Informations

Qu'est-ce qu'un métabolite ?


Je suis mathématicien et travaille sur les réseaux métaboliques en tant que réseaux. Mais je ne pouvais pas trouver une définition appropriée pour un métabolite? Sont-ils des molécules organiques ? un gène ou une protéine peut-il aussi être un métabolite ?


Cette définition du métabolisme est similaire à la plupart que j'ai vue dans les manuels de biologie.

Métabolisme : somme des réactions chimiques qui se déroulent au sein de chaque cellule d'un organisme vivant et qui fournissent l'énergie nécessaire aux processus vitaux et à la synthèse de nouvelles matières organiques.

La définition la plus large que je donnerais pour "métabolite" est toute molécule qui fait partie ou est le produit d'une réaction métabolique. Ce sont des molécules, mais pas nécessairement des molécules organiques (au sens traditionnel). Par exemple, toute cellule métaboliquement active va générer en permanence du phosphate inorganique en tant que métabolite de l'hydrolyse de l'ATP.

un gène ou une protéine peut-il aussi être un métabolite ?

Je suppose qu'une protéine pourrait être considérée comme un métabolite, mais cela dépendrait du contexte. la plupart des gens ne parleraient probablement pas de protéines en faisant référence aux "métabolites" de manière générale. Par exemple, une enzyme agissant comme catalyseur dans une réaction biochimique ne serait probablement pas considérée comme un métabolite de cette réaction spécifique (puisqu'elle n'est pas chimiquement modifiée au cours du processus). Mais dans un modèle métabolique impliquant la dégradation des protéines, il faudrait l'inclure d'une manière ou d'une autre. Cependant, les acides aminés (les éléments constitutifs des monomères des protéines) sont souvent incorporés dans les analyses métabolomiques et pourraient être considérés comme des métabolites importants dans de nombreuses réactions cellulaires différentes.

Un gène n'est pas un métabolite selon une définition raisonnable. Un gène n'est pas une molécule biologique, mais une unité d'information héréditaire. On pourrait soutenir que les molécules d'acide nucléique (ADN ou ARN) codant pour une séquence génique sont des métabolites, mais comme pour les protéines, cela dépendrait vraiment du contexte. Similaires également aux protéines, les sous-unités structurelles des polymères d'acides nucléiques (nucléosides et nucléotides) sont souvent des métabolites importants impliqués dans un grand nombre de fonctions cellulaires.

Est-ce que tout cela est aussi clair que de la boue ?


Liquide céphalo-rachidien dans les troubles neurologiques

C.E. Teunissen , . E.A.J. Willemse, dans Manuel de neurologie clinique, 2018

Métabolites

Les métabolites sont les produits et les intermédiaires du métabolisme cellulaire. Les métabolites peuvent avoir une multitude de fonctions, notamment la conversion d'énergie, la signalisation, l'influence épigénétique et l'activité des cofacteurs ( Lu et Thompson, 2012 Wellen et Thompson, 2012 ). Un exemple cliniquement bien connu de biomarqueur métabolite est la mesure du glucose dans le LCR. Ceci est effectué en cas de suspicion clinique d'infection, d'inflammation ou de processus malin.

La métabolomique est l'étude des profils des métabolites. Il utilise des méthodes de spectrométrie de masse pour analyser de nombreux métabolites différents dans un échantillon biologique ( Markley et al., 2017 ). La spectrométrie de résonance magnétique nucléaire est un autre outil utile en métabolomique ( Markley et al., 2017 ).


Contenu

Le concept selon lequel les individus pourraient avoir un "profil métabolique" qui pourrait être reflété dans la composition de leurs fluides biologiques a été introduit par Roger Williams à la fin des années 1940, [5] qui a utilisé la chromatographie sur papier pour suggérer que les schémas métaboliques caractéristiques de l'urine et de la salive étaient associés avec des maladies comme la schizophrénie. Cependant, ce n'est que grâce aux progrès technologiques des années 1960 et 1970 qu'il est devenu possible de mesurer quantitativement (par opposition à qualitativement) les profils métaboliques. [6] Le terme « profil métabolique » a été introduit par Horning, et al. en 1971 après avoir démontré que la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) pouvait être utilisée pour mesurer les composés présents dans les extraits d'urine et de tissus humains. [7] [8] Le groupe Horning, avec celui de Linus Pauling et Arthur B. Robinson, a dirigé le développement de méthodes GC-MS pour surveiller les métabolites présents dans l'urine jusqu'aux années 1970. [9]

