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Pouvons-nous appliquer le NGS (séquençage de nouvelle génération) sur de l'ADN extrait de tissus inclus en paraffine fixée au formol (FFPE) ?


Je travaille sur le microbiome et je ne peux utiliser que des tissus fixés au formol et enrobés de paraffine. Est-il possible d'appliquer le NGS (séquençage de nouvelle génération) sur des tissus FFPE (formol fixe paraffine inclus) ? Je suis particulièrement préoccupé par la contamination qui pourrait affecter les résultats.


C'est un peu difficile à dire sur la base de votre question, mais il semble que vous souhaitiez effectuer un séquençage Illumina d'échantillons de tissus FFPE. C'est assez routinier, Illumina vend des kits pour cela.

Je ne sais pas comment le processus FFPE affecte les cellules microbiennes, mais des personnes ont récemment publié sur l'analyse métagénomique d'échantillons de tissus FFPE. Cela me suggère que c'est possible.

Si « toute contamination » est un problème, alors il y a peut-être des obstacles supplémentaires ; la contamination de faible niveau est un problème de routine en métagénomique, qui est exacerbé par des types d'échantillons compliqués, anciens ou à faible intrants. Je suggérerais de le traiter de la même manière que vous traiteriez n'importe quel autre échantillon métagénomique, et d'essayer d'exclure la possibilité de contamination par des méthodes et d'en tenir compte dans l'analyse des données.


Séquençage de l'exome entier (WES) sur le tissu tumoral fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE) dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST)

La technologie de séquençage de nouvelle génération (NGS) a été rapidement introduite dans la recherche fondamentale et translationnelle en oncologie, mais la disponibilité réduite de tissus tumoraux frais congelés (FF) et la mauvaise qualité de l'ADN extrait de l'ADN fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE) a significativement altéré ce processus dans le domaine des tumeurs solides. Pour évaluer si les données générées à partir du matériel FFPE peuvent être produites de manière fiable et potentiellement utilisées dans des contextes cliniques de routine, nous avons effectué un séquençage de l'exome entier (WES) à partir d'échantillons de tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), extraits FF ou FFPE, et à partir d'ADN normal apparié .

Méthodes

Nous avons effectué un enrichissement et un séquençage de l'exome entier à 100 pb en extrémité appariée sur quatre échantillons GIST, soit à partir de tissus FFPE ou fraîchement congelés, et à partir d'ADN normal apparié.

Résultats

L'intégrité de l'ADN extrait de la FFPE a été évaluée par une méthode RAPD PCR modifiée, identifiant ainsi la FFPE de haute qualité (HQ) et de basse qualité (LQ). La production de la bibliothèque d'ADN et la capture de l'exome étaient réalisables pour les deux classes de FFPE, malgré le rendement et la taille d'insert inférieurs du LQ-FFPE. WES a produit des données de qualité égale à partir des échantillons FF et FFPE, tandis que seul HQ-FFPE a fourni une quantité de données comparable aux échantillons FF. L'analyse bioinformatique a montré que le pourcentage de variants appelés à la fois dans les échantillons FF et FFPE était très élevé dans HQ-FFPE, atteignant 94 à 96 % du nombre total de variants appelés. La classification des variants somatiques par type de substitution nucléotidique a montré que HQ-FFPE et FF avaient des profils mutationnels similaires, tandis que les échantillons LQ-FFPE portaient un nombre beaucoup plus élevé de mutations que l'homologue FF, avec un enrichissement significatif des substitutions C > T/G > A . Se concentrer sur les variantes potentielles liées à la maladie a permis la découverte de variantes somatiques supplémentaires dans les échantillons GIST, en dehors de la mutation du conducteur oncogène connue, à la fois du séquençage du matériel FF et FFPE. Les appels faux positifs et faux négatifs étaient présents presque exclusivement dans l'analyse des FFPE de faible qualité. Dans l'ensemble, cette étude a montré que WES est également réalisable sur des échantillons FFPE et qu'il est possible de sélectionner facilement des échantillons FFPE de haute qualité qui donnent des résultats de séquençage comparables à l'homologue FF.

Conclusion

WES sur matériau FFPE peut représenter une source importante et innovante pour la recherche GIST et pour d'autres tumeurs solides, susceptible d'application possible dans la pratique clinique.


L'ADN se dégrade pendant le stockage dans des blocs de tissus fixés au formol et inclus en paraffine

Les blocs de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) sont largement utilisés pour identifier des altérations moléculaires cliniquement exploitables ou effectuer des études moléculaires rétrospectives. Notre objectif était de quantifier la dégradation de l'ADN se produisant pendant le stockage à moyen et long terme d'échantillons dans des conditions habituelles. Nous avons sélectionné 46 échantillons FFPE de carcinomes réséqués chirurgicalement du poumon, du côlon et du tractus urothélial, dont l'ADN avait été préalablement extrait. Nous avons effectué une seconde extraction d'ADN sur les mêmes blocs dans des conditions identiques après une durée médiane de stockage de 5,5 ans. La quantification de l'ADN par fluorimétrie a montré une diminution de 53 % de la quantité d'ADN après stockage. Ciblage par PCR quantitative (qPCR) KRAS l'exon 2 a montré une amplification retardée de l'ADN extrait après stockage dans tous les échantillons sauf un. Le ratio de quantification qPCR/fluorimétrie a diminué de 56 à 15 % après conservation (p < 0,001). Globalement, la proportion restante d'ADN analysable par qPCR ne représentait que 11% de la quantité obtenue lors de la première extraction. La longueur maximale des fragments d'ADN amplifiables évaluée avec une PCR multiplex a été réduite dans l'ADN extrait des tissus stockés, indiquant que la fragmentation de l'ADN avait augmenté dans les blocs de paraffine pendant le stockage. Le séquençage de nouvelle génération a été effectué sur 12 échantillons et a montré une diminution moyenne de 3,3 fois du rendement de la bibliothèque et une augmentation moyenne de 4,5 fois du nombre de variants mononucléotidiques détectés après stockage. En conclusion, nous avons observé une dégradation significative de l'ADN extrait du même bloc FFPE après 4 à 6 ans de stockage. De meilleures stratégies de conservation doivent être envisagées pour le stockage des échantillons de biopsie FFPE.

