg/puits) ont été incubées avec du tPA ou de l'uPA (10 unités/puits) suivies de l'ajout de plasminogène (5 x003bcg/puits) et de 125 I-C3b. Après incubation pendant 1,5 h à 37 ଌ, les échantillons ont été prélevés puis séparés par SDS-PAGE. Le contrôle positif (+ve Ctrl) contenait le facteur H mélangé avec le facteur I, 125 I marqué C3b, tandis que dans le contrôle négatif (−ve Ctrl) Le facteur I a été omis. Un La Flèche marque les produits de clivage de C3b. Des données représentatives de trois expériences indépendantes sont présentées.

Il est connu que le plasminogène interagit avec la protéine du complément C3 et lors de l'activation de la plasmine inactive le complément au niveau de C3 (32). Pour déterminer si le plasminogène lié à la PGK peut également affecter le complément, le tPA ou l'uPa liés à la PGK immobilisée ont été incubés avec du plasminogène et du C3b marqué au 125I. Après l'incubation, les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE et les produits de clivage de C3b ont été analysés. Le modèle de signal de protéine résultant a révélé le clivage de C3b par le plasminogène activé (plasmine) (Fig. 1 B). Il est important de noter qu'aucun clivage de C3b n'a été observé lors de l'incubation avec les activateurs seuls ou en présence de BSA (Fig. 1 B), suggérant que le plasminogène lié à la PGK a été converti en plasmine protéolytiquement active, qui à son tour a clivé C3b.

PGK inhibe l'activité hémolytique du sérum humain

La PGK étant également une protéine sécrétée, nous avons demandé si elle avait un rôle supplémentaire dans la modulation de l'attaque du complément. Pour déterminer si la PGK pneumococcique inhibe l'activité des voies classiques et alternatives du complément, des tests hémolytiques ont été effectués.Le sérum humain a été mélangé avec diverses concentrations de PGK recombinante et a ensuite été incubé avec des érythrocytes. Les résultats démontrent une inhibition dose-dépendante significative de la lyse des érythrocytes par la voie classique ( Fig. 2 UNE), alors que la PGK n'a eu qu'un effet négligeable sur la lyse médiée par la voie alternative, même aux concentrations les plus élevées ( Fig. 2 B).

La PGK inhibe l'activité hémolytique du sérum humain. Pour mesurer l'effet inhibiteur de la PGK sur la voie classique, des érythrocytes recouverts d'ambocepteurs ont été soumis à une attaque du complément du NHS en présence de quantités croissantes de PGK pneumococcique dans le tampon DGVB 2+ (UNE). La BSA a été utilisée comme témoin négatif. Le degré de lyse a été estimé par mesure de la libération d'hémoglobine. Pour étudier l'inhibition de la voie alternative, des érythrocytes de lapin ont été incubés avec du NHS avec des concentrations croissantes de PGK pneumococcique dans du tampon Mg 2+ EGTA (B). FH et BSA ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. La lyse cellulaire a été mesurée comme dans UNE. L'absorbance obtenue sans inhibiteur a été fixée à 100 %. Les graphiques montrent la moyenne ± S.D. de trois expériences indépendantes réalisées en double. La signification statistique des différences a été calculée à l'aide d'une analyse de variance bidirectionnelle et d'un post-test de Bonferroni. ***, p < 0,001.

Pour corroborer les résultats ci-dessus et démontrer que la PGK inhibe effectivement la cascade du complément, des plaques de microtitrage ont été recouvertes de ligands activateurs du complément, d'IgG agrégées (voie classique), de mannane (voie des lectines) et de zymosan (voie alternative). Ensuite, du NHS préincubé avec de la PGK a été ajouté. Le dépôt de MAC (C5b9) a été mesuré avec des Ab monoclonaux reconnaissant spécifiquement un néo-épitope présent dans le polymère C9 de C5b9-MAC. Le prétraitement du sérum avec la PGK a inhibé de manière significative le dépôt de MAC d'une manière dose-dépendante via les trois voies (Fig. 3, A𠄼). Pris ensemble, nos données ont indiqué que la PGK inhibe spécifiquement la cascade du complément.

La PGK inhibe mais n'active pas les voies du complément. La PGK a été préincubée avec du NHS dans du tampon GVB 2+ ou Mg 2+ EGTA et ajoutée à des plaques de microtitration recouvertes d'IgG humaine agrégée (UNE), mannan (B) et le zymosane (C). C4BP (UNE et B) et FH (C) ont été utilisés comme contrôles positifs, tandis que BSA a été utilisé comme contrôle négatif. Le dépôt de MAC (C5b-9) a été mesuré en utilisant un Ab aE11 monoclonal. La quantité de composants MAC déposés en l'absence d'inhibiteur a été fixée à 100 %. Les données représentent la moyenne ± S.D. de trois expériences indépendantes réalisées en double. La signification statistique des différences a été calculée à l'aide d'une analyse de variance bidirectionnelle et du post-test de Bonferroni. ***, p < 0,001. , pour l'analyse de l'activation de la voie classique, les plaques ont été recouvertes de PGK, avec des IgG humaines agrégées comme contrôle positif ou BSA comme contrôle négatif. Les plaques ont été incubées avec les concentrations indiquées de NHS dans du tampon GVB 2+. Le dépôt de C3b a été détecté avec des Abs spécifiques. E, pour l'analyse de l'activation de la voie alternative, du NHS dilué dans du tampon Mg 2+ EGTA a été ajouté à des plaques recouvertes de zymosan, et le dépôt de C3b a été mesuré. Les moyens ± S.D. de trois expériences indépendantes réalisées en double sont présentées.

PGK n'active pas le complément

Comme la PGK inhibe significativement le complément, nous avons demandé si l'inhibition observée était due à la capacité de la PGK à activer et par conséquent à consommer le complément comme cela a été récemment démontré pour l'endopeptidase O pneumococcique (33). À cette fin, des plaques de microtitration recouvertes de PGK, avec des agents d'activation du complément pour les trois voies comme témoins positifs et BSA comme contrôle négatif, ont été incubées avec du NHS suivi de la détection du composant du complément déposé C3b avec des Abs spécifiques. La PGK n'a induit aucun dépôt de C3b via la voie classique et la voie alternative ( Fig. 3 , et E). Pour l'étude de la voie des lectines, du sérum humain appauvri en C1q a été utilisé. Semblable aux résultats obtenus pour les deux autres voies, un dépôt négligeable de C3b a été déclenché par PGK (données non présentées). Ensemble, nos données indiquent que la PGK n'active aucune des voies du complément.

PGK lie les composants MAC et inhibe sa formation

Les résultats ci-dessus ont montré que bien que la PGK n'active pas le complément, sa présence dans le sérum inhibe de manière significative le dépôt de MAC par les trois voies (Fig. 3). Pour étayer les données, nous avons testé la capacité de PGK à bloquer la formation de MAC en utilisant des composants MAC purifiés. La surveillance de la lyse des érythrocytes a été effectuée sous forme de lecture. La PGK a été préincubée avec des C7, C8 et C9 purifiés, puis ajoutée à des érythrocytes de mouton traités au C5b6 et sensibilisés aux ambocepteurs. La présence de PGK a significativement inhibé la lyse des érythrocytes de manière dose-dépendante (Fig. 4 UNE). La PGK à 80 μg/ml a inhibé la lyse des érythrocytes de près de 90 %, alors que la BSA incluse comme contrôle négatif ne l'a pas fait (Fig. 4 UNE). Les données confirment en outre le rôle inhibiteur de la PGK dans la formation de MAC.

La PGK se lie aux composants MAC et inhibe sa formation. UNE, la PGK inhibe l'hémolyse des érythrocytes en utilisant des composants terminaux purifiés du complément. La PGK (0� μg/ml) a été préincubée avec C7, C8 et C9 et ajoutée à des érythrocytes de mouton recouverts de C5b-6. Après l'incubation, la lyse cellulaire a été mesurée et la lyse en l'absence d'inhibiteur a été fixée à 100 %. B, PGK lie les composants terminaux du complément C5, C7 et C9. Des plaques de microtitrage ont été recouvertes de PGK (5 μg/ml) et des quantités croissantes de C5, C6, C7, C8 et C9 ont été ajoutées. La liaison a été détectée en utilisant des Abs polyclonaux spécifiques. Pour UNE et B, la BSA a été utilisée comme contrôle négatif. La moyenne ± S.D. de trois expériences indépendantes réalisées en double est présentée. La signification statistique a été calculée en utilisant une ANOVA à deux facteurs. ns, insignifiant ***, p < 0,001. C, PGK lie simultanément C5, C7 et C9. La PGK a été immobilisée sur des plaques de microtitrage et un mélange de C5, C7 et C9 (2,5 &# 003bcg/ml chacun) a été ajouté. Les C5, C7 et C9 liés ont été détectés séparément en utilisant des Ab spécifiques qui n'ont pas réagi de manière croisée avec d'autres protéines. Les données présentées proviennent de trois expériences en double indépendantes ± S.D. Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour calculer la signification statistique entre la liaison en l'absence et la présence de protéines. , PGK inhibe la formation de MAC au niveau de C5. De la PGK préincubée avec C5 (0,5 &# &# 003bcg/ml) et C6 (0,75 &# 003bcg/ml) a été ajoutée à des érythrocytes de mouton incubés avec 1 % de sérum appauvri en C5. Après incubation, les érythrocytes ont été lavés et encore incubés avec C7, C8 et C9. Le degré de lyse a été estimé par mesure de la libération d'hémoglobine. Les valeurs moyennes ± S.D. de trois expériences distinctes sont présentés. *, p < 0,05l **, p < 0,01 ***, p < 0,001.

Pour comprendre le mécanisme d'inhibition de MAC, nous avons étudié la capacité de la PGK à interagir avec des composants MAC purifiés. Des plaques de microtitrage recouvertes de PGK ont été incubées séparément avec C5, C6, C7, C8 et C9 purifiés, et la liaison a été détectée en utilisant des Abs spécifiques. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. Les résultats ont indiqué une liaison dose-dépendante de C5, C7 et C9 à PGK, alors qu'aucune interaction n'a été détectée entre PGK et C6 ou C8 (Fig. 4 B).

Pour répondre à la question de savoir si C5, C7 et C9 se lient simultanément à PGK ou si les sites de liaison de ces protéines sont indépendants les uns des autres, des concentrations de 2,5 μg/ml des protéines ont été ajoutées à diverses combinaisons, comme indiqué sur la figure 4 C. Les résultats indiquent que C5 et C7 avaient des sites de liaison se chevauchant partiellement sur PGK. En revanche, C9 n'a rivalisé avec aucun de ceux-ci pour la liaison à la PGK. Ensemble, les données démontrent que la PGK se lie simultanément à C5, C7 et C9 pour inhiber la formation de MAC fonctionnellement active (Fig. 4 C).