Parallèlement, la spectroscopie RMN, découverte dans les années 1940, connaît également des avancées rapides. En 1974, Seeley et al. a démontré l'utilité d'utiliser la RMN pour détecter les métabolites dans des échantillons biologiques non modifiés. [10] Cette première étude sur le muscle a mis en évidence l'intérêt de la RMN dans la mesure où il a été déterminé que 90 % de l'ATP cellulaire est complexé au magnésium. Comme la sensibilité s'est améliorée avec l'évolution des intensités de champ magnétique plus élevées et la rotation à angle magique, la RMN continue d'être un outil analytique de premier plan pour étudier le métabolisme. [7] [11] Les efforts récents pour utiliser la RMN pour la métabolomique ont été largement conduits par le laboratoire de Jeremy K. Nicholson au Birkbeck College, à l'Université de Londres et plus tard à l'Imperial College de Londres. En 1984, Nicholson a montré que la spectroscopie RMN 1 H pouvait potentiellement être utilisée pour diagnostiquer le diabète sucré, et plus tard, il a été le premier à appliquer des méthodes de reconnaissance de formes aux données spectroscopiques de RMN. [12] [13]

En 1995, des expériences de métabolomique par chromatographie liquide et spectrométrie de masse [14] ont été réalisées par Gary Siuzdak alors qu'il travaillait avec Richard Lerner (alors président du Scripps Research Institute) et Benjamin Cravatt, pour analyser le liquide céphalo-rachidien d'animaux privés de sommeil. Une molécule d'un intérêt particulier, l'oléamide, a été observée et a montré plus tard qu'elle avait des propriétés induisant le sommeil. Ce travail est l'une des premières expériences de ce type combinant la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en métabolomique.

En 2005, la première base de données de spectrométrie de masse en tandem métabolomique, METLIN, [15] [16] pour caractériser les métabolites humains a été développée dans le laboratoire Siuzdak du Scripps Research Institute. METLIN s'est depuis développé et au 1er juillet 2019, METLIN contient plus de 450 000 métabolites et autres entités chimiques, chaque composé ayant des données expérimentales de spectrométrie de masse en tandem générées à partir d'étalons moléculaires à plusieurs énergies de collision et en modes d'ionisation positive et négative. METLIN est le plus grand référentiel de données de spectrométrie de masse en tandem de ce type. 2005 a également été l'année de la première parution de la revue académique dédiée Metabolomics, fondée par son actuel rédacteur en chef, le professeur Roy Goodacre.


En 2005, le laboratoire Siuzdak s'est engagé dans l'identification des métabolites associés à la septicémie et dans un effort pour résoudre le problème de l'identification statistique des métabolites dérégulés les plus pertinents à travers des centaines d'ensembles de données LC/MS, le premier algorithme a été développé pour permettre l'alignement non linéaire de données métabolomiques de spectrométrie de masse. Appelé XCMS, [17] où le « X » constitue toute technologie chromatographique, il a depuis (2012) [18] été développé en tant qu'outil en ligne et en 2019 (avec METLIN) compte plus de 30 000 utilisateurs enregistrés.


Le 23 janvier 2007, le Human Metabolome Project, dirigé par David Wishart de l'Université de l'Alberta, Canada, a achevé la première ébauche du métabolome humain, consistant en une base de données d'environ 2500 métabolites, 1200 médicaments et 3500 composants alimentaires. [19] [20] Des projets similaires ont été en cours dans plusieurs espèces végétales, notamment Medicago truncatula [21] et Arabidopsis thaliana [22] depuis plusieurs années.

À la mi-2010, la métabolomique était encore considérée comme un « domaine émergent ». [23] En outre, il a été noté que les progrès ultérieurs dans le domaine dépendaient en grande partie, en abordant des "défis techniques autrement irrésolus", de l'évolution technique de l'instrumentation de spectrométrie de masse. [23]

En 2015, le profilage du métabolome en temps réel a été démontré pour la première fois. [24]

Le métabolome fait référence à l'ensemble complet de petites molécules (<1,5 kDa) [19] métabolites (tels que les intermédiaires métaboliques, les hormones et autres molécules de signalisation, et les métabolites secondaires) qui se trouvent dans un échantillon biologique, tel qu'un seul organisme . [25] [26] Le mot a été inventé par analogie avec la transcriptomique et la protéomique comme le transcriptome et le protéome, le métabolome est dynamique, changeant de seconde en seconde. Bien que le métabolome puisse être défini assez facilement, il n'est actuellement pas possible d'analyser l'ensemble de la gamme des métabolites par une seule méthode analytique.