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MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Échantillons FFPE

Au cours des dernières années, plus de 1 000 échantillons FFPE ont été utilisés pour le NGS à Novogene Bioinformatics (Pékin, Chine) à l'aide du kit SureSelect XT d'Agilent, du kit KAPA Hyper Prep et du kit NEBNext® ChIP-Seq Library Prep, et notre approche améliorée . Les échantillons FFPE contenaient divers tissus cancéreux tels que le carcinome du poumon, le cancer du col de l'utérus, le cancer gastrique, le gliome, le cancer colorectal, le cancer du sein, le carcinome épidermoïde de l'œsophage, le carcinome urothélial, le cancer de la bouche, le carcinome hépatocellulaire, le carcinome du nasopharynx et le cancer du pancréas. Les échantillons de tissus FFPE ont été conservés jusqu'à 10 ans.

Préparation de l'échantillon d'ADN

L'ADN a été obtenu à partir de différents échantillons de tissus FFPE avec cinq lames FFPE pour chaque échantillon en utilisant notre approche améliorée. Le déparaffinage a été effectué en utilisant du xylène. L'ADN génomique a été extrait à l'aide d'un kit ADN TIANamp FFPE (TIANGEN, Chine) selon les instructions des fabricants. La qualité et la quantité de l'ADN génomique extrait ont été déterminées à l'aide d'un fluoromètre Qubit 2.0 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), et la distribution des tailles a été estimée par électrophorèse en utilisant un gel d'agarose à 1 %.

Construction de bibliothèque

L'ADN a été cisaillé acoustiquement dans un microtube Covaris en utilisant le système Covaris S220 (Covaris, Woburn, MA). La taille du pic de l'ADN était de 150 à 200 paires de bases. Les paramètres du processus de cisaillement Covaris (puissance incidente maximale 160 W facteur de service 15 % cycles par salve 200 temps de traitement 200 secondes) ont été modifiés en fonction de la distribution de taille et de la concentration d'ADN dans chaque échantillon. Le profil de fragmentation de l'ADN cisaillé a été à nouveau testé par électrophorèse. Quinze ng d'ADN génomique fragmenté ont été traités pour la réparation finale et la queue A, suivis de la ligature de l'adaptateur et du nettoyage. Le protocole était similaire à la directive du kit KAPA Hyper Prep avec les modifications suivantes : (I) l'échantillon d'ADN a été incubé avec le master mix de ligature pendant 2 heures à 16°C sur un thermocycleur (II) les fragments ligaturés par adaptateur ont été amplifiés avec 10 Cycles de PCR (III) la bibliothèque amplifiée a été purifiée avec un volume égal de billes AMPure XP (Beckman Coulter, Inc., CA) pour filtrer la contamination dimère. La bibliothèque préparée a été hybridée avec des réactifs d'hybridation, des agents bloquants et la bibliothèque de capture conçue comme décrit dans SureSelect QXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library protocols. La plage de tailles de la bibliothèque préparée a été évaluée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 et qualifiée à l'aide d'ABI StepOne Plus. La concentration de chaque bibliothèque a été quantifiée à l'aide d'un kit de quantification de bibliothèque qPCR NGS (KAPA) selon le protocole des fabricants pour calculer le volume de regroupement final pour le séquençage. Les bibliothèques contaminées par des dimères ou de faible qualité seront reconstruites.

Sélection et conception des cibles

Tous les exons de 483 gènes liés au cancer et 88 introns de 14 gènes, qui sont fréquemment réarrangés dans les cellules cancéreuses, ont été sélectionnés. La longueur totale des séquences sélectionnées était de 2,0 Mb. L'ensemble de sondes ARN a été conçu à l'aide de l'outil en ligne fourni par Agilent SureSelect Custom Design (Agilent).

Séquençage des bibliothèques

Les bibliothèques construites ont été réalisées par la stratégie PE75 sur la plate-forme Illumina Nextseq500 de Novogene Inc. (Novogene, Chine). Un script C personnalisé (Metzker, 2010) a été utilisé pour supprimer les séquences adaptatrices Illumina, et les lectures avec des « N » ambigus ou des nucléotides de mauvaise qualité ont été éliminées. Les lectures de séquençage propres ont été mappées sur le génome humain de référence (hg19) à l'aide de BWA-MEM (http://bio-bwa.sourceforge.net/) avec les paramètres "-t 10 et -k 32" (Li et Durbin, 2009) . Les lectures en double PCR ont été détectées à l'aide de Picard (http://picard.sourceforge.net/index.html) et supprimées à l'aide de SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/).

Des variants somatiques à un seul nucléotide (SNV) ont été détectés par MuTect (https://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutect) avec les paramètres par défaut, et des InDels somatiques (insertions et suppressions) ont été détectés par Strelka (https://sites .google.com/site/strelkasomaticvariantcaller/) avec les paramètres "-indel Max Ref Repeat 8, indel Max Window Filtered Basecall Frac 0.3, -indel Max Int Hpol Length 14 et -sindel Quality Lower Bound 30". Pour une évaluation plus approfondie, les candidats fonctionnels SNV et InDels ont été annotés en utilisant le package ANNOVAR (http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/), et le COSMIC (http://cancer.sanger .ac.uk/cosmic) et les bases de données ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).


Foire aux questions sur le séquençage de nouvelle génération

Comment purifier l'ADN génomique pour que le NGS obtienne les meilleurs résultats ?

Plusieurs méthodes de purification de l'ADN génomique sont couramment utilisées avant la préparation de la bibliothèque NGS. Certaines méthodes de préparation de bibliothèques sont plus sensibles que d'autres à la qualité de l'ADN. Cependant, toutes les méthodes de purification devraient produire un ADN exempt de contaminants organiques, tels que le phénol ou l'éthanol. De plus, la solution d'ADN ne doit pas contenir de concentrations d'EDTA supérieures à 1 mM.

Les méthodes à base de résine sont populaires pour purifier l'ADN génomique pour le NGS car elles sont rapides, produisent un ADN de haute qualité et peuvent être automatisées pour traiter un grand nombre d'échantillons simultanément. Les kits de purification d'ADN Promega Maxwell® conviennent aux flux de travail automatisés et sont disponibles dans une variété de formats pour purifier l'ADN génomique à partir de cellules, de tissus et d'échantillons de sang. Pour le traitement manuel des échantillons, Promega propose les kits de purification d'ADN génomique ReliaPrep® et Wizard®.

De combien d'ADN ai-je besoin pour préparer une bibliothèque NGS ?