Pour vérifier l'effet de l'interaction PGK-C5 sur la formation de MAC, l'activité hémolytique a été étudiée. Pour cela, de la PGK préincubée avec C5 et C6 a été ajoutée à des érythrocytes de mouton sensibilisés à Ab qui ont été traités avec du sérum appauvri en C5. Après l'incubation, des protéines C7, C8 et C9 purifiées ont été ajoutées et la lyse des érythrocytes a été évaluée. Une inhibition dose-dépendante de la lyse érythrocytaire a été observée en présence de PGK (Fig. 4 ). Pris ensemble, les données ont clairement indiqué que la PGK affecte le processus de formation du MAC fonctionnel en raison de son interaction avec C5.

PGK interagit avec C7 et inhibe la formation de MAC

L'interaction PGK-C7 a été caractérisée en analysant la liaison de C7 à la PGK immobilisée. Des plaques de microtitrage recouvertes de PGK recombinante ont été incubées avec des concentrations croissantes de C7, et la liaison a été détectée en utilisant des Abs spécifiques. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. Une liaison dose-dépendante de C7 à la PGK immobilisée a été déterminée (K = 125 ± 13 n m ) (Fig. 5 UNE). De même, dans un cadre inverse, la liaison dose-dépendante de la PGK à la C7 immobilisée a été mesurée (Fig. 5 B).

C7 lie PGK. Les plaques de microtitrage ont été recouvertes de PGK (5 μg/ml) (UNE) ou C7 (5 μg/ml) (B), et des quantités croissantes de C7 ou de PGK ont été ajoutées. La liaison a été détectée en utilisant des Abs polyclonaux spécifiques. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. La signification statistique a été calculée en utilisant l'ANOVA à deux facteurs et le post-test de Bonferroni. Des plaques de microtitrage ont été recouvertes de PGK et l'effet de différentes concentrations de NaCl (C) ou de l'héparine () sur la liaison de C7 (2,5 μg/ml) à PGK a été analysé. La quantité de C7 lié en l'absence de NaCl ou d'héparine a été fixée à 100 %. Des Ab polyclonaux spécifiques ont été utilisés pour détecter le C7 lié. Une ANOVA unidirectionnelle et un post-test de Dunnett ont été effectués pour calculer les différences statistiques par rapport à la liaison à 150 mm de NaCl ou sans héparine. E, PGK n'affecte pas la liaison de C7 à C5b-6. La protéine de complément C7 préincubée sans ou avec PGK ou BSA a été ajoutée à C5b-6 immobilisée, et la liaison a été détectée en utilisant des Ab polyclonaux spécifiques. F, PGK inhibe la formation de MAC au niveau de C7. De la PGK (50 px003bcg/ml) préincubée avec C7 a été ajoutée à des érythrocytes de mouton recouverts de C5b-6. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. Après lavage, les érythrocytes ont été incubés avec un mélange de C8 et C9, et l'hémolyse a été mesurée. Les données présentées proviennent de trois expériences en double indépendantes ± S.D. L'ANOVA à un facteur a été utilisée pour calculer la signification statistique ns, insignifiant **, p < 0,01 ***, p < 0,001.

Pour déterminer si l'interaction entre C7 et PGK est de caractère hydrophobe ou ionique, l'essai de liaison susmentionné a été réalisé en présence de concentrations variables de NaCl. La liaison de C7 à PGK diminuait considérablement avec l'augmentation des concentrations de NaCl (Fig. 5 C). À 800 m m NaCl, la liaison C7 à PGK a été réduite de 60 % par rapport à la liaison à la concentration physiologique de 150 m m NaCl ( Fig. 5 C). Comme C7 se lie à l'héparine, l'effet de l'héparine sur l'interaction PGK-C7 a été déterminé (34). Une modulation dose-dépendante de la liaison de C7 à PGK en présence d'héparine a été observée. La quantité de 400 μg/ml d'héparine a réduit la liaison de 45 % (Fig. 5 ).

Pour disséquer plus en détail l'effet de l'interaction PGK-C7 sur la formation de MAC, nous avons analysé si PGK inhibe la liaison de C7 au complexe C5b6. La PGK a été préincubée avec C7, puis le mélange a été ajouté à C5b6 immobilisé. Les données résultantes ont indiqué que C7 lié à C5b6, et C7 complexé avec PGK lié avec la même intensité ( Fig. 5 E). Ainsi, l'interaction PGK-C7 ne bloque pas la fixation de C7 au complexe C5b6, mais un effet sur son insertion membranaire ne peut être exclu. Pour vérifier cette hypothèse, l'activité hémolytique a été analysée. La PGK a été préincubée avec C7 puis ajoutée à des érythrocytes de mouton traités avec C5b6. Ceci a été suivi d'une incubation avec C8 et C9, et l'étendue de la lyse a été déterminée. La PGK (50 μg/ml) a significativement réduit la lyse des érythrocytes de �% par rapport à la lyse en l'absence de PGK (Fig. 5 F). Dans l'ensemble, l'interaction PGK-C7 inhibe la formation de MAC en affectant l'insertion de C7 dans la membrane cible.

PGK Relie C9

Pour évaluer l'interaction PGK-C9, des plaques de microtitrage recouvertes de PGK ont été incubées avec des concentrations croissantes de C9 humain purifié, suivies d'une détection à l'aide d'Abs spécifiques. Une liaison dose-dépendante de C9 à la PGK immobilisée a été observée (K = 37 ± 3 n m ) (Fig. 6 UNE). De plus, la liaison de la PGK pneumococcique à la C9 immobilisée a également été détectée dans des contextes inversés (Fig. 6 B). Dans d'autres essais, l'effet du NaCl et de l'héparine sur l'interaction PGK-C9 a été étudié. Semblable à PGK-C7, la liaison de C9 à PGK a été affectée en présence de concentrations croissantes de NaCl et d'héparine, respectivement (Fig. 6, C et ). À 800 m m de NaCl, la liaison de C9 à PGK a été réduite de 45 % par rapport à 150 m m de NaCl ( Fig. 6 C). De même, la présence de 800 μg/ml d'héparine a réduit la liaison jusqu'à 55% ( Fig. 6 ). Pris ensemble, PGK est une protéine de liaison C9, et l'interaction est influencée par la force ionique.

PGK lie C9. Des quantités croissantes de C9 (UNE) ou PGK (B) ont été ajoutés aux plaques de microtitrage après revêtement avec soit PGK ou C9 (5 &# 003bcg/ml), respectivement. La liaison a été détectée en utilisant des Abs polyclonaux spécifiques. La BSA a été utilisée comme témoin négatif. La signification statistique a été calculée en utilisant l'ANOVA à deux facteurs et le post-test de Bonferroni. Les plaques de microtitrage ont été recouvertes de PGK et l'effet de différentes concentrations de NaCl (C) ou de l'héparine () sur la liaison de C9 (2,5 μg/ml) à PGK a été analysé. La quantité de C9 lié en l'absence de NaCl ou d'héparine a été fixée à 100 %. Abs polyclonaux spécifiques détectés liés à C9. Une ANOVA unidirectionnelle et un post-test de Dunnett ont été effectués pour calculer les différences statistiques par rapport à la liaison à 150 mm de NaCl ou sans héparine. Liaison de C9 et du plasminogène à la PGK. La PGK a été immobilisée sur des plaques de microtitrage. Une quantité constante de C9 (2 μg/ml) avec des quantités croissantes de plasminogène (E) ou une quantité constante de plasminogène (2 μg/ml) avec des quantités croissantes de C9 (F) était ajouté. Le C9 lié et le plasminogène ont été détectés en utilisant des Abs spécifiques. Les données présentées proviennent de trois expériences en double indépendantes ± S.D. La signification statistique a été calculée en utilisant l'ANOVA à un facteur et le post-test de Dunnett. ***, p < 0,001.

Étant donné que la PGK se lie également au plasminogène, nous avons demandé si C9 et le plasminogène se lient simultanément à la PGK et si les sites de liaison de ces deux protéines sur la PGK sont indépendants l'un de l'autre. Pour cela, une concentration constante de C9 (2 μg/ml) a été ajoutée avec des concentrations croissantes de plasminogène ou une concentration constante de plasminogène (2 μg/ml) en présence d'une quantité croissante de C9 à la PGK immobilisée. Le C9 et le plasminogène liés ont été détectés en utilisant des Abs spécifiques. La liaison de C9 à la PGK n'a pas été affectée par la présence de plasminogène (Fig. 6 E). De même, la présence de concentrations croissantes de C9 n'a pas influencé la liaison du plasminogène à la PGK immobilisée (Fig. 6 F). Prises ensemble, les deux protéines ne sont pas en compétition pour se lier à la PGK, ce qui indique que C9 et le plasminogène peuvent se lier simultanément et à des sites de liaison ne se chevauchant pas sur la PGK.

PGK inhibe la polymérisation C9 et la formation de MAC

En raison du fait que PGK interagit avec C9, nous avons étudié les effets sur l'auto-polymérisation de C9 ou son interaction avec C5b8. Pour examiner si PGK inhibe la polymérisation C9, 0,5 μ m C9 a été incubé avec des quantités croissantes de PGK (0𠄵 μ m ) pendant la nuit à 37 ଌ, et les échantillons ont été analysés par SDS-PAGE dans des conditions réductrices suivies par Western blot avec des Abs anti-C9. La BSA (5 μ m ) a été utilisée comme témoin négatif. Le modèle résultant indique que PGK a inhibé la polymérisation de C9 d'une manière dépendante de la concentration (Fig. 7 UNE). Les intensités des bandes pour le C9 polymérisé ont été déterminées par densitométrie ( Fig. 7 B).

PGK inhibe la polymérisation C9. UNE, PGK inhibe la polymérisation C9. C9 a été mélangé avec différentes quantités de PGK (0𠄵 μ m ) ou de BSA (5 μ m ) comme contrôle négatif. Les échantillons ont été séparés par une SDS-PAGE à gradient de 2,5� % et transférés sur membrane PVDF, et C9 a été détecté en utilisant des Abs spécifiques par analyse Western blot. B, les intensités des bandes pour C9 polymérisé (de UNE) ont été déterminés par densitométrie et sont présentés comme la valeur moyenne de trois expériences indépendantes ± S.D. Une ANOVA à un facteur a été réalisée pour tester des différences significatives entre la polymérisation C9 en l'absence et en présence de concentrations croissantes de PGK. C, la capacité de la PGK à inhiber l'incorporation de C9 dans le MAC a été étudiée en soumettant des érythrocytes de mouton sensibilisés à du sérum humain appauvri en C9 après avoir ajouté de la PGK préincubée avec C9. L'étendue de l'hémolyse a été déterminée par mesure de l'absorbance de l'hémoglobine libérée à 405 nm. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. Le signal obtenu en l'absence d'inhibiteur a été fixé à 100 %, et les graphiques montrent la moyenne ± S.D. de trois expériences individuelles. La signification statistique des différences a été calculée avec une ANOVA à deux facteurs et un post-test de Bonferroni. ns, insignifiant *, p < 0,05 ***, p < 0,001.