La première base de données de métabolites (appelée METLIN) pour rechercher des données de fragmentation à partir d'expériences de spectrométrie de masse en tandem a été développée par le laboratoire Siuzdak du Scripps Research Institute en 2005. [15] [16] METLIN contient plus de 450 000 métabolites et autres entités chimiques, chaque composé ayant données expérimentales de spectrométrie de masse en tandem. En 2006, [17] le laboratoire de Siuzdak a également développé le premier algorithme permettant l'alignement non linéaire des données métabolomiques de la spectrométrie de masse. Appelé XCMS, où le "X" constitue toute technologie chromatographique, il a depuis (2012) [18] été développé comme un outil en ligne et en 2019 (avec METLIN) compte plus de 30 000 utilisateurs enregistrés.

En janvier 2007, des scientifiques de l'Université de l'Alberta et de l'Université de Calgary ont terminé la première ébauche du métabolome humain. La base de données sur le métabolisme humain (HMDB) est peut-être la base de données spectrale métabolomique publique la plus complète à ce jour. [27] La ​​HMDB stocke plus de 110 000 entrées de métabolites différentes. Ils ont répertorié environ 1200 médicaments et 3500 composants alimentaires qui peuvent être trouvés dans le corps humain, comme indiqué dans la littérature. [19] Ces informations, disponibles dans la Human Metabolome Database (www.hmdb.ca) et basées sur l'analyse des informations disponibles dans la littérature scientifique actuelle, sont loin d'être complètes. [28] En revanche, on en sait beaucoup plus sur les métabolomes d'autres organismes. Par exemple, plus de 50 000 métabolites du règne végétal ont été caractérisés et plusieurs milliers de métabolites ont été identifiés et/ou caractérisés à partir de plantes individuelles. [29] [30]

Chaque type de cellule et de tissu possède une « empreinte digitale » métabolique unique qui peut élucider des informations spécifiques à un organe ou à un tissu. Les échantillons biologiques utilisés pour l'analyse métabolomique comprennent, mais sans s'y limiter, le plasma, le sérum, l'urine, la salive, les matières fécales, les muscles, la sueur, l'air expiré et le liquide gastro-intestinal. [31] La facilité de collecte facilite une résolution temporelle élevée, et parce qu'ils sont toujours en équilibre dynamique avec le corps, ils peuvent décrire l'hôte dans son ensemble. [32] Le génome peut dire ce qui pourrait arriver, le transcriptome peut dire ce qui semble se passer, le protéome peut dire ce qui le fait se produire et le métabolome peut dire ce qui s'est passé et ce qui se passe. [33]

Les métabolites sont les substrats, les intermédiaires et les produits du métabolisme. Dans le contexte de la métabolomique, un métabolite est généralement défini comme toute molécule de taille inférieure à 1,5 kDa. [19] Cependant, il existe des exceptions à cela en fonction de l'échantillon et de la méthode de détection. Par exemple, les macromolécules telles que les lipoprotéines et l'albumine sont détectées de manière fiable dans les études métabolomiques basées sur la RMN du plasma sanguin. [34] En métabolomique à base de plantes, il est courant de se référer aux métabolites "primaires" et "secondaires". [3] Un métabolite primaire est directement impliqué dans la croissance, le développement et la reproduction normaux. Un métabolite secondaire n'est pas directement impliqué dans ces processus, mais a généralement une fonction écologique importante. Les exemples incluent les antibiotiques et les pigments. [35] En revanche, dans la métabolomique humaine, il est plus courant de décrire les métabolites comme étant soit endogènes (produits par l'organisme hôte) soit exogènes. [36] [37] Les métabolites de substances étrangères telles que les médicaments sont appelés xénométabolites. [38]

Le métabolome forme un vaste réseau de réactions métaboliques, où les sorties d'une réaction chimique enzymatique sont des entrées pour d'autres réactions chimiques. De tels systèmes ont été décrits comme des hypercycles. [ citation requise ]

La métabonomie est définie comme « la mesure quantitative de la réponse métabolique multiparamétrique dynamique des systèmes vivants à des stimuli physiopathologiques ou à une modification génétique ». Le mot origine vient du grec ?? changement de sens et nomos ce qui signifie un ensemble de règles ou un ensemble de lois. [39] Cette approche a été lancée par Jeremy Nicholson à l'Université Murdoch et a été utilisée en toxicologie, en diagnostic de maladies et dans un certain nombre d'autres domaines. Historiquement, l'approche métabonomique a été l'une des premières méthodes à appliquer la portée de la biologie des systèmes aux études du métabolisme. [40] [41] [42]