La quantité d'ADN d'entrée dépend de la méthode de préparation de la bibliothèque NGS, ainsi que du type spécifique d'application NGS. Par exemple, les bibliothèques de séquençage d'ADN génomique Illumina mate-pair nécessitent jusqu'à 10 & ndash20 & microg d'ADN, par rapport au séquençage de chromatine-immunoprécipitation (ChIP-Seq), qui utilise 10 & ndash50ng d'ADN d'entrée (2). Quelle que soit la plate-forme, les méthodes de préparation des bibliothèques NGS peuvent être divisées en deux étapes.

Dans la première étape, l'ADN génomique est divisé en morceaux plus petits pour s'adapter aux longueurs de lecture relativement courtes du NGS. Cette fragmentation peut être accomplie par des techniques mécaniques qui cisaillent l'ADN (telles que la sonication avec les instruments Covaris®, ou la nébulisation à l'aide d'air comprimé). La fragmentation mécanique entraîne généralement des pertes d'ADN substantielles. Par conséquent, les flux de travail de préparation de bibliothèques NGS basés sur des méthodes de fragmentation mécanique nécessitent généralement des quantités plus élevées d'ADN d'entrée, environ 1 & ndash5 & microg. Ils conviennent mieux aux échantillons pour lesquels la quantité d'ADN n'est pas limitative, par exemple les cellules cultivées, les bactéries ou les échantillons de tissus frais/congelés.

En revanche, les méthodes enzymatiques telles que NEB® Fragmentase&trade Enzyme peuvent être utilisées pour limiter les échantillons et mdashDNA à partir de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), de cellules souches ou d'échantillons microdisséqués par capture laser (LCM). Les kits de préparation de bibliothèque d'ADN NEBNext Ultra&trade nécessitent aussi peu que 5 ng d'ADN pour préparer les bibliothèques de séquençage Illumina Les bibliothèques Ion Torrent® nécessitent 100 ng à 1 & microg d'ADN.

Dans la deuxième étape de la préparation de la bibliothèque NGS, les extrémités de l'ADN fragmenté sont réparées (émoussées) à l'aide d'un mélange d'ADN polymérases. Ensuite, des séquences adaptatrices spécifiques sont ligaturées aux extrémités de l'ADN fragmenté. La séquence de ces adaptateurs variera en fonction du système de séquençage utilisé. Dans la plupart des flux de travail, la bibliothèque est ensuite amplifiée par PCR pour enrichir les fragments marqués (ces molécules d'ADN qui ont les séquences adaptatrices appropriées à chaque extrémité) et pour produire suffisamment d'ADN pour le séquençage. Pour les bibliothèques Illumina, des flux de travail sans PCR sont également disponibles pour les situations où il est souhaitable de minimiser le biais d'amplification. Les méthodes sans PCR nécessitent de plus grandes quantités d'ADN d'entrée que les flux de travail de préparation de bibliothèque conventionnels et généralement 1 microg d'ADN pour les bibliothèques Illumina.

Les kits de préparation de bibliothèque Illumina&rsquos Nextera® adoptent une approche unique qui combine ces deux étapes en une seule réaction enzymatique connue sous le nom de tagmentation. Une enzyme transposase conçue fragmente et marque l'ADN dans un processus à tube unique, éliminant ainsi le besoin d'étapes intermédiaires de purification et de ligature. Les kits de préparation de bibliothèque Nextera® nécessitent aussi peu que 50 ng d'ADN génomique purifié.

Pourquoi une quantification précise de l'ADN est-elle importante pour la préparation des bibliothèques NGS ?

Les bibliothèques de séquençage de qualité devraient fournir une couverture uniforme avec un biais minimal. La quantification précise de l'ADN génomique d'entrée garantit des résultats cohérents et reproductibles de la préparation de la bibliothèque. Il est important de choisir des méthodes fluorométriques de quantification de l'ADN qui sont spécifiques à l'ADN double brin (ADNds), car l'ADN simple brin (ADNsb) n'est pas un substrat approprié pour la plupart des technologies de préparation de bibliothèques. De plus, les méthodes spectrophotométriques (par exemple, les systèmes NanoDrop®) qui mesurent l'absorbance ultraviolette (UV) doivent être évitées. Ces méthodes mesurent les acides nucléiques totaux dans un échantillon ainsi que les impuretés. Ainsi, la quantité d'ADNdb génomique réellement présente peut être surestimée, en raison de la présence d'ARN, d'ADNsb ou d'oligonucléotides contaminants qui contribuent à l'absorbance UV globale.

Quelles méthodes sont couramment utilisées pour la quantification de l'ADN d'entrée ?

Tous les fabricants de systèmes de séquençage recommandent des méthodes de quantification fluorométrique spécifiques à l'ADNdb. Le fluoromètre Qubit® (Life Technologies) et le fluoromètre Quantus&trade (Promega Corporation) sont des méthodes populaires pour quantifier l'ADN génomique pour la préparation de bibliothèques NGS. PicoGreen® (Life Technologies) et le système QuantiFluor® dsDNA (Promega Corporation) sont des colorants fluorescents spécifiques à l'ADNdb qui peuvent être utilisés avec n'importe quel fluorimètre.

Illumina recommande d'utiliser le système QuantiFluor® dsDNA de Promega pour une mesure plus précise de l'ADN lors de la préparation des bibliothèques d'ADN Nextera Rapid Capture (4). Le colorant QuantiFluor® est spécifique de l'ADNdb, avec une liaison minimale à l'ADNsb, à l'ARN, aux protéines et aux composés interférents. La sensibilité du colorant QuantiFluor® est comparable à celle du PicoGreen®, jusqu'à des concentrations d'échantillon d'ADN de 10 pg/µl (concentrations d'essai de 50 pg/m).

Le système dsDNA QuantiFluor® a été développé à l'aide des systèmes de détection Promega. Le test peut être utilisé dans des formats à tube unique et à plaques multipuits. Le système QuantiFluor® dsDNA est compatible avec tout fluoromètre capable de mesurer la fluorescence aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission appropriées (504 nm et 531 nm, respectivement), y compris le fluoromètre Quantus™ et les systèmes GloMax® Discover et Explorer. Il peut également être utilisé avec le lecteur multimode monotube GloMax®-Multi Jr. Une courbe standard obtenue à l'aide du système QuantiFluor® dsDNA est illustrée à la figure 1.

Figure 1. Courbe standard représentative de l'ADNdb dans un format de plaque à 96 puits. Encart. Vue agrandie de l'extrémité inférieure de la courbe standard.