Pour évaluer davantage l'importance de l'inhibition de la polymérisation de C9 sur l'atténuation de la formation de MAC fonctionnelle, des érythrocytes de mouton sensibilisés par Ab ont été soumis à une attaque du complément à partir de sérum appauvri en C9 pour induire la formation de C5b8 à leur surface. C9 avait été préincubé avec des quantités croissantes de PGK et a ensuite été ajouté aux cellules. La lyse a été évaluée en mesurant la libération d'hémoglobine. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. La PGK a inhibé la lyse des érythrocytes de manière dose-dépendante ( Fig. 7 C), indiquant que l'interaction PGK-C9 affecte la formation de MAC.

PGK limite le dépôt de MAC sur les pneumocoques, qui est indépendant du sérotype

Le polysaccharide capsulaire est un facteur de virulence essentiel des pneumocoques et à ce jour, des polysaccharides capsulaires distincts sur le plan sérologique ont été décrits (35, 36). On sait que les polysaccharides capsulaires rendent les pneumocoques résistants à l'opsonophagocytose médiée par le complément et interfèrent avec l'interaction pneumococcique avec les cellules hôtes et les protéines (37). Pour démontrer la pertinence fonctionnelle de la PGK pneumococcique, nous avons étudié l'étendue du dépôt de MAC sur la surface pneumococcique après incubation avec diverses concentrations sériques. L'analyse par cytométrie en flux a démontré un dépôt dose-dépendant de MAC sur la surface du pneumocoque via la voie d'activation du complément classique et alternative, proportionnel à la concentration sérique (Fig. 8, UNE et B). Pour étudier si le polysaccharide capsulaire affecterait également l'étendue du dépôt de MAC, une collection de 12 isolats cliniques de S. pneumoniae (Tableau 1) appartenant à 12 sérotypes différents a été analysé pour le niveau de dépôt de MAC après traitement avec du sérum humain. Les analyses de cytométrie en flux ont démontré un dépôt de MAC avec une étendue variable sur tous les isolats cliniques testés médiés via la voie d'activation du complément classique et alternative (tableau 1). De plus, les souches hautement encapsulées comme les souches de sérotype 3 étaient relativement résistantes au dépôt MAC, alors que le NCTC10319 type 35A avait un signal relativement fort pour le dépôt MAC. Ainsi, les données suggèrent que le dépôt de MAC est un mécanisme général qui est influencé par l'étendue de la capsule.

Détection de dépôt MAC (C5b-9) sur S. pneumoniae en utilisant la cytométrie en flux. Les pneumocoques NCTC10319 ont été incubés avec une concentration croissante de NHS dans du tampon GVB 2+ pour la voie classique (UNE) ou du tampon Mg 2+ EGTA pour la voie alternative (B) et incubé pendant 1 h à 37 ଌ. Le dépôt de MAC (C5b-9) a été détecté en utilisant le mAb aE11 Ab qui reconnaît un néo-épitope présent dans le polymère C9 mais absent dans le monomère C9. Les données GMFI d'au moins trois expériences indépendantes sont présentées (moyenne ± S.D.) comme mesure du dépôt de MAC par voie classique et alternative. Encart, un histogramme représentatif de cytométrie en flux pour le dépôt de MAC via les deux voies est montré. Signification statistique du dépôt de MAC par rapport au fond de bactéries (Bac.) a été calculé à l'aide de l'ANOVA à un facteur. PGK limite le dépôt de MAC sur la surface du pneumocoque. Le dépôt de MAC (C5b-9) via le classique (C et ) ou voie alternative (E et F) sur la surface du pneumocoque (NCTC10319) à partir de 0,2 et 2 % de NHS, respectivement, a été mesurée en l'absence ou en présence de protéine PGK ajoutée exogène. La BSA a été utilisée comme contrôle négatif. Le MAC déposé a été analysé par cytométrie de flux en utilisant le mAb aE11. Un histogramme de cytométrie en flux représentatif de trois expériences indépendantes est montré (C et E) et les valeurs GMFI ( et F) de trois expériences indépendantes réalisées en double sont présentées. La signification statistique a été calculée en utilisant une analyse de variance à un facteur. ns, insignifiant *, p < 0,05 ***, p < 0,001.

Pour vérifier le rôle de la PGK dans l'inhibition du dépôt de MAC, des expériences de blocage ont été réalisées. Le dépôt de MAC via la voie classique d'activation du complément sur les pneumocoques a été mesuré par cytométrie en flux en présence de PGK. Les analyses de cytométrie en flux ont indiqué une inhibition compétitive dose-dépendante du MAC sur les pneumocoques par la PGK (Fig. 8, C et ). En revanche, la BSA n'a montré aucun effet inhibiteur. Une inhibition similaire a été observée sur le dépôt de MAC via la voie alternative d'activation du complément (Fig. 8, E et F). En résumé, nos données identifient pour la première fois la PGK comme un nouvel inhibiteur du complément de l'espèce Gram-positive S. pneumoniae qui inhibe la formation de MAC fonctionnel. La PGK interagit spécifiquement avec les composants terminaux du complément C5, C7 et C9, modulant ainsi l'attaque du complément (Fig. 9).

Modèle schématique de l'inhibition du complément médiée par la PGK pneumococcique. La PGK inhibe les trois voies en interagissant avec les protéines C5, C7 et C9 et en interférant avec la polymérisation C9.


Résultats

Génération et caractérisation des MoAbs anti-properdine humaine 3A3E1, 6E11A4, 1G6D2 et 6E9E6

Les quatre clones anti-properidine humaine ont été sélectionnés sur la base de leur capacité à reconnaître fortement la properdine lorsqu'ils sont évalués dans un ELISA direct et ces anticorps ont été purifiés par chromatographie sur protéine G et déterminés comme étant l'isotype kappa IgG1 (données non présentées). Les MoAb anti-properdine purifiés reconnaissent uniquement la properdine non réduite, telle qu'évaluée par immuno-transfert de type western (figure 1A), et reconnaissent la properdine humaine, babouin, lapin et canine, mais pas la properdine de souris, de rat, de félin ou de furet (données non présentées ). De plus, pour déterminer si les MoAb reconnaissent des épitopes distincts, des ELISA de compétition ont été effectués où chaque anticorps anti-properdine a été biotinylé et mélangé avec chacun des autres clones d'anticorps anti-properdine non marqués, suivis d'une incubation avec des plaques ELISA enduites de properdine, et la liaison de l'anticorps biotinylé à la properdine a été mesurée. 6E9E6 et 1G6D2 n'ont pas rivalisé pour se lier à la properdine (figures S1A, B) et reconnaissent ainsi des épitopes distincts sur la properdine, tandis que 3A3E1 et 6E11A4 ont rivalisé pour se lier à la properdine dans l'ELISA compétitif (figures S1C, D), indiquant qu'ils reconnaître les mêmes épitopes ou des épitopes qui se chevauchent. Parce que l'oligomérisation de la properdine est associée à la fonction de la properdine [examiné dans (14, 16)], nous avons cherché à déterminer si les anticorps pouvaient faire la distinction entre les dimères (P2), trimères (P3), et les tétramères (P4) de properdine en utilisant des oligomères de properdine purifiés dans des ELISA directs. La figure 1B indique que les MoAb reconnaissent les différents oligomères de properdine dans la même mesure et ne peuvent pas les distinguer.

Figure 1. Génération et caractérisation d'AcMo anti-properdine (3A3E1, 6E11A4, 1G6D2, 6E9E6). (UNE) Les MoAb anti-properdine reconnaissent la properdine non réduite (P) mais pas la properdine réduite (P). 10 ng de properdine non fractionnée non réduite ou réduite ont été détectés avec les AcMo anti-properdine 3A3E1, 6E11A4, 1G6D2 ou 6E9E6, ou un contrôle isotypique IgG1 de souris purifié à 1 μg/ml par immuno Western blot. La liaison des anticorps à la properdine non réduite (piste 1𠄵, 11) ou réduite (piste 6�) est montrée. La piste 11 est un contrôle positif qui contient 10 ng de properdine purifiée détectée par 1 μg/mL 1G6D2 anti-properdine MoAb dans des conditions non réduites. La flèche indique la taille du monomère properdin (繐 kDa). (B) Les MoAb anti-properdine reconnaissent toutes les formes de properdine [P2, P3, P4, ou de la properdine non fractionnée (P)] dans un ELISA direct. La liaison a été détectée comme décrit dans “Merials and Methods.” Les résultats sont présentés sous forme de moyenne et d'écart-type de triples. (C) 3A3E1 et 6E11A4 inhibent l'hémolyse médiée par AP des érythrocytes de lapin (ER). ER ont été incubés avec du NHS en présence de l'un des MoAb anti-properdine indiqués. L'activité hémolytique a été déterminée comme décrit dans “Merials and Methods” et a été exprimée en pourcentage relatif (%) d'hémolyse. Les résultats sur la gauche sont présentés sous forme de moyenne et d'écart type des observations en double. Les résultats sur la droite sont présentés sous forme de moyenne et d'écart-type des observations en double pour 6E9E6 et des observations uniques pour les témoins 3A3E1 et 1G6D2. (RÉ) 3A3E1 et 6E11A4 inhibent la capacité de la properdine à se lier à ESC3b. Chaque AcMo anti-properdine (1G6D2, 6E9E6, 3A3E1, 6E11A4 ou anti-Pȱ) ou contrôle isotypique a été incubé avec de la properdine (P) et ESC3b. La liaison de properdin à ESC3b a été déterminé comme décrit dans “Matériaux et méthodes.” “No P” était un contrôle négatif sans ajout de properdine, et “Oseulement P” était un contrôle positif dans lequel aucun anticorps d'inhibition n'avait été ajouté. Le graphique est un représentant de trois expériences indépendantes et est représenté par la moyenne et l'écart-type des doublons. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec des comparaisons multiples de Dunnett contre “No P” p < 0,0001 in “Only P,” “I contrôle de sotype+P,” 𠇁G6D2+P,” �+P” groupes.

Les MoAbs anti-properdine inhibent la stabilisation médiée par la properdine de la convertase C3bBb de l'AP en inhibant la liaison de la properdine à C3b

Afin de déterminer si les anticorps inhibent la capacité de la properdine à stabiliser les convertases C3bBb, un test d'hémolyse AP a été réalisé en utilisant des érythrocytes de lapin. Les anticorps anti-properdine 6E11A4 ou 3A3E1 ont inhibé l'hémolyse des érythrocytes de lapin de manière dose-dépendante, alors que 1G6D2 et 6E9E6 n'ont pas inhibé la lyse cellulaire, même lorsqu'ils ont été testés à 16 μg/ml (Figure 1C). Un anti-Pȱ commercial a été utilisé comme témoin positif pour l'inhibition. La concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) était de 0,5 μg/ml pour 6E11A4, de 0,6 μg/ml pour l'anti-Pȱ et de 0,7 μg/ml pour 3A3E1. Parce que la properdine doit se lier à C3b afin de stabiliser la convertase, la capacité des anticorps à inhiber la liaison de la properdine à C3b a été testée par cytométrie en flux. La figure 1D montre que 3A3E1 et 6E11A4 ont complètement altéré la liaison de la properdine aux érythrocytes recouverts de C3b (ESC3b), contrairement à 1G6D2 et 6E9E6.