Il y a eu un certain désaccord sur les différences exactes entre « métabolomique » et « métabonomie ». La différence entre les deux termes n'est pas liée au choix de la plate-forme analytique : bien que la métabonomique soit davantage associée à la spectroscopie RMN et la métabolomique aux techniques basées sur la spectrométrie de masse, cela est simplement dû aux usages entre les différents groupes qui ont popularisé les différents termes. Bien qu'il n'y ait toujours pas d'accord absolu, il existe un consensus croissant selon lequel la «métabolomique» met davantage l'accent sur le profilage métabolique au niveau cellulaire ou organique et concerne principalement le métabolisme endogène normal. La « métabonomie » étend le profilage métabolique pour inclure des informations sur les perturbations du métabolisme causées par des facteurs environnementaux (y compris le régime alimentaire et les toxines), les processus pathologiques et l'implication d'influences extragénomiques, telles que la microflore intestinale. Il ne s'agit pas d'une différence triviale. Les études métabolomiques devraient, par définition, exclure les contributions métaboliques provenant de sources extragénomiques, car celles-ci sont externes au système étudié. Cependant, dans la pratique, dans le domaine de la recherche sur les maladies humaines, il existe encore un grand chevauchement dans la façon dont les deux termes sont utilisés, et ils sont souvent en fait synonymes. [43]

L'exométabolomique, ou « empreinte métabolique », est l'étude des métabolites extracellulaires. Il utilise de nombreuses techniques d'autres sous-domaines de la métabolomique et a des applications dans le développement de biocarburants, le biotraitement, la détermination du mécanisme d'action des médicaments et l'étude des interactions intercellulaires. [44]

Le flux de travail typique des études métabolomiques est illustré dans la figure. Tout d'abord, des échantillons sont collectés à partir de tissus, de plasma, d'urine, de salive, de cellules, etc. Ensuite, les métabolites sont extraits souvent avec l'ajout d'étalons internes et la dérivation. [45] Lors de l'analyse des échantillons, les métabolites sont quantifiés (chromatographie liquide ou chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie MS et/ou RMN). Les données de sortie brutes peuvent être utilisées pour l'extraction des caractéristiques des métabolites et traitées ultérieurement avant l'analyse statistique (telle que l'ACP). De nombreux outils et logiciels bioinformatiques sont disponibles pour identifier les associations avec les états pathologiques et les résultats, déterminer des corrélations significatives et caractériser les signatures métaboliques avec les connaissances biologiques existantes. [46]

Méthodes de séparation Modifier

Initialement, les analytes dans un échantillon métabolomique constituent un mélange très complexe. Ce mélange complexe peut être simplifié avant la détection en séparant certains analytes des autres. La séparation atteint divers objectifs : les analytes qui ne peuvent pas être résolus par le détecteur peuvent être séparés dans cette étape de l'analyse MS la suppression des ions est réduite le temps de rétention de l'analyte sert d'information concernant son identité. Cette étape de séparation n'est pas obligatoire et est souvent omise dans les approches basées sur la RMN et le « shotgun » telles que la lipidomique au fusil de chasse.

La chromatographie en phase gazeuse (GC), en particulier lorsqu'elle est interfacée avec la spectrométrie de masse (GC-MS), est une technique de séparation largement utilisée pour l'analyse métabolomique. [47] La ​​GC offre une résolution chromatographique très élevée et peut être utilisée en conjonction avec un détecteur à ionisation de flamme (GC/FID) ou un spectromètre de masse (GC-MS). La méthode est particulièrement utile pour l'identification et la quantification de petites molécules volatiles. [48] ​​Cependant, une limitation pratique de la GC est l'exigence de dérivatisation chimique pour de nombreuses biomolécules, car seuls les produits chimiques volatils peuvent être analysés sans dérivatisation. Dans les cas où un plus grand pouvoir de résolution est requis, la chromatographie bidimensionnelle (GCxGC) peut être appliquée.