Le colorant QuantiFluor® offre des spécifications de performances similaires à celles du PicoGreen® (Figure 2). Dans les conditions utilisées pour générer les courbes standard pour le dosage, la plage dynamique pour les deux colorants est d'environ 100 pg à 200 ng par puits (dans un volume total de 200 l). La limite de détection du QuantiFluor® Dye est d'environ 10 pg par puits, telle que définie par plus de trois écarts types au-dessus de la fluorescence de fond.

Figure 2. Comparaison du colorant QuantiFluor® dsDNA et du PicoGreen.

Comment dois-je valider les bibliothèques terminées avant le séquençage ?

Une quantification précise de la bibliothèque est essentielle pour obtenir des données NGS optimales. Un chargement supérieur à la quantité recommandée d'ADN peut entraîner des problèmes de lecture d'instruments associés à la saturation de la Flowcell ou des billes, tandis qu'un chargement inférieur peut entraîner une couverture et une profondeur de lecture réduites.

Alors que les méthodes fluorométriques peuvent fournir une mesure précise et sensible de la quantité d'ADN présente dans une bibliothèque de séquençage, les méthodes quantitatives de réaction en chaîne par polymérase (qPCR) sont recommandées par les fabricants de systèmes de séquençage pour la validation finale de la bibliothèque avant le séquençage. Toute méthode de préparation de bibliothèque produira des molécules d'ADN qui ne peuvent pas être séquencées. Ce problème est particulièrement important pour les flux de travail sans PCR, car il n'y a pas d'étape d'amplification pour enrichir la bibliothèque en molécules d'ADN contenant les deux séquences adaptatrices. La quantification de la bibliothèque par qPCR permet de mesurer uniquement les molécules d'ADN qui contiennent les séquences d'adaptateur correctes, car les amorces PCR sont conçues pour correspondre aux adaptateurs spécifiques de la plate-forme de séquençage utilisée.

Illumina recommande d'utiliser les kits de quantification de bibliothèque KAPA® pour ses systèmes de séquençage. Des kits de quantification de bibliothèque qPCR standard sont disponibles pour toutes les plates-formes auprès de plusieurs fournisseurs, et de nombreux chercheurs choisissent de préparer leurs propres réactifs qPCR. Pour les bibliothèques de séquençage Ion Torrent®, Life Technologies fournit des kits qPCR basés sur la technologie de sonde fluorescente TaqMan®.

En plus de la quantité, la qualité de la bibliothèque doit être validée. En règle générale, cela se fait à l'aide d'un instrument d'électrophorèse 2100 Bioanalyzer (Agilent). Le bioanalyseur fournit une représentation visuelle de la gamme de tailles de fragments d'ADN constituant la bibliothèque, ce qui facilite la détection de problèmes potentiels tels qu'un pourcentage élevé de fragments d'ADN courts ou de dimères adaptateurs. Bien que la quantité de la bibliothèque puisse également être mesurée à l'aide d'un bioanalyseur, les méthodes de qPCR et de colorant fluorométrique sont toujours préférées pour une quantification précise.


Sélection d'échantillons pathologiques pour le séquençage de tumeurs solides de nouvelle génération

Sounak Gupta, M.B.B.S., Ph.D., est professeur adjoint de pathologie au département de médecine de laboratoire et de pathologie de la Mayo Clinic à Rochester, Minnesota.

Des questions?

Transcription et références

Introduction

Bonjour, je suis Matt Binnicker, directeur de la virologie clinique et vice-président de la pratique au département de médecine de laboratoire et de pathologie de la clinique Mayo. Dans le "Hot Topic" de ce mois-ci, le Dr Sounak Gupta discute de la sélection des tissus pour les tests moléculaires, en particulier des mesures et des exigences des tissus, qui diffèrent en fonction des plates-formes de test. J'espère que vous apprécierez le sujet brûlant de ce mois-ci et je tiens à vous remercier personnellement d'avoir permis à la Mayo Clinic d'être un partenaire dans les soins de santé de vos patients.

Merci pour la présentation.

Divulgation

Tests moléculaires des tissus

Le sujet de cette présentation est la sélection des tissus et des considérations tissulaires pour les tests moléculaires. Nous discuterons des métriques et des exigences des tissus, qui diffèrent en fonction des plates-formes de test. Et il est important de garder à l'esprit que les détails des mesures tissulaires changent au fil du temps à mesure qu'ils continuent d'évoluer avec la technologie. Nous passerons en revue un certain nombre d'exemples et aborderons un certain nombre de considérations supplémentaires sur les tissus.

Considérations sur les tissus

Il y a un certain nombre de détails à garder à l'esprit lors de la sélection de tissus pour des tests moléculaires supplémentaires : la source du tissu à utiliser pour les tests moléculaires ainsi que la manière dont il est collecté et traité, y compris le fixateur utilisé, la quantité totale de tumeur dans ce tissu, et le pourcentage de noyaux tumoraux. Chacune d'entre elles sera discutée plus en détail dans quelques diapositives.

Les sources d'obtention de tissus pour les tests moléculaires comprennent diverses procédures chirurgicales, notamment de petits échantillons de biopsie, des préparations cytologiques et même des biopsies liquides pour les tumeurs solides. Le tissu obtenu à partir de l'une des 4 premières procédures peut être traité de différentes manières. Alors que les tissus frais ou congelés conduisent souvent à l'acide nucléique de la meilleure qualité, il est assez rare dans la pratique courante et difficile à obtenir et à conserver à long terme. Le tissu fixé est de loin la source la plus courante d'acide nucléique pour les tests moléculaires des tumeurs solides. Un certain nombre de fixateurs et de protocoles de fixation sont couramment utilisés et sont également des variables qui doivent être prises en compte. Une fois le tissu fixé, il existe plusieurs façons d'obtenir de l'acide nucléique à partir d'un bloc de tissu (par exemple, en prélevant des carottes du bloc ou en grattant des lames non colorées).

Cette diapositive met en évidence la variabilité de la quantité de tissu qui peut être disponible. Les exemples de lames H&E et de blocs de tissus vont des grands tissus des spécimens de résection sur la gauche aux biopsies de différentes tailles au milieu et à droite de votre écran. Une fois que le tissu est dans ce format, le flux de travail moléculaire commence vraiment.