Détermination du rôle de la properdine dans la promotion de la lyse médiée par le complément des globules rouges HPN in vitro

L'inhibition de Properdin empêche la lyse médiée par le complément des érythrocytes humains de type “PNH” (EH), et le fait plus efficacement que les autres inhibiteurs du complément

En utilisant les MoAb anti-properdine inhibiteurs caractérisés, nous avons exploré le rôle de la properdine dans la promotion de la lyse médiée par le complément des globules rouges présentant des défauts de régulation du complément, tels que les globules rouges chez les patients HPN. Nous avons d'abord utilisé EH où CD59 a été bloqué à l'aide d'un anticorps inhibiteur anti-CD59 (cellules de type “PNH”) et rH19-20 a été ajouté comme moyen d'augmenter la lyse globale détectable induite par le sérum en supprimant la protection du facteur H, ce qui évite le besoin d'acidifier le sérum afin d'obtenir le même résultat, comme nous l'avons décrit précédemment (24). À l'aide de ce test, nous avons évalué l'effet du blocage de la properdine avec des MoAb anti-properdine par rapport au blocage d'autres composants du complément, y compris (a) l'anti-facteur B, qui inhibe la formation d'AP convertase en inhibant la liaison du facteur B à C3b (b) Cp20, qui se lie à C3 et interfère avec le clivage de C3 et empêche ainsi la formation de convertase et (c) l'éculizumab et l'OmCI, qui inhibent le clivage de C5 et donc la formation de C5a et de MAC. Chaque inhibiteur a été ajouté à des concentrations croissantes à l'essai, et l'IC90 pour chaque inhibiteur a été déterminé (Figures 2A𠄿). La figure 2G montre le circuit intégré combiné90 valeurs pour les différents inhibiteurs. Les MoAbs anti-properdine 6E11A4 et 3A3E1 ont donné un IC90 de 51 et 53 nM, respectivement. Le CI90 obtenu pour l'anti-facteur B était de 890 nM, environ 17 fois plus élevé que l'IC90 pour les MoAbs anti-properdine. Cp20 a donné un IC90 valeur de ߦ 058 nM, qui était 񾄗 fois plus élevée que les MoAbs anti-properdine (non montrés). Pas de CI90 une valeur a pu être obtenue pour l'éculizumab et l'OmCI, même lorsqu'ils ont été testés à 667 et 5 400 nM, respectivement. Afin de prendre en compte les variations des concentrations plasmatiques de chaque protéine du complément ciblée, des ratios cible/inhibiteur ont été calculés pour chaque inhibiteur en divisant les concentrations plasmatiques en nM de la cible par la CI moyenne.90 valeurs, comme décrit dans “Merials and Methods”. Le rapport pour les MoAbs anti-properdine était de 5,2&# x020135.4 (pour la properdine monomère non illustré) ou de 1,7&# x020131.8 (pour la forme trimère de la properdine, P3, la forme prédominante dans le plasma), pour l'anti-facteur B était de 2,4 et pour Cp20 était de 1,1 (figure 2H). Ceci indique que l'inhibition de la properdine, si elle est considérée comme un trimère, avait un rapport cible/inhibiteur similaire à celui des autres inhibiteurs testés. Le rapport pour l'éculizumab et l'OmCI n'a pas pu être déterminé en raison de leur manque d'IC90 valeurs. Dans l'ensemble, les données montrent que la properdine est essentielle pour favoriser la lyse des globules rouges de type “PNH” et, sur la base de l'IC90 valeurs et ratios cible/inhibiteur, le blocage de la properdine avec des AcMo anti-properdine était au moins aussi efficace que le blocage d'autres composants du complément, c'est-à-dire le facteur B, C3, pour inhiber la lyse médiée par AP de EH qui manquent de protection de la surface cellulaire CD59, tout en étant plus efficace que l'inhibition de C5 (Figure 2).

Figure 2. Efficacité de l'inhibition de la properdine par rapport à d'autres inhibiteurs du complément sur la prévention de la lyse des globules rouges de type “PNH”. (A𠄿) Détermination du CI90 valeurs des inhibiteurs du complément pour inhiber la lyse médiée par le complément des érythrocytes humains de type “PNH” (EH) et les données sont présentées sous forme de moyenne et d'écart-type d'observations en double. EH ont été mélangés avec les réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : 40 % de NHS, 5 mM de MgEGTA ou 10 mM d'EDTA, 11,4 μM rH19-20, 1 μg/ml d'anti-CD59 et l'un des inhibiteurs du complément 6E11A4 (UNE), 3A3E1 (B), anti-facteur B (C), Cp20 (RÉ), éculizumab (E), et OmCI (F) aux concentrations indiquées dans les graphiques. Le % relatif d'hémolyse et IC90 de chaque inhibiteur a été déterminé comme décrit dans “Merials and Methods” et la ligne pointillée est l'endroit où l'inhibition atteint 90 %. CI90 valeurs obtenues en (A𠄿) ont été tracés dans (G) et combinés à partir de deux expériences indépendantes avec des doublons pour chaque inhibiteur, représentés par la moyenne et l'écart-type. CI90 valeurs dans (G) ont été divisés par la concentration plasmatique (nM) de chaque inhibiteur pour évaluer le rapport cible/inhibiteur dans (H). Properdin a été considéré comme un trimère pour le calcul et les résultats de l'éculizumab et de l'OmCI n'ont pas été inclus car aucun IC90 des valeurs pourraient être déterminées. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey **p < 0.01, *p < 0,05, p > 0,05 ns.

L'inhibition de la properdine inhibe la lyse des globules rouges dérivés de patients HPN en protégeant les cellules HPN de type II et III de la lyse

Avec des échantillons de globules rouges provenant de patients HPN qui sont sous traitement par éculizumab, nous avons ensuite déterminé quels types de cellules HPN sont protégés de la lyse médiée par le complément lorsque la properdine est inhibée. Nous avons déjà montré que les cellules HPN de type II et III deviennent très sensibles à la lyse médiée par le complément lorsque la protection du facteur H est supprimée via l'ajout de rH19-20 au sérum (24), ce qui est similaire à ce qui se produit dans le sérum qui a été acidifié. à pH 6,4 (67, 68). La figure 3A montre la distribution CD59 &# x0002B des globules rouges de deux patients lorsqu'ils sont exposés au sérum en l'absence d'activité du complément (contrôle EDTA). Lorsque les globules rouges sont traités avec du NHS en présence de MgEGTA et de rH19-20, les cellules HPN de type II et III sont lysées, laissant les globules rouges normaux intacts, comme prévu (figures 3B&# x02013D, histogrammes gris clair). Les figures 3B,D (lignes noires contre histogrammes gris clair) montrent que, contrairement à l'éculizumab, qui a partiellement empêché la lyse des globules rouges HPN médiée par rH19-20 (figure 3D), l'inhibition de la properdine via MoAb 6E11A4 a complètement protégé les globules rouges HPN de l'AP lyse médiée, rétablissant ainsi la population de GR HPN de type II et III à une distribution similaire à celle du groupe EDTA (figures 3A, B). L'AcMo anti-properdine non inhibiteur 6E9E6 n'a pas empêché les globules rouges HPN de type II et III de la lyse médiée par AP (figure 3C). De plus, l'anti-properdine MoAb 6E11A4 empêche le dépôt de fragments C3 sur les globules rouges HPN dépourvus de protection CD55/CD59, tandis que l'éculizumab et le 6E9E6 ne le peuvent pas (figure 3E). Cela indique que le blocage de la fonction de stabilisation de la properdine protégeait les globules rouges HPN de type II et III de l'activation et de la lyse du complément lorsque la protection du facteur H est supprimée et était plus efficace que l'éculizumab.

figure 3. L'inhibition de la properdine protège les cellules HPN de type II et III de l'opsonisation et de la lyse du complément. Les globules rouges de deux patients HPN sous traitement par éculizumab et d'un patient HPN sans traitement par éculizumab ont été mélangés avec les réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : (UNE) 40 % NHS + 10 mM EDTA + 20 μM rH19-20 (histogrammes gris foncé ombrés de contrôle de la distribution de la population de globules rouges HPN d'origine), ou (B𠄽) NHS + 5 mM MgEGTA + 20 μM rH19-20, en l'absence (histogrammes gris clair) ou en présence (ligne noire) d'un des inhibiteurs du complément [(B) AcMo 6E11A4 inhibiteur de l'anti-properdine (53 nM), (C) AcMo non inhibiteur 6E9E6 (53 nM), ou (RÉ) éculizumab (667 nM)], ou (E) Sérum appauvri en C8 à 40 % (C8-dpl) + 5 mM de Mg-EGTA en présence ou en l'absence de 1 μM rH19-20, 53 nM 6E11A4, 53 nM 6E9E6 ou 667 nM d'éculizumab. 10 mM d'EDTA ont été utilisés comme contrôle négatif. L'analyse des fragments CD59 et C3 des cellules non lysées restantes a été évaluée comme décrit dans “Merials and Methods.” La population de globules rouges normaux, les globules rouges HPN de type II et de type III, sont indiquées par les marqueurs I, II et III, respectivement (A𠄽). Les graphiques sont représentatifs de deux expériences indépendantes avec des observations en double. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey. Seules les statistiques pertinentes ont été présentées dans (E) ****p < 0,0001, ***p < 0,005, **p < 0.01, *p < 0,05, p > 0,05 ns.

L'inhibition de la properdine inhibe la lyse des globules rouges des patients HPN plus efficacement que les autres inhibiteurs du complément

La protection des GR de HPN obtenue par blocage de la properdine a été comparée à celle de l'inhibition d'autres composants du complément (énumérés dans la figure 2). Les globules rouges dérivés de quatre patients HPN traités par éculizumab présentaient une hémolyse basale de 35 % en présence de 40 % de NHS et de MgEGTA (données non présentées), probablement en raison du pourcentage élevé (&# x0003E70 %) de types II et III RBC parmi la population totale de RBC (Figure S2). Les figures 4A𠄿 montrent les données du patient HPN ȱ comme représentatives du criblage de tous les inhibiteurs du complément dans leur capacité à protéger les globules rouges du patient HPN contre la lyse médiée par le complément.Le blocage de la properdine, du facteur B ou C3 a complètement protégé les globules rouges HPN provenant de patients sous traitement par éculizumab contre l'hémolyse médiée par le complément (Figures 4A𠄽). Le CI90 les valeurs des AcMo 6E11A4 et 3A3E1 anti-properdine chez ces quatre patients variaient de 38 nM et 36 nM, respectivement, qui étaient au moins 18 fois, 81 fois inférieures à celle de l'anti-facteur B (avec IC90 688� nM) et Cp20 (avec IC90 3 650 &# x020135 150 nM), respectivement (Figure 4G). Les ratios cible/inhibiteur pour les AcMo anti-properdine 6E11A4 et 3A3E1 étaient de 5,5𠄷.7 (pour le monomère non représenté) ou 1,8𠄲.6 (pour P3, la forme principale dans le plasma), pour l'anti-facteur B était de 2,3𠄳.1, et pour Cp20 était de 1,3𠄱.8 (Figure 4H). Ceci indique que l'inhibition de la properdine, si elle est considérée comme un trimère, avait un rapport cible/inhibiteur similaire à celui des autres inhibiteurs testés. Cependant, l'éculizumab et l'OmCI, les deux inhibiteurs de C5, n'ont pas réussi à inhiber complètement la lyse des globules rouges des patients HPN et ont atteint un plateau d'hémolyse de fond supérieur à 50 % (Figures 4E,F). Le CI90 pour l'éculizumab et l'OmCI dans les quatre globules rouges des patients était supérieur à 667 nM (plus de 13 fois plus que l'IC MoAbs anti-properdine90) et 2 700 nM (au-dessus de 54 fois plus élevé que les anti-properdine MoAbs IC90), respectivement (figure 4G), indiquant que le blocage de C5 était inefficace pour protéger ces globules rouges HPN. Les globules rouges HPN de patients qui ne sont pas traités par l'éculizumab ont également été utilisés pour tester si le blocage de la properdine protégerait ces cellules. Au lieu d'utiliser du sérum acidifié, rH19-20 a été utilisé dans le dosage, comme décrit précédemment (24), pour augmenter la sensibilité requise pour évaluer l'hémolyse médiée par le complément. Le blocage de la properdine inhibe la lyse de plus de 50% chez tous les patients non traités, et IC90 a pu être déterminé chez le patient A (Figures 5A𠄽), tandis que l'éculizumab avait un effet protecteur marginal (Figures 5E–H). L'inefficacité de l'éculizumab sur la protection de ces cellules est intrinsèque à l'inhibition de C5 car un effet similaire est observé en utilisant un autre inhibiteur de C5, OmCI (données non présentées). Étant donné que l'éculizumab, le traitement actuel de l'HPN, a entraîné une inhibition incomplète de la lyse des globules rouges de l'HPN (figures 4E, 5E & 02013H), nous avons ensuite exploré les conséquences de l'utilisation de la combinaison d'AcMo anti-properdine et d'eculizumab dans notre in vitro modèle (figure 6). Anti-properdine MoAb 6E11A4 seul, au CI50 dose (Figure 4A), a réduit l'hémolyse de 繐% et l'éculizumab seul, à la concentration de plateau maximale (Figure 4E 667 nM), a réduit l'hémolyse de 繀% (Figure 6), comme prévu. L'association de l'AcMo anti-properdine et de l'éculizumab a significativement réduit l'hémolyse résiduelle causée par l'éculizumab à 10 %, et l'effet inhibiteur était additif (Figure 6).

Figure 4. Efficacité de l'inhibition de la properdine par rapport à d'autres inhibiteurs du complément sur la prévention de la lyse des globules rouges HPN. (A𠄿) Détermination du CI90 valeurs des inhibiteurs du complément pour inhiber la lyse médiée par le complément des globules rouges de patients HPN. Les résultats des patients HPN sont présentés comme représentatifs des données de quatre patients HPN sous traitement par éculizumab, dont les globules rouges ont été mélangés avec les réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : 40 % de NHS, 5 mM de MgEGTA ou 10 mM d'EDTA, et l'un des les inhibiteurs du complément 6E11A4 (UNE), 3A3E1 (B), anti-facteur B (C), Cp20 (RÉ), éculizumab (E), et OmCI (F) aux concentrations indiquées dans les graphiques. Le % relatif d'hémolyse a été déterminé comme décrit dans “Merials and Methods” et la ligne pointillée est l'endroit où l'inhibition atteint 90 %. Le CI90 valeurs pour quatre patients HPN, obtenues comme dans (A𠄿), ont été représentés graphiquement dans (G). Les données OmCI provenaient de deux patients (ȱ et Ȳ) en raison de stocks limités. Les résultats sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes avec des doublons et sont représentés par la moyenne et l'écart-type. CI90 valeurs dans (G) ont été divisés par la concentration plasmatique (nM) de chaque inhibiteur pour évaluer le rapport cible/inhibiteur dans (H). Properdin a été considéré comme un trimère pour le calcul et les résultats de l'éculizumab et de l'OmCI n'ont pas été inclus car aucun IC90 des valeurs pourraient être déterminées. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0.01, *p < 0,05, p > 0,05 ns.

Figure 5. Le blocage de la properdine inhibe la lyse médiée par le complément des globules rouges HPN qui n'ont pas subi de traitement par éculizumab. (A–H) Détermination du CI90 valeurs des inhibiteurs du complément pour inhiber la lyse médiée par le complément des globules rouges de patients HPN (A𠄽). Les globules rouges HPN ont été mélangés avec les réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : 17 μM rH19-20, 40 % de NHS, 5 mM de MgEGTA ou 10 mM d'EDTA et l'un des inhibiteurs du complément 6E11A4 (A𠄽), éculizumab (E–H) aux concentrations indiquées dans les graphiques. Le % relatif d'hémolyse a été déterminé comme décrit dans “Merials and Methods” et la ligne pointillée est l'endroit où l'inhibition atteint 90 %. Les résultats sont représentatifs des valeurs moyennes de deux expériences indépendantes avec des doublons et sont représentés par la moyenne et l'écart-type.

Figure 6. L'association de l'éculizumab et de l'anticorps anti-properdine MoAb 6E11A4 surmonte l'hémolyse résiduelle de l'inhibition de C5. Les globules rouges HPN ont été mélangés avec les réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : 40 % de NHS, 5 mM de MgEGTA ou 10 mM d'EDTA, en présence de 667 nM d'eculizumab, ou 20 nM (IC50 dose comme le montre la figure 4A) 6E11A4, ou la combinaison de 667 nM d'éculizumab et 20 nM de 6E11A4. L'activité hémolytique a été déterminée comme décrit dans “Merials and Methods” et a été exprimée en % d'hémolyse par rapport à “NHS.” Les résultats sont combinés à partir de trois expériences indépendantes (avec doublons) et sont indiqués en moyenne et SD. Les données ont été analysées par ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Tukey ****p < 0,0001, p > 0,05 ns.

Détermination du rôle de la properdine dans la promotion des dommages induits par le complément des globules rouges et des cellules endothéliales dans le SHUa in vitro

L'inhibition de Properdin empêche la lyse des érythrocytes de mouton (ES) Dans une condition 𠇊HUS-Like”

L'AHUS est une autre maladie de dérégulation du complément caractérisée par une hémolyse, qui s'explique traditionnellement par une hémolyse mécanique résultant du passage des globules rouges à travers une microvascularisation rétrécie en raison de la formation de microthrombus, et par une lyse médiée par le complément en raison d'un manque de régulation du complément sur les globules rouges [examiné dans (69)]. Étant donné que les mutations dans les domaines 19 et 20 du facteur H sont fortement associées au SHUa (7), nous avons utilisé la protéine recombinante rH19-20 qui inhibe de manière compétitive la protection de la surface cellulaire médiée par le facteur H sur E.S, qui sont normalement résistants à l'AP, entraînant la lyse des globules rouges. L'incapacité du facteur H à se lier à la surface des globules rouges (pour la protéger) imite ce qui se passe lorsque les patients atteints de SHUa présentent des mutations dans l'extrémité C-terminale du facteur H (56).

En utilisant le in vitro test, la capacité d'inhibition de la properdine à réduire l'activité de l'AP (médiée par l'absence de protection du facteur H) a été testée et comparée à l'inhibition d'autres composants du complément (inhibiteurs répertoriés sur la figure 2). Chaque inhibiteur du complément a été ajouté à des concentrations croissantes à l'ES cellules en présence de NHS et rH19-20, et l'IC90 pour chaque inhibiteur a été déterminé (Figures 7A𠄿). Les données de la figure 7G indiquent que les MoAbs anti-properdine 6E11A4 et 3A3E1 ont donné IC90 valeurs comprises entre 34 et 45 nM, et le blocage de la properdine à l'aide d'AcMo anti-properdine avait un IC 3 fois inférieur90 valeurs d'inhibition de la lyse médiée par AP des globules rouges 𠇊HUS-like” que les autres inhibiteurs du complément testés (IC90: Facteur B = 416 nM éculizumab = 107 nM OmCI = 252 nM Cp20 = 3 174 nM). Les ratios cible/inhibiteur pour les AcMo anti-properdine étaient de 7,4 (pour la properdine monomérique non illustré) ou de 2,5 (pour P3, la forme prédominante dans le plasma), pour l'anti-facteur B était de 5,2, pour la Cp20 était de 2,4, pour l'eculizumab était de 3,9 et pour l'OmCI était de 1,7 (Figure 7H), indiquant que l'inhibition des trimères de properdine était aussi efficace que le blocage de C5 et moins efficace que de bloquer le facteur B.

Figure 7. Efficacité de l'inhibition de la properdine par rapport à d'autres inhibiteurs du complément sur la prévention de la lyse des érythrocytes de mouton (ES) dans une condition de type 𠇊HUS”. (A𠄿) Détermination du CI90 valeurs des inhibiteurs du complément sur la prévention de la lyse des érythrocytes de mouton 𠇊HUS-like” (ES), et les données sont présentées sous forme de moyenne et d'écart-type d'observations en double. ES ont été mélangés avec les réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : 40 % de NHS, 1,7 μM rH19-20, 5 mM de MgEGTA ou 10 mM d'EDTA et l'un des inhibiteurs du complément 6E11A4 (UNE), 3A3E1 (B), anti-facteur B (C), Cp20 (RÉ), éculizumab (E), et OmCI (F) aux concentrations indiquées dans les graphiques. Le % relatif d'hémolyse et IC90 de chaque inhibiteur a été déterminé comme décrit dans “Merials and Methods” et la ligne pointillée est l'endroit où l'inhibition atteint 90 %. Le CI90 valeurs obtenues comme dans (A𠄿) ont été tracés dans (G) et sont combinés à partir de plus de trois expériences indépendantes avec des doublons pour chaque inhibiteur et sont représentés par la moyenne et l'écart-type. CI90 valeurs dans (G) ont été divisés par la concentration plasmatique (nM) de chaque inhibiteur pour évaluer le rapport cible/inhibiteur dans (H). Properdin a été considéré comme un trimère pour le calcul. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey ****p < 0,0001, ***p < 0,005, **p < 0.01, p > 0,05 ns.