Exigences en matière de tissus

Dans le processus d'examen des diapositives, nous examinons essentiellement le tissu pour 2 exigences pour chaque test : d'abord, la quantité de tissu tumoral et ensuite, le pourcentage de noyaux tumoraux. Ceci est basé sur les mesures de performance de chaque test, en particulier la limite de détection. Ainsi, par exemple, notre panel de gènes ciblés sur le cancer du poumon avec réarrangements, LNGPR, nécessite actuellement 30 nanogrammes d'ADN. Généralement, cela peut être obtenu à partir de 0,4 x 0,4 cm de tissu gratté à partir de lames non colorées de 5 microns d'épaisseur ou d'environ 5 000 cellules à partir d'échantillons cytologiques. En ce qui concerne le pourcentage de tumeur, la métrique de ce test est d'au moins 20 % de noyaux tumoraux.

En regardant ce tableau des exigences de test, FISH est en quelque sorte une valeur aberrante. Parce que nous n'extrayons pas d'ADN, nous pouvons en fait tolérer un pourcentage de tumeur plus faible car l'architecture intacte aide à identifier les cellules à tester, de sorte que le nombre de cellules, plutôt que la quantité ou la cellularité, est la mesure la plus pertinente pour FISH. En termes de tests basés sur le NGS, les différentes méthodes présentées ont des exigences très variables pour le pourcentage de tumeur et la quantité de tissu afin d'obtenir l'ADN de qualité nécessaire pour chaque test.

Quantité d'ADN

La quantité de tissu et les exigences de cellularité sont en corrélation avec la quantité d'ADN nécessaire pour le test. Il est donc utile de garder à l'esprit que les cellules diploïdes humaines normales ont environ 6 picogrammes d'ADN. Souvent, un protocole de test indique la quantité d'ADN nécessaire dans les nanogames et non la quantité de tissu nécessaire en cm ou en mm ou le nombre de cellules, une petite conversion est donc utile. Un nanogramme équivaut à 1000 picogrammes et à 6 picogrammes par cellule, soit environ 167 cellules. Donc, si vous avez environ 5 000 cellules, soit environ 30 nanogrammes en comparaison, avec 500 cellules, vous n'avez en réalité qu'environ 3 nanogrammes d'ADN. En gardant à l'esprit qu'aucune méthode d'extraction n'est efficace à 100 %. La cellularité et la quantité de tumeur ne sont pas un prédicteur parfait de la quantité d'acide nucléique qu'une extraction produira ou de la qualité de l'ADN extrait (car d'autres facteurs sont impliqués), mais étant donné certaines limites biologiques, il s'agit d'une mesure utile et importante.

Tests tissulaires : macrodissection

Le tissu utilisé pour les tests est encore affiné par le processus de macrodissection, y compris l'optimisation du pourcentage de tumeur. Avec un grand morceau de tissu, comme l'image de gauche, il est facile de superposer la lame non tachée sur la lame H&E encerclée, d'aligner le tissu non taché et de gratter suffisamment de tissu des zones sélectionnées, évitant ainsi le tissu non tumoral environnant. Cependant, lorsque vous obtenez un échantillon de tissu plus petit, comme l'image de droite, il peut être problématique d'obtenir la quantité de tissu tumoral nécessaire, même si nous pouvons et raclons plusieurs lames du même bloc.

Quantité de tissu

Comme nous l'avons indiqué, la quantité de tissu nécessaire dépend du test particulier et est liée à la quantité d'acide nucléique nécessaire pour ce test. Ce n'est pas la seule métrique qui a un impact sur la qualité et la quantité d'ADN dont nous parlerons d'autres plus tard. Comme mentionné précédemment, la quantité d'ADN nécessaire pour différents tests évolue avec la technologie, ce qui en fait une cible mouvante.

Quantité de tumeur/cellularité

Et s'il n'y a pas assez de tissu ? Ou de l'ADN ? Les problèmes avec une petite quantité de tumeur et une faible cellularité dans un échantillon sont que vous pouvez ne pas obtenir suffisamment d'ADN pour le test, ce qui augmente le risque d'échouer aux mesures de qualité du test. En outre, une quantité limitée d'ADN matrice peut entraîner des artefacts de séquençage et des résultats faussement positifs ou faussement négatifs. Mis à part les problèmes liés à la réaction PCR elle-même, il faut garder à l'esprit au niveau biologique que lorsque vous n'avez qu'un petit échantillon de cellules, vous avez un échantillonnage limité de la tumeur elle-même et, comme nous le savons, il y a une hétérogénéité au sein des tumeurs, donc vous êtes moins susceptible de voir le spectre des altérations qui sont vraiment présentes. Passons maintenant à quelques exemples.

Cellularité tissulaire – Résection

Ce tissu de résection a une cellularité tissulaire fantastique et un pourcentage de tumeur élevé, il s'agit donc probablement d'un échantillon qui produirait suffisamment d'acide nucléique et serait acceptable pour les méthodes moléculaires et cytogénétiques.

Cellularité tissulaire – Petite biopsie

Lorsque l'on examine de petites biopsies, ce n'est pas seulement la taille du tissu, mais la cellularité et le pourcentage de tumeur qui comptent. Dans ces exemples, la biopsie de gauche a une cellularité élevée et un pourcentage élevé de noyaux tumoraux et est probablement acceptable pour la plupart des méthodes moléculaires et cytogénétiques, malgré le fait que le tissu lui-même est plutôt petit, seulement quelques millimètres. La biopsie de droite, cependant, bien qu'étant de taille similaire, n'a en fait pas beaucoup de noyaux présents dans le tissu et encore moins de noyaux tumoraux, et donc, elle serait inadéquate pour la plupart des méthodes cytogénétiques et moléculaires.

Cellularité tissulaire - Préparation cytologique

Les préparations cytologiques doivent être évaluées pour les mêmes paramètres. Ce frottis particulier a une excellente cellularité et de nombreux amas de cellules tumorales résultant en un pourcentage élevé de noyaux tumoraux et cela serait acceptable pour la plupart des méthodes.

Cellularité tissulaire – Blocs cellulaires

En comparaison, ce bloc cellulaire a une très faible cellularité, la majeure partie de ce que nous voyons sur la diapositive est simplement des globules rouges et, parmi les cellules nucléées présentes, la grande majorité sont des globules blancs, avec seulement de très rares cellules tumorales présentes . Ainsi, non seulement vous avez une faible cellularité globale, mais vous avez également un faible pourcentage de tumeur, de sorte que cet échantillon serait inadéquat pour les méthodes moléculaires et cytogénétiques.