L'inhibition de la properdine réduit l'activation du complément sur les cellules endothéliales exposées à l'hème

Les lésions endothéliales sont une autre caractéristique typique des patients atteints de SHUa. Le développement du SHUa pourrait être déclenché par une agression des cellules endothéliales et favorisé par une régulation anormale du complément. Dans des conditions normales, l'hémoglobine et l'hème libérés lors de l'hémolyse sont récupérés par l'haptoglobine et l'hémopexine, respectivement. Cependant, l'hème acellulaire peut être trouvé à des concentrations élevées dans divers troubles caractérisés par une hémolyse excessive (70, 71) et peut activer l'AP du complément à la surface des cellules endothéliales, favorisant le dépôt de C3b et la formation de MAC, ainsi qu'induire Génération de C3a et C5a dans la phase fluide du sang (66). Ces produits d'activation du complément ont le potentiel de promouvoir un statut pro-thrombotique [examiné dans (72, 73)]. Un in vitro Le test endothélial (66) a été adapté à notre étude pour évaluer si la properdine module l'activation du complément induite par l'hème sur les cellules endothéliales primaires humaines, via la mesure des dépôts de produits d'activation C3. La figure 8A montre que l'hème a induit un dépôt de C3b 5 à 15 fois plus élevé sur les HUVEC, par rapport au NHS seul, et l'activation a été inhibée à 60 % par l'inhibiteur de C3 Cp20. L'inhibition de l'activité du complément par Cp20 était complète comme déterminé par comparaison à un contrôle EDTA 20 mM, où l'inhibition était également de 60 % (figure 8B). Le sérum appauvri en facteur B, qui manque d'activité AP, a réduit le dépôt de fragment C3 à un niveau similaire à celui de l'utilisation de Cp20 (figure 8A), tandis que l'ajout de facteur B au sérum appauvri en facteur B a restauré le dépôt de fragment C3 induit par l'hème à un niveau similaire niveau comme NHS (figure 8A), indiquant que l'activation du complément induite par l'hème est dépendante de l'AP, comme décrit précédemment par d'autres (66).

Figure 8. L'inhibition de la properdine protège les cellules endothéliales de l'activation du complément induite par l'hème. (UN B) L'activation du complément sur les cellules endothéliales traitées par l'hème dépend de la voie alternative. Les HUVEC ont été stimulées avec du milieu M199 ou 100 &# d'hémine, lavées et incubées avec du NHS ou du sérum appauvri en facteur B (FB-dpl) (15% final), en présence ou en absence de Cp20 (50 &# μM) ou d'EDTA (20 mm). 54 nM de facteur B (FB) ont été utilisés pour restaurer l'activité sérique appauvrie en facteur B. (C) L'anticorps anti-properdine MoAb protège les HUVEC traités par l'hème du dépôt de fragments C3. Les HUVEC ont été stimulées avec 100 μM d'hémine (ou M199), NHS (33% final) et l'un des réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : Cp20 (50 μM), peptide de contrôle Compstatine (𠇌p20 Control,& #x0201D 50 μM), anti-properdine MoAb 6E11A4 (80 nM), contrôle isotypique IgG1 (80 nM), eculizumab (53 nM ou 80 nM) ou SALO (5 μM). (A𠄼) Le dépôt de C3 (GMFI) a été déterminé comme décrit dans “Mateerials and Methods” et la 𠇏old difference” a été calculée en divisant le GMFI de chaque groupe par le GMFI du groupe NHS seul. (UNE) est une combinaison de quatre expériences indépendantes (chacune avec des doublons), (AVANT JC) sont représentatifs de quatre et deux expériences indépendantes, respectivement, avec des doublons. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey. ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0.01, *p < 0,05, p > 0,05 ns. L'analyse statistique entre le groupe NHS+heme et chaque groupe inhibiteur est présentée dans (C).

Le blocage de la properdine à l'aide de l'anticorps anti-properdine MoAb 6E11A4 a significativement inhibé de 40 % le dépôt de fragments C3 sur les HUVEC traités par l'hème et l'éculizumab n'a pas réduit le dépôt de fragments C3 (figure 8C) par rapport au groupe NHS® seul. De plus, SALO, un inhibiteur de la voie classique (61), n'a pas inhibé le dépôt de fragments C3 sur les HUVEC traitées au NHS (Figure 8C), indiquant que la voie classique ne contribue pas à l'activation du complément sur les cellules endothéliales exposées à l'hème, confirmant Données de la figure 8A. Dans l'ensemble, les données indiquent que l'inhibition de la fonction properdine réduit significativement l'activation du complément induite par l'hème sur les cellules endothéliales.

Standardisation d'un test de dépôt de C3b de type aHUS sur des cellules endothéliales humaines à l'aide de mutants hème et rH19-20 aHUS

Les mutations liées à l'AHUS dans l'extrémité C-terminale du facteur H affectent sa fonction de surface cellulaire et provoquent des événements pathologiques sur les globules rouges (57), les plaquettes (18), les neutrophiles (18) et les cellules endothéliales (74&# x0201376). Nous avons donc cherché à établir une condition 𠇊HUS-like” sur les cellules endothéliales où la protection du facteur H est altérée et l'hème est présent. Pour cela, nous avons évalué comment les mutations liées au SHUa dans le domaine du facteur H 19-20 affectent l'activation du complément sur les cellules endothéliales lorsqu'elles sont exposées au NHS uniquement, par rapport au rH19-20 de type sauvage. L'exposition des cellules endothéliales au rH19-20 de type sauvage a augmenté le dépôt de fragments C3 de 7 à 11 fois par rapport au NHS seul (figures 9A & 02013C). Quatre constructions rH19-20 contenant des mutations ont été testées. Ces mutations ont une capacité fortement altérée (R1215Q et W1183L), intermédiairement altérée (L1189R) ou légèrement altérée (T1184R) de rivaliser avec le facteur H et d'induire l'activation du complément sur les surfaces des plaquettes, des neutrophiles et des cellules endothéliales, par rapport au rH19-20 de type sauvage. (18, 57, 76). R1215Q et W1183L ont complètement perdu leur capacité à entrer en compétition avec le facteur H, ce qui n'a entraîné aucune augmentation du dépôt de fragments C3 par rapport au NHS seul (figure 9A). L1189R était altérée de 40 % dans sa capacité à induire un dépôt de C3 par rapport au rH19-20 de type sauvage (figure 9B). T1184R n'a pas été altérée dans sa capacité à induire l'activation du complément (figure 9C), et a augmenté le dépôt de C3 de 2 fois par rapport au rH19-20 de type sauvage, en accord avec notre observation précédente sur les plaquettes (18). Étant donné que l'hémolyse excessive est l'une des caractéristiques du SHUa, nous avons ensuite ajouté l'hème, en plus du type sauvage ou des mutants NHS et rH19-20, comme moyen d'établir un SHUa de type in vitro essai. Les figures 9D&# x02013F montrent que l'exposition de l'hème seul aux cellules endothéliales a augmenté l'activation du complément 6� par rapport au NHS, comme observé dans la figure 8. L'ajout de rH19-20 a considérablement amélioré l'activation du complément induite par l'hème de 2𠄳 fois (Figures 9D𠄿). La figure 9D montre que les mutations fortement altérées (R1215Q et W1183L) avaient une tendance d'altération similaire à celle en l'absence d'hème (figure 9A). Le mutant L1189R n'était plus altéré de manière intermédiaire, car il induisait le même niveau de dépôt de C3 que le rH19-20 de type sauvage, en présence d'hème (figure 9E). Le mutant légèrement altéré T1184R a induit 2 fois plus de dépôt de C3 par rapport au rH19-20 de type sauvage en présence d'hème (figure 9F), comparable à celui observé en l'absence d'hème (figure 9C). Collectivement, la figure 9 montre que le manque de protection de la surface cellulaire du facteur H a conduit à l'activation du complément sur les cellules endothéliales et la pré-exposition à l'hème a considérablement exacerbé l'activation du complément lorsque les cellules endothéliales ne sont pas protégées par le facteur H. De plus, ce dépôt C3b de type aHUS Le test a permis de détecter des différences entre le niveau d'altération entre les mutants rH19-20 testés, similaires à ce que nous avons observé précédemment pour les globules rouges, les neutrophiles et les plaquettes (18, 57).

Figure 9. Les mutants RH19-20 ont divers effets par rapport au rH19-20 de type sauvage en affectant l'activation du complément sur les cellules endothéliales en présence ou en l'absence d'hème. (A𠄿) Les HUVEC ont été stimulées avec de l'hémine M199 ou 100 μM, lavées et incubées avec du NHS (33% final) avec ou sans rH19-20 (10 μM) ou des mutants liés à l'aHUS (R1215Q, W1183L, L1189R ou T1184R, 10 & #x003BCM). Le dépôt de C3 (GMFI) a été déterminé comme décrit dans “Matériaux et méthodes.” Les résultats représentatifs sont indiqués sous la forme 𠇏old difference” et représentés graphiquement comme la moyenne et l'écart-type des doublons. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0.01, *p < 0,05, p > 0,05 ns.

L'inhibition de la properdine réduit l'activation du complément sur les cellules endothéliales exposées à l'hème qui manquent de protection contre le facteur H

Enfin, nous avons cherché à déterminer si la properdine contribue à l'activation du complément induite par l'hème sur les cellules endothéliales dépourvues de protection du facteur H (en tant que modèle pour le SHUa).La figure 10 (côté gauche) montre que l'hème a induit un dépôt de fragment C3 de 7 fois, par rapport au NHS seul. Le MoAb anti-properdine et le Cp20 ont inhibé le dépôt de C3 induit par l'hème de 30 et 60 %, respectivement, en accord avec la figure 8C. L'incubation des HUVEC avec rH19-20 a augmenté le dépôt de fragments C3 de 12 fois par rapport au NHS seul (Figure 10, centre) et le blocage de la properdine, dans ce cas, a complètement éliminé le dépôt de fragments C3 médié par rH19-20 (Figure 10, centre ). Le blocage de C3 (Cp20) a également entraîné une inhibition complète du dépôt de C3 (figure 10, centre). L'augmentation des dépôts de C3 médiée par l'hème ou le rH19-20 a été encore augmentée de plus de 4 fois lorsque les HUVEC ont été traités à la fois avec l'hème et le rH19-20 (Figure 10, côté droit), et cette augmentation a été considérablement atténuée de 繵% par blocage de la properdine ou du clivage C3 (Figure 10, côté droit).

Figure 10. L'inhibition de la properdine réduit l'activation du complément sur les cellules endothéliales exposées à l'hème qui manquent de protection du facteur H. Les HUVEC ont été stimulées avec de l'hémine M199 ou 100 μM, lavées et incubées avec du NHS (33% final) en présence ou en l'absence des réactifs suivants aux concentrations finales indiquées : rH19-20 (10 μM), Cp20 (50 & #x003BCM), anti-properdine MoAb 6E11A4 (53 nM) ou contrôle isotypique IgG1 (53 nM). Le dépôt de C3 (GMFI) a été déterminé comme décrit dans “Merials and Methods” et les résultats représentatifs sont représentés sous la forme de la moyenne et de l'écart-type des doublons pour chaque groupe par rapport à “NHS seul” (valeur attribuée de 1 ligne pointillée) et illustrés comme 𠇏old différence.” Les données ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey'S****p < 0,0001, **p < 0.01, *p < 0,05, p > 0,05 ns.


Système de complément en immunité adaptative : régulation des lymphocytes B et immunité humorale

Les fonctions susmentionnées du système du complément, l'oposonisation, la lyse et la génération de la réponse inflammatoire par le biais de médiateurs solubles, sont paradigmatiques et représentent une composante bien caractérisée d'une défense innée de l'hôte. Il est devenu de plus en plus apprécié que les fonctions du complément dans la défense de l'hôte s'étendent au-delà des réponses immunitaires innées. La découverte que les lymphocytes B se liaient à C3 a soulevé la question dès les années 1970 de savoir si le système du complément était impliqué dans les réponses immunitaires adaptatives 84 . Des travaux ultérieurs ont démontré que l'épuisement de C3 altère les réponses immunitaires humorales et ont fourni des preuves directes que des réponses adaptatives efficaces dépendaient d'un système du complément intact dans certains cas 85 . Une étude plus approfondie chez des animaux porteurs de carences en complément naturel a impliqué la voie classique comme mécanisme crucial pour le piégeage et la rétention efficaces des antigènes dans les tissus lymphoïdes (par exemple, les follicules spléniques), suggérant qu'une fonction majeure du système du complément était de localiser les antigènes étrangers dans des sites immunitaires importants. pour les réponses des lymphocytes 86, 87, 88 .