Pourcentage de tumeur

Comme l'illustrent les diapositives précédentes, la taille et la cellularité des tissus ne sont pas les seules mesures que nous devons prendre en compte. Le pourcentage de tumeur ou le pourcentage de noyaux tumoraux est également une mesure critique. Comme je l'ai déjà dit, ce qui est acceptable varie selon la méthode de test. Ce qui peut être suffisant pour un test peut ne pas être suffisant pour un autre. La principale raison pour laquelle nous nous inquiétons à ce sujet est que si le pourcentage de tumeur ou le pourcentage de noyaux tumoraux est trop faible, mais que vous avez suffisamment de noyaux pour produire suffisamment d'acide nucléique pour passer la métrique de qualité du test, vous risquez un résultat faussement négatif.

Pourcentage de tumeur dans les grands tissus

Voici un exemple d'une plus grande section de tissu cependant, il n'y a pas beaucoup de tumeur. Le pourcentage de noyaux tumoraux est faible. Je dirais qu'il s'agit probablement de moins de 5% de noyaux tumoraux. Bien que cela soit insuffisant pour la plupart des tests moléculaires, ce serait en fait suffisant pour les tests FISH.

Voici un autre gros morceau de tissu provenant d'un spécimen de résection, et bien que nous ne voyions pas les grandes zones de noyaux lymphoïdes comme dans la diapositive précédente, il y a pas mal de stroma fibreux, et nous n'avons tout simplement pas un grand nombre de tumeurs noyaux présents. La macrodissection peut aider à optimiser jusqu'à environ 10%, ce qui serait suffisant pour certaines méthodes moléculaires et FISH.

Maintenant, dans cet échantillon de résection, la majeure partie des cellules présentes sur la lame sont néoplasiques, elle a donc un pourcentage de tumeur très élevé, environ 90 % ou plus, ce qui rend cet échantillon acceptable pour la plupart des méthodes.

Pourcentage de tumeur dans les petits tissus

Avec de petites biopsies, nous rencontrons fréquemment un pourcentage de tumeurs insuffisant. La biopsie elle-même est en fait de très bonne taille, au moins 1 cm, sinon plus de longueur cependant, la majorité du tissu est en fait du foie bénin. Il n'y a qu'une petite zone qui contient la tumeur. Donc, si vous regardez la biopsie globale, le pourcentage de noyaux tumoraux est assez faible. Nous pouvons essayer de macrodisséquer une zone, qui aurait alors un pourcentage de tumeur beaucoup plus élevé. Mais, il s'agirait d'une quantité extrêmement faible de tissu, il devrait donc être présent sur de nombreuses sections non colorées pour accumuler la quantité de tissu nécessaire au test. Ainsi, cet échantillon peut être inadéquat pour certaines techniques moléculaires, mais avec plus de 100 cellules tumorales présentes, il serait acceptable pour FISH.

Cette diapositive est un exemple d'un bien meilleur petit spécimen. Ce tissu a un peu de stroma, et il y a en fait un peu de nécrose. Cependant, la grande majorité des cellules nucléées sont des cellules tumorales, ce qui serait acceptable pour la plupart des tests.

Pourcentage de tissu dans les préparations cytologiques

Les mêmes mesures s'appliquent lorsque vous examinez les préparations cytologiques. Dans ce cas particulier, les cellules de ce bloc sont principalement des cellules tumorales, environ 90 %, et elles sont nombreuses, ce qui serait donc acceptable pour la plupart des méthodes.

Dans cette préparation cytologique, il y a beaucoup de cellules présentes, pour une assez bonne cellularité globale, mais le pourcentage de tumeur est faible, de l'ordre de <5%. Les cellules des amas tumoraux sont plus grosses et accrocheuses, car elles ont une bonne surface. Cependant, ils sont relativement peu nombreux par rapport au nombre de lymphocytes bénins en arrière-plan. Et c'est ce rapport – le nombre de cellules tumorales par rapport au nombre de cellules de fond – qui compte, pas la taille des cellules. Donc, ce serait en fait insuffisant pour la plupart des tests et, s'il y a plus de grappes sur la lame, cela serait suffisant pour FISH car il y a moins de 100 cellules dans ce champ particulier.

Fixateurs tissulaires

En changeant de vitesse, outre la quantité de tumeur présente dans les échantillons, il y a d'autres considérations tissulaires à garder à l'esprit, telles que la fixation. By far, the most common fixative is formalin, but a number of other formulations of formalin, as well as various acids, heavy metals, and decalcification solutions, are frequently used.

Formaldehyde as 10% neutral-buffered formalin is one of the most common tissue fixatives, and even though DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) specimens works well for a number of molecular methods, formalin does result in DNA damage. The average fragment of DNA that can be obtained from FFPE is about 200 to 300 base pairs, at best. You can try to improve the quality, being very careful about excessive time between surgery and fixation, and also trying to optimize the duration of fixation that is (avoiding inadequate or excessive fixation).

Nevertheless, we generally describe formalin as being acceptable, same with zinc-buffered formalin, and ethanol for cytology specimens (as alcohols are a very good cytology fixative, and do not cause significant DNA damage). Decalcification solutions are quite variable and generally decalcification is not acceptable. B5 and Bouins are examples of fixatives that, while they have important histologic effects and uses in various subspecialties, they do create problems for molecular testing and are not acceptable.

Tissue Considerations: Inhibitors

Other tissue considerations include recognition of potential inhibitors. Even with optimal size tissue and good cellularity and tumor percent, this does not guarantee that every specimen will work. We know that there are inhibitors present in tissue that can inhibit the PCR reaction or compete with the substrate. Good examples of natural inhibitors that we run into are melanin and calcium.

Tissue Artifacts

When it comes to melanin, it is easy to identify on H&E, on unstained slides, and in the block itself. However, even among heavily melanotic specimens, it is difficult to predict which will work and which will be inhibited and fail. Because of this unpredictable variability, they are generally considered worth trying.

Crush artifact is another issue, not so much because of what it does to the DNA or the PCR reaction, but because it makes it difficult to determine tumor percent, making it difficult to determine if the specimen is adequate. For FISH assays, this can be problematic, as it is difficult to define the area of individual nuclei in order to count signals. Generally, crushed tissue is inadequate for testing.

For necrosis, the effect is somewhat variable and it depends how much of the tissue is necrotic. A small focus of necrosis is usually acceptable, while extensively necrotic tissue (as pictured above) is inadequate. In this case, this issue affects the quality and quantity of the nuclei acid that can be obtained.