Le bras humoral de la réponse immunitaire adaptative est chargé de protéger les espaces extracellulaires par la génération de cellules B effectrices et mémoires, et d'anticorps produits par les cellules B, conduisant à la neutralisation et à l'opsonisation de l'agent pathogène et fournissant une mémoire immunologique contre la réinfection. La puissance de cette réponse découle d'une interaction complexe de mécanismes immunitaires, subordonnée à la force des stimuli antigéniques et à la présence d'une assistance des lymphocytes T auxiliaires, parmi de nombreux autres facteurs 2 . Les effecteurs du complément sont impliqués dans l'immunité humorale à plusieurs stades de la différenciation des cellules B et peuvent influencer la biologie des cellules B à plusieurs niveaux 89, 90 . Comme mentionné précédemment, le complément améliore l'immunité des cellules B principalement par le biais des CR, CR1 (CD35) et CR2 (CD21), exprimés sur les lymphocytes B et les cellules dendritiques folliculaires (FDC), et se liant aux opsonines du complément dans un effort concerté avec le phagocytaire. système 75, 90, 91 . CR2 forme un complexe récepteur avec la protéine de signalisation CD19 et la protéine tétraspan CD81 pour former le complexe corécepteur des cellules B (CD21-CD19-CD81), qui prend en charge un signal amélioré via le récepteur des cellules B (BCR, par exemple, immunoglobuline de surface) lorsque il rencontre un antigène recouvert d'opsonines du complément (par exemple, C3d), ​​entraînant la réduction du seuil d'activation des cellules B de plusieurs ordres de grandeur 92, 93 . Ainsi, le complément peut être considéré comme un « adjuvant naturel » et comme un instructeur de la réponse immunitaire humorale 94 .

La conséquence fonctionnelle de cette modulation de la signalisation des cellules B peut être observée dans de multiples contextes. Les cellules B expriment d'abord le corécepteur CD21-CD19-CD81 lorsqu'elles migrent de la moelle osseuse vers la périphérie, généralement appelée étape de transition qui a des implications importantes dans l'élimination des cellules B autoréactives et dans la sélection positive des cellules B1. 95 . Les cellules B1, qui sont les principales sources d'anticorps naturels avec des répertoires fortement biaisés vers les antigènes conservés (par exemple, les antigènes nucléaires), sont une population de cellules B à longue durée de vie et physiologiquement distincte 2 . Le complément semble fonctionner dans la sélection et le maintien des cellules B1, car les souris déficientes en CR2 ont un répertoire altéré d'anticorps naturels, ce qui peut être observé par une réduction marquée des lésions après ischémie/reperfusion malgré des niveaux normaux d'IgM 96, 97. Ces souris ont également un nombre réduit de cellules B1a et présentent une production généralisée d'anticorps altérée 98 .

En plus de moduler l'activité B1 et la production d'anticorps naturels, la réticulation du complexe de corécepteurs CD21-CD19-CD81 avec BCR améliore également l'immunité des cellules B dans les étapes ultérieures de la différenciation des cellules B. Le couplage de C3d à un antigène de faible affinité, qui (s'il n'était pas couplé) entraînerait la mort des cellules B, entraîne non seulement la survie, mais également l'activation des cellules B et la production d'anticorps, suggérant un rôle du complément dans «l'instruction» des cellules B naïves en périphérie 99 . De même, l'activation des cellules B périphériques et folliculaires matures par l'antigène opsonisé par le complément conduit à leur migration vers la limite lymphoïde T:cellule B, où les cellules T auxiliaires fournissent une costimulation via CD40, conduisant à l'activation et à l'expansion des cellules B. Par la suite, les cellules B activées initient la formation de centres germinatifs (GC), où les CR sur les cellules B améliorent la signalisation BCR, conduisant à une différenciation efficace en cellules B plasmatiques et mémoire 89, 90. Ceci est soutenu par l'observation que les cellules B spécifiques de l'antigène dépourvues de CR1/CR2 ne parviennent pas à survivre dans un GC lorsqu'elles sont mises en compétition avec les cellules B WT, insinuant que la signalisation des corécepteurs est vitale pour la sélection clonale des cellules B et en l'absence de ce complément. -cosignalisation assistée, les cellules B n'entrent pas en compétition et subissent la mort cellulaire 100 . Les FDC sont au cœur de ce processus car ce sont des cellules stromales spécialisées qui sécrètent le chimiotactique des lymphocytes B, aident à organiser les GC et fournissent des moyens efficaces de piéger et de retenir l'antigène dans les follicules des cellules B et de les afficher aux cellules B naïves et GC 101 . Les FDC expriment des niveaux relativement élevés de CR1 et CR2 et retiennent efficacement les complexes immuns recouverts de C3 dans les follicules lymphoïdes, favorisant la sélection antigénique des cellules GC B de haute affinité 92 . En outre, les cellules B post-GC nécessitent un complément sur les FDC pour un maintien efficace des cellules B à mémoire à long terme, la maturation de l'affinité et des réponses de rappel efficaces 102 .

En plus des CR, CR1 et CR2, certaines preuves suggèrent un rôle des anaphylatoxines dans la modulation de la biologie des cellules B. Il a été rapporté que les cellules B expriment C3aR et les deux ligands, C3a et C3adesArg, se sont avérés réguler négativement la réponse immunitaire polyclonale, ainsi que limiter la sécrétion de TNF-α et d'IL-6 103, 104 . Inversement, il a été rapporté que C5a jouait un rôle dans le trafic et la migration de diverses populations de cellules B, y compris les cellules GC B et la mémoire amygdalienne et les cellules B naïves 105, 106, 107.

Les rôles du complément dans l'immunité humorale peuvent être illustrés par la caractérisation de souris présentant des déficiences à la fois en composants du complément et en CR 90 . Des études ont démontré l'importance d'une voie classique du complément intact (C1q, C3 ou C4) dans la réponse humorale aux antigènes thymo-dépendants et thymus-indépendants 108 . Dans de nombreux cas, les souris déficientes en CR1/2 (un seul gène Cr1/2 code pour les deux protéines chez la souris) présentent une altération similaire, suggérant que les réponses pro-humorales sont médiées par ces récepteurs 89 . Par exemple, les souris déficientes en CR1/2 et C3 présentaient des taux d'IgM (et d'IgG) nettement réduits, un échec du changement d'isotype en IgG et une diminution de l'absorption d'antigène en réponse aux antigènes polysaccharidiques de type II T-indépendants 109, 110. Des résultats similaires ont été établis pour les antigènes T-dépendants, tels que l'hémocyanine de patelle et le bactériophage ΦX174, ainsi que pour les agents pathogènes viraux et bactériens, tels que le virus de l'herpès simplex, le virus du Nil occidental et Streptococcus pneumoniae 98, 111, 112, 113, 114. Ces études et d'autres mettent en évidence le rôle essentiel que joue le complément dans la génération d'une réponse immunitaire robuste à plusieurs niveaux de la biologie des cellules B.


Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d'intérêt potentiel.

1. Merle NS, Church SE, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT. Système de complément Partie I - Mécanismes moléculaires d'activation et de régulation. Immunol avant (2015) 6:262. doi:ꀐ.3389/fimmu.2015.00262

2. Merle NS, Noe R, Halbwachs-Mecarelli L, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT. Système de complément Partie II : Rôle dans l'immunité. Immunol avant (2015) 6:257. doi:ꀐ.3389/fimmu.2015.00257

3. Lambris JD, Ricklin D, Geisbrecht BV. Compléter l'évasion par les agents pathogènes humains. Nat Rev Microbiol (2008) 6(2):132&# x201342. doi:ꀐ.1038/nrmicro1824

4. Stoiber H, Pruenster M, Ammann CG, Dierich MP. VIH opsonisé par le complément : le passager clandestin sur la voie de l'infection. Mol Immunol (2005) 42(2):153�. doi:ꀐ.1016/j.molimm.2004.06.024

5. Dittmer U, Sutter K, Kassiotis G, Zelinskyy G, Báxe1nki Z, Stoiber H, et al. Les études sur les rétrovirus Friend révèlent des interactions complexes entre l'immunité intrinsèque, innée et adaptative. FEMS Microbiol Rev (2019) 43(5):435�. doi:ꀐ.1093/femsre/fuz012

6. Rosengard AM, Liu Y, Nie Z, Jimenez R. Conception d'évasion immunitaire du virus de la variole : expression d'un inhibiteur hautement efficace du complément humain. Proc Natl Acad Sci (2002) 99(13):8808�. doi:ꀐ.1073/pnas.112220499

7. Sfyroera G, Katragadda M, Morikis D, Isaacs SN, Lambris JD. La Modélisation électrostatique Prédit Les Activités Des Orthopoxvirus Complément Control Proteins. J Immunol (2005) 174(4):2143�. doi:ꀐ.4049/jimmunol.174.4.2143

8. Mullick J, Bernet J, Singh AK, Lambris JD, Sahu A. Kaposi&# x2019s Sarcome-Associated Herpesvirus (Human Herpesvirus 8) La protéine du cadre de lecture ouvert 4 (Kaposica) est un homologue fonctionnel des protéines de contrôle du complément. J Virol (2003) 77(6):3878�. doi:ꀐ.1128/JVI.77.6.3878-3881.2003

9. Conde JN, Silva EM, Barbosa AS, Mohana-Borges R. Le système de complément dans les infections à Flavivirus. Microbiol avant (2017) 8(213). doi:ꀐ.3389/fmicb.2017.00213

10. Avirutnan P, Mehlhop E, Diamond MS. Le complément et son rôle dans la protection et la pathogenèse des infections à flavivirus. Vaccin (2008) 26(Suppl 8):I100𠄷. doi:ꀐ.1016/j.vaccine.2008.11.061

11. Ejaz A, Steinmann E, Báxe1nki Z, Anggakusuma, Khalid S, Lengauer S, et al. Acquisition spécifique de CD59 fonctionnel mais pas de CD46 ou CD55 par le virus de l'hépatite C. PloS Un (2012) 7(9) : e45770. doi:ꀐ.1371/journal.pone.0045770

12. Lindenbach BD, Rice CM. Biologie moléculaire des flavivirus. Résolution antivirus avancée (2003) 59:23�. doi:ꀐ.1016/S0065-3527(03)59002-9

13. Mukhopadhyay S, Kuhn RJ, Rossmann MG. Une perspective structurelle du cycle de vie des flavivirus. Nat Rev Microbiol (2005) 3(1):13�. doi:ꀐ.1038/nrmicro1067