Cautery is another artifact that makes it difficult to determine tumor percent and is problematic to score FISH signals. Additionally, DNA that is obtained from such a specimen generally does not amplify well and would be considered inadequate.

Tissue Fixatives

As we have already mentioned, decalcification causes damage to the DNA above and beyond that caused by formalin, rendering these samples inadequate for NGS-based testing. The issue of decalcification is further complicated by the number of different decalcification solutions and procedures that are currently used in practice.

Sommaire

In summary, the success of the molecular and cytogenetic testing depends in large part on having an adequate amount of tumor (thereby sufficient DNA), having enough tumor percent, and minimizing potential tissue issues.


Méthodes

Collecte d'échantillons

Thirteen archived clinical tumor specimens from twelve lung cancer patients treated at Blokhin Russian Cancer Research Centre (RCRC) in 2014–2015 were randomly selected from respective existing registry. Another set of 13 samples was retrospectively randomly selected from a collection of Russian Scientific Center of Roentgenology and Radiology (RSCRR). Specimens of the latter set had already been screened for the presence of EGFR mutations hence, this RSCRR set of samples was enriched with EGFR positive patients by design. Overall, we studied 26 tumor specimens including lung adenocarcinoma (n = 11, 42%), squamous cell carcinoma (n = 11, 42%) and the tumors of mixed or unknown histology (n = 4, 16%). The study protocol was approved by Atlas Biomed Internal Review Board. Written informed consent was provided by all patients at inception of the study, all analyses were based on archival data and stored in database with no connections to the patient identifiers.

DNA extraction and sample quality control

Genomic DNA was extracted from formalin fixed, paraffin embedded (FFPE) tissues with the QIAamp DNA FFPE kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer’s instructions and was eluted in a 25 μL volume. The extracted DNA specimens were further quantified using the Qubit dsDNA HS assay kit (Life Technologies/Fisher Scientific, USA) and samples with DNA concentration lower 50 ng/μl were concentrated to this value. DNA quality and quantity were further assessed using the Illumina FFPE QC Kit according to the manufacturer’s instructions.

Library preparation and quality control

Sequencing libraries were prepared with the TSACP (Illumina, San Diego, USA), according to manufacturer’s protocol. Briefly, an oligo pool was hybridized to each genomic DNA sample. Following the removal of unbound oligos, target regions of interest flanked by sequences required for amplification were generated by extension and ligation and libraries were further PCR amplified. Library quality was assessed on a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California). Prior sequencing, the libraries were normalized following the manufacturer protocol and equal volumes were pooled to generate the final sequencing library. Primer panel designed to generate 212 amplicons within 48 cancer-related genes: ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, et VHL.

Sequencing and data analysis

Pooled libraries were sequenced using MiSeqDx (llumina) with a 2 × 150 paired-end sequencing design. Image processing and fastq file generation were further performed with CASAVA version 1.8.2 and RTA version 1.17.28 (Illumina). Reads were preprocessed for a removal of low-quality and too short nucleotide sequences using the Prinseq-lite program [22]. Minimum mean read quality score was set to Q30, and minimum length to 75 base pairs. Remaining paired-end reads were mapped to the GRCh37.p13 human genome employing Bowtie2 [23] software with varying parameters. After alignment, an exclusion of primers was performed employing in-house software. SAMtools (version 1.2) [24] was applied for the calling of germline variants, while somatic mutations were identified by Strelka (version 1.014) [25], Varscan (version 2.3.9) [26], ScalPel (version 0.5.3) [27] and Illumina Somatic Variant Caller (SVC) (version 3.1.6.4). GATK version 3.6 [28] was additionally used for indel realignment and other analysis. Germline polymorphisms were discriminated from the somatic based on their frequencies in human populations and presence in dbSNP [29] and COSMIC [30] databases. Recurrent artifact variant calls were discarded from the analysis employing in-house software. Protein variant annotation was performed using ANNOVAR [31], with non-coding or synonymous mutations discarded from further analysis. Copy number variations were detected using CNVPanelizer [32].

Mutation verification

Following NGS sequencing, EGFR and KRAS (including codons 12, 13) mutations in samples from the RCRC set as well as KRAS mutations from RSCRR set were validated either by Sanger sequencing or Real-Time PCR. Samples from RSCRR set were pre-screened for EGFR mutations and, thus, not required further validation with orthogonal methods. EGFR mutations (including exons 18–21) were examined by Sanger Sequencing. Primer pairs were 5′-CTGAGGTGACCCTTGTCTCTG-3′ and 5′-CCAAACACTCAGTGAAAC-3′, 5′-TGCCAGTTAACGTCTTCCTT-3′ and 5′-CAGGGTCTAGAGCAGAGCAG-3′, 5′-CATTCATGCGTCTTCACCTG-3′ and 5′-TTATCTCCCCTCCCCGTATC-3′, and 5′-TGATCTGTCCCTCACAGCAG-3′ and 5′-GGCTGACCTAAAGCCACCTC-3′ for exons 18, 19, 20 and 21 respectively. Thermal cycling conditions included 5 min at 95 °C followed by 35 cycles of 95 °C for 30 s, 60 °C for 30 s, 72 °C for 1 min and one cycle of 72 °C for 7 min. The PCR products were further purified with USB ExoSapit (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) followed by cycle sequencing with the BigDye Terminator version 3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) according to the manufacturer’s protocol and resolved on an ABI 3500xL sequencer (Applied Biosystems). Sequence chromatograms were analyzed by Sequencher software (Gene Codes Corp, Ann Arbor, MI), followed by manual review. KRAS codon 12, 13 mutations were examined by pyrosequencing as described previously [33].