14. Fontes-Garfias CR, Shan C, Luo H, Muruato AE, Medeiros DBA, Mays E, et al. Analyse fonctionnelle de la glycosylation de la protéine d'enveloppe du virus Zika. Représentant de cellule (2017) 21(5):1180�. doi:ꀐ.1016/j.celrep.2017.10.016

15. Agrelli A, de Moura RR, Crovella S, Brandao LAC. Mécanismes d'entrée du virus ZIKA dans les cellules humaines. Infecter Genet Evol J Mol Epidemiol Evolution Genet Infecter Dis (2019) 69:22𠄹. doi:ꀐ.1016/j.meegid.2019.01.018

16. Milis L, Morris CA, Sheehan MC, Charlesworth JA, Pussell BA. Inhibition du complément médiée par la vitronectine : preuves de différents sites de liaison pour C5b-7 et C9. Clin Exp Immunol (1993) 92(1):114&# x20139. doi:ꀐ.1111/j.1365-2249.1993.tb05956.x

17. Prasada RT, Lakshmi PT, Parvathy R, Murugavel S, Karuna D, Paritosh J. Identification du deuxième motif arginine-glycine-acide aspartique de la vitronectine ovine comme site de liaison du complément C9 et son implication dans l'infection bactérienne. Microbiol Immunol (2017) 61(2):75�. doi:ꀐ.1111/1348-0421.12468

18. Conde JN, da Silva EM, Allonso D, Coelho DR, Andrade IDS, de Medeiros LN, et al. Inhibition du complexe d'attaque membranaire par le virus de la dengue NS1 par interaction avec la vitronectine et les protéines du complément terminal. J Virol (2016) 90(21):9570�. doi:ꀐ.1128/JVI.00912-16

19. Amet T, Ghabril M, Chalasani N, Byrd D, Hu N, Grantham A, et al. L'incorporation de CD59 protège le virus de l'hépatite C contre la destruction médiée par le complément. Hépatol (Baltimore Md) (2012) 55(2):354�. doi:ꀐ.1002/hep.24686

20. Orren A, O’Hara AM, Morgan BP, Moran AP, Würzner R. Une protéine C9 anormale mais fonctionnellement active du composant du complément trouvée dans une famille irlandaise avec un déficit subtotal en C9. Immunologie (2003) 108(3):384�. doi:ꀐ.1046/j.1365-2567.2003.01587.x

21. Schiela B, Bernklau S, Malekshahi Z, Deutschmann D, Koske I, Banki Z, et al. Le complément humain actif réduit la charge virale Zika via la formation du complexe membranaire-attaque. Immunol avant (2018) 9:2177. doi:ꀐ.3389/fimmu.2018.02177

22. Zhang Z, Yang J, Wei J, Yang Y, Chen X, Zhao X, et al. La paramyosine de Trichinella spiralis se lie à C8 et C9 et protège le nématode tissulaire contre les attaques du complément de l'hôte. PloS Négligé Trop Dis (2011) 5(7) : e1225. doi:ꀐ.1371/journal.pntd.0001225

23. Sheehan M, Morris CA, Pussell BA, Charlesworth JA. L'inhibition du complément par la vitronectine humaine implique des domaines de liaison non à l'héparine. Clin Exp Immunol (1995) 101(1):136�. doi:ꀐ.1111/j.1365-2249.1995.tb02289.x

24. Huang YP, Cheng J, Zhang SL, Wang L, Guo J, Liu Y, et al. Criblage des protéines des hépatocytes se liant à la protéine F du virus de l'hépatite C par un système à deux hybrides de levure. Monde J Gastroentérol (2005) 11(36):5659&# x201365. doi:ꀐ.3748/wjg.v11.i36.5659

25. Chung KM, Liszewski MK, Nybakken G, Davis AE, Townsend RR, Fremont DH, et al. La protéine non structurale NS1 du virus du Nil occidental inhibe l'activation du complément en se liant au facteur protéique régulateur H. Proc Natl Acad Sci (2006) 103(50):19111𠄶. doi:ꀐ.1073/pnas.0605668103

26. Avirutnan P, Fuchs A, Hauhart RE, Somnuke P, Youn S, Diamond MS, et al. Antagonisme du composant du complément C4 par la protéine non structurale du flavivirus NS1. J Exp Med (2010) 207(4):793�. doi:ꀐ.1084/jem.20092545

27. Avirutnan P, Hauhart RE, Somnuke P, Blom AM, Diamond MS, Atkinson JP. La liaison de la protéine non structurale du Flavivirus NS1 à la protéine de liaison C4b module l'activation du complément. J Immunol (2011) 187(1):424�. doi:ꀐ.4049/jimmunol.1100750

28. Kurosu T, Chaichana P, Yamate M, Anantapreecha S, Ikuta K. La protéine régulatrice du complément sécrété, la clusterine interagit avec la protéine non structurelle 1 du virus de la dengue. Biochem Biophys Res Commun (2007) 362(4):1051𠄶. doi:ꀐ.1016/j.bbrc.2007.08.137

29. Figueiredo CP, Barros-Aragó FGQ, Neris RLS, Frost PS, Soares C, Souza INO, et al. Le virus Zika se réplique dans le tissu cérébral humain adulte et altère les synapses et la mémoire chez la souris. Nat Commun (2019) 10(1):3890. doi:ꀐ.1038/s41467-019-11866-7

Mots clés : complément, lyse, complexe d'attaque membranaire, virus Zika, protéine d'enveloppe, voie terminale du complément

Citation : Malekshahi Z, Schiela B, Bernklau S, Banki Z, Würzner R et Stoiber H (2020) Interférence de la protéine électronique du virus Zika avec le complexe d'attaque membranaire du système du complément. Devant. Immunol. 11:569549. doi: 10.3389/fimmu.2020.569549

Reçu : 11 juin 2020 Accepté : 05 octobre 2020
Publication : 28 octobre 2020.

Zvi Fishelson, Université de Tel Aviv, Israël

Kenneth Reid, Université d'Oxford, Royaume-Uni
Horea Rus, Université du Maryland, Baltimore, États-Unis

Copyright © 2020 Malekshahi, Schiela, Bernklau, Banki, Würzner et Stoiber. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution License (CC BY). L'utilisation, la distribution ou la reproduction dans d'autres forums est autorisée, à condition que le ou les auteurs originaux et le ou les titulaires des droits d'auteur soient crédités et que la publication originale dans cette revue soit citée, conformément aux pratiques académiques acceptées. Aucune utilisation, distribution ou reproduction non conforme à ces conditions n'est autorisée.


Pourquoi la lyse des érythrocytes de mouton est-elle considérée comme une voie classique d'activation du complément, et le lapin comme une alternative ? - La biologie

Vous avez demandé une traduction automatique d'un contenu sélectionné dans nos bases de données. Cette fonctionnalité est fournie uniquement pour votre commodité et n'est en aucun cas destinée à remplacer la traduction humaine. Ni BioOne ni les propriétaires et éditeurs du contenu ne font, et ils déclinent explicitement, toute représentation ou garantie expresse ou implicite de quelque nature que ce soit, y compris, sans s'y limiter, les représentations et garanties quant à la fonctionnalité de la fonction de traduction ou l'exactitude ou l'exhaustivité de les traductions.

Les traductions ne sont pas conservées dans notre système. Votre utilisation de cette fonctionnalité et des traductions est soumise à toutes les restrictions d'utilisation contenues dans les Conditions d'utilisation du site Web BioOne.

UNE ÉTUDE COMPARATIVE DE LA VOIE ALTERNATIVE DES MAMMIFÈRES ET DES REPTILIENS DE MORT PAR LE COMPLÉMENT DE LA MALADIE DE LYME SPIROCHETE (BORRELIA BURGDORFERI)

May M. Kuo, 1 Robert S. Lane, 1 Patricia C. Giclas 1,*

1 Département des sciences, politiques et gestion de l'environnement, Division de la biologie des insectes, Université o

* *Centre national juif de médecine et de recherche, Complement Laboratory, Denver, Colorado 80206.

Comprend PDF et HTML, lorsque disponible

Cet article est uniquement disponible pour les abonnés.
Il n'est pas disponible à la vente individuelle.

L'activité bactéricide potentielle de la voie alternative du complément des sérums de mammifères et de reptiles pour Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.) a été évalué in vitro. Une mort induite par le complément a été observée lorsque des spirochètes cultivés ont été inoculés dans des sérums de lézard de clôture ouest (Sceloporus occidentalis) et du lézard-alligator du sud (Elgaria multicarinata), mais pas lorsqu'ils ont été inoculés dans du sérum de souris sylvestre (Peromyscus maniculatus) ou des humains. Les spirochètes étaient encore en vie après 4 heures dans du sérum de lézard qui avait été préchauffé à 56 C pendant 30 minutes pour inactiver le complément. De plus, lorsque le sérum de lézard a été chélaté avec 10 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique pour bloquer toute activation du complément, l'activité borréliacide a été arrêtée. Lorsque le sérum de lézard a été chélaté avec 10 mM d'éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique plus 4 mM de MgCl2 pour bloquer uniquement l'activation de la voie du complément classique, >85% des spirochètes ont été immobilisés en 1 heure. Différences dans B. burgdorferi s.s. la mortalité n'a pas été observée lorsque les chélateurs avec ou sans MgCl2 ont été ajoutés au sérum de souris sylvestres ou d'humains. Les protéines de la voie alternative du complément sont responsables de l'activité borréliacide observée dans le sang des S. occidentalis et E. multicarinata.

May M. Kuo , Robert S. Lane et Patricia C. Giclas « UNE ÉTUDE COMPARATIVE DE LA VOIE ALTERNATIVE DES MAMMIFÈRES ET DES REPTILIENS POUR L'ASSAINISSEMENT PAR LE COMPLÉMENT DU SPIROCHETE DE LA MALADIE DE LYME (BORRELIA BURGDORFERI)," Journal of Parasitology 86 (6), 1223-1228, (1er décembre 2000). https://doi.org/10.1645/0022-3395(2000)086[1223:ACSOMA]2.0.CO2

Reçu : 1er novembre 1999 Accepté : 1er avril 2000 Publié : 1er décembre 2000


Renseignements à l'appui

S1 Fig. L'interaction de BBK32 avec C1r est dépendante du calcium.

Comme cela a été observé pour le complexe C1, l'interaction de C1r avec (A) BBK32-FL pleine longueur ou (B) BBK32-C dépend fortement du calcium, tel que jugé par SPR.

S2 Fig. Infectieux B. burgdorferi et l'isogénique bbk32 le mutant se lie à C1 à des niveaux élevés.

Souche ML23/pBBE22luc et le bbk32 dérivé mutant JS315/ pBBE22luc ont été incubés avec Cl immobilisé pour évaluer la liaison. Aucune différence significative n'a été observée dans la liaison pour les deux souches testées. Chaque point de données représente les spirochètes comptés dans un champ indépendant tel que noté par microscopie à fond noir (n = 30 par souche). La barre horizontale représente la valeur moyenne. La signification statistique a été évaluée à l'aide d'un t test. ns non significatif.