Informations sur l'auteur

Affiliations

Oxford Molecular Diagnostics Centre, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK

Pauline Robbe MSc, Pavlos Antoniou PhD, Dimitrios V Vavoulis PhD & Kate Ridout PhD

Wellcome Trust Centre of Human Genetics, University of Oxford, Old Road Campus Research Building, Oxford, UK

Niko Popitsch PhD, Samantha J L Knight PhD, FRCPath & Jenny C Taylor PhD

Illumina Cambridge Ltd., Chesterford Research Park, Saffron Walden, UK

Jennifer Becq PhD, Miao He PhD, Mark T Ross BA (Hons), DPhil, Zoya Kingsbury & David R Bentley DPhil

Department of Oncology, University of Oxford, Oxford, UK

Alexander Kanapin PhD & Anastasia Samsonova PhD

Oxford Molecular Diagnostics Centre, John Radcliffe Hospital, Oxford University Hospitals NHS Trust, Oxford, UK

Maite Cabes BSc, Sara D C Ramos MSc, Suzanne Page MSc, Helene Dreau MSc, Shirley Henderson MSc, PhD & Anna Schuh MD, PhD

Genomics England, William Harvey Research Institute, Queen Mary University of London, London, UK

Louise J Jones MD, PhD, Alice Tuff-Lacey BSc hons, Joanne Mason PhD, BSc, Mark Caulfield FMedSci & Clare Turnbull MD, PhD

Computational Biology and Integrative Genomics, Department of Oncology, University of Oxford, Oxford, UK

Nuffield Department of Surgical Sciences, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK

Department of Cellular Pathology, Oxford University Hospital Foundation Trust, Oxford, UK

David Maldonado-Perez Mres, PhD, Ioannis Roxanis MD, PhD, Elena Collantes MD, PhD, Lisa Browning MB BC, FRCPath, Sunanda Dhar MD, FRCPath, Stephen Damato MBBS, MA, Susan Davies MBBS, FRCPath & Clare Turnbull MD, PhD

NIHR Biomedical Research Centre at Barts Health NHS Trust, London, UK

NIHR Comprehensive Biomedical Research Centre, Oxford, UK

Jenny C Taylor PhD & Anna Schuh MD, PhD

Division of Genetics and Epidemiology, Institute of Cancer Research, London, UK

Oxford Molecular Diagnostics Centre, Department of Oncology, University of Oxford, Oxford, UK


Matériaux et méthodes

Patients

This retrospective study was approved by the ethics committee of the Keio University (approval number: 20080015) and was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki and Title 45, U.S. Code of Federal Regulations, Part 46, Protection of Human Subjects, effective December 13, 2001. All patients provided written informed consent. We enrolled 90 patients with breast cancer with/without ERBB2 amplification, and 19 patients with other cancer types with ERBB2 amplification (estimated CN of more than 3.0) (Table ​ (Table1), 1 ), who underwent surgery at Keio University. Resected specimens were used for the NGS assay. For breast cancer specimens with low histological proportion of tumor cells, we used the specimens from the core needle biopsy performed before surgery.

Genomic testing was performed in-house using the PleSSision testing platform (Keio University Hospital, Tokyo, Japan). Briefly, genomic DNA was extracted from 10-µm-thick formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections of tumor specimens using the Maxwell RSC FFPE Plus DNA Kit (Cat.AS1720, Promega, Madison, USA) according to the manufacturer’s instructions. DNA quality was checked by calculating the DNA integrity number (DIN), using an Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) all analytes had DIN ≥𠂒.0. Libraries were generated from 80 (DIN ≤𠂒.5) or 160 (DIN >𠂒.5) ng of DNA per sample using the Human Comprehensive Cancer Panel, GeneRead DNAseq Panel PCR kit V2, GeneRead DNA Library I Core Kit, and GeneRead DNA Library I Amp Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and the library quality was assessed using the Agilent D1000 ScreenTape (Agilent Technologies). Targeted amplicon exome sequencing was performed using a 160 cancer-related gene panel as previously described [18, 19]. The targeted regions of all 160 genes were specifically enriched using oligonucleotide probes. The enriched libraries were sequenced with a paired-end (150਋p ×𠂒) sequencing method using the NextSeq sequencing platform (Illumina, San Diego, CA, USA), resulting in a mean depth of 500. The sequencing data were analyzed using the GenomeJack bioinformatics pipeline (Mitsubishi Space Software Co., Ltd., Tokyo, Japan) (http://genomejack.net/) as previously described [20]. The proportion of tumor cells ranged from 5 to 80% (median 45%). The estimated CN of the tumor cells was calculated by the following formula: estimated CN = (measured CN −𠂒)/proportion of tumor cells +𠂒.

IHC for HER2 was performed on 4-µm thick FFPE whole-tissue sections using the PATHWAY anti-HER-2/neu rabbit monoclonal antibody (clone 4B5, Ventana Medical Systems, Tokyo, Japan) on the Leica BOND-III (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). External positive controls were tested with each run. To determine the level of HER2 expression, the membrane staining pattern was estimated and scored on a scale of 0 to 3 +𠂟or breast 15 and gastric 16 cancers. An established breast cancer HER2 IHC scoring method [15] was applied to other solid cancers including lung, bladder, renal pelvic, cervical, endometrial, ovary, and prostate cancers, uterine sarcoma, and extra-mammary Paget’s disease for gastric cancers and cancers with clear luminal structure (colorectal, gallbladder, and fistula cancers), the gastric cancer scoring system [16] was used. Scoring was performed independently by three pathologists. The IHC for the ER and PgR was performed using the CONFIRM rabbit monoclonal antibodies (clone SP1 and IE2, respectively). Tumors with ≥𠂑% of cells showing positive nuclear staining for the expression of ER and PgR were evaluated as ER/PgR-positive. IHC for Ki67 was performed using a mouse monoclonal anti-human Ki67 antibody (MIB-1, Dako). The labeling index (LI) was assessed as the percentage of tumor cells showing definite nuclear staining among >� invasive tumor cells.

FFPE tissue Sects. (5-µm thick) were deparaffinized and digested using standard processing methods for FISH. The PathVysion HER2 DNA Probe Kit (Abbott Molecular/Vysis) was used for the hybridization of tissue sections. Hybridization and counterstaining were performed according to the manufacturer’s instructions. Slides were imaged using an Applied Imaging system running Ariol SL200 (Leica Biosystems, Tokyo, Japan). At least 30 nuclei were evaluated, and the results were interpreted following the 2018 American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists guidelines [15].

Analyses statistiques

For comparisons of the estimated CN among the IHC score groups, data were analyzed using a Kruskal–Wallis test and Steel𠄽wass multiple comparison test. ROC analysis was conducted to evaluate the diagnostic performance of estimated CN for IHC3 + or IHC2 + /FISH( +) outcomes. P values of <𠂐.05 were considered to indicate a significant difference. Statistical analysis was performed using SPSS software (version 19.0 for Windows IBM Corp., Armonk, NY, USA) and R v3.6.1.


Voir la vidéo: Séquençage nouvelle génération NGS (Novembre 2021).