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est devenue la technique de séparation la plus courante pour l'analyse métabolomique. Avec l'avènement de l'ionisation par électrospray, la HPLC a été couplée à la MS. Contrairement à la GC, la HPLC a une résolution chromatographique inférieure, mais ne nécessite aucune dérivatisation pour les molécules polaires et sépare les molécules en phase liquide. De plus, la HPLC a l'avantage de pouvoir mesurer une gamme beaucoup plus large d'analytes avec une sensibilité plus élevée que les méthodes GC. [49]

L'électrophorèse capillaire (CE) a une efficacité de séparation théorique plus élevée que la HPLC (bien que nécessitant beaucoup plus de temps par séparation) et convient à une utilisation avec une plus large gamme de classes de métabolites que la GC. Comme pour toutes les techniques électrophorétiques, elle est la plus appropriée pour les analytes chargés. [50]

Méthodes de détection Modifier

La spectrométrie de masse (MS) est utilisée pour identifier et quantifier les métabolites après séparation facultative par GC, HPLC ou CE. La GC-MS a été la première technique de trait d'union à être développée. L'identification exploite les modèles distincts dans lesquels le fragment d'analytes qui peut être considéré comme une bibliothèque d'empreintes digitales spectrales de masse existe qui permet l'identification d'un métabolite selon ce modèle de fragmentation [ exemple nécessaire ] . La SEP est à la fois sensible et peut être très spécifique. Il existe également un certain nombre de techniques qui utilisent la MS en tant que technologie autonome : l'échantillon est infusé directement dans le spectromètre de masse sans séparation préalable, et la MS offre une sélectivité suffisante à la fois pour séparer et pour détecter les métabolites.

Pour l'analyse par spectrométrie de masse, les analytes doivent être chargés et transférés en phase gazeuse. L'ionisation électronique (EI) est la technique d'ionisation la plus courante appliquée aux séparations GC car elle est sensible aux basses pressions. L'IE produit également une fragmentation de l'analyte, fournissant à la fois des informations structurelles tout en augmentant la complexité des données et en masquant éventuellement l'ion moléculaire. L'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) est une technique à pression atmosphérique qui peut être appliquée à toutes les techniques de séparation ci-dessus. APCI est une méthode d'ionisation en phase gazeuse légèrement plus agressive que l'ESI qui convient aux composés moins polaires. L'ionisation par électrospray (ESI) est la technique d'ionisation la plus couramment appliquée en LC/MS. Cette ionisation douce est plus efficace pour les molécules polaires avec des groupes fonctionnels ionisables. Une autre technique d'ionisation douce couramment utilisée est l'ionisation secondaire par électronébulisation (SESI).

L'analyse de masse en surface a connu une résurgence au cours de la dernière décennie, avec de nouvelles technologies MS axées sur l'augmentation de la sensibilité, la minimisation du bruit de fond et la réduction de la préparation des échantillons. La capacité d'analyser les métabolites directement à partir de biofluides et de tissus continue de défier la technologie actuelle de la SEP, en grande partie à cause des limites imposées par la complexité de ces échantillons, qui contiennent des milliers à des dizaines de milliers de métabolites. Parmi les technologies développées pour relever ce défi, citons la nanostructure-initiateur MS (NIMS), [51] [52] une approche de désorption/ionisation qui ne nécessite pas l'application de matrice et facilite ainsi l'identification des petites molécules (c'est-à-dire des métabolites). MALDI est également utilisé, cependant, l'application d'une matrice MALDI peut ajouter un bruit de fond important à <1000 Da qui complique l'analyse de la plage de faible masse (c'est-à-dire les métabolites). De plus, la taille des cristaux matriciels résultants limite la résolution spatiale qui peut être obtenue en imagerie tissulaire. En raison de ces limitations, plusieurs autres approches de désorption/ionisation sans matrice ont été appliquées à l'analyse des biofluides et des tissus.

La spectrométrie de masse d'ions secondaires (SIMS) a été l'une des premières approches de désorption/ionisation sans matrice utilisée pour analyser les métabolites d'échantillons biologiques. [ citation requise ] Le SIMS utilise un faisceau d'ions primaires à haute énergie pour désorber et générer des ions secondaires à partir d'une surface. Le principal avantage du SIMS est sa haute résolution spatiale (aussi petite que 50 nm), une caractéristique puissante pour l'imagerie tissulaire avec la SEP. Cependant, SIMS n'a pas encore été facilement appliqué à l'analyse des biofluides et des tissus en raison de sa sensibilité limitée à >500 Da et de la fragmentation de l'analyte générée par le faisceau d'ions primaires à haute énergie. L'ionisation par électrospray de désorption (DESI) est une technique sans matrice pour l'analyse d'échantillons biologiques qui utilise un spray de solvant chargé pour désorber les ions d'une surface. Les avantages de DESI sont qu'aucune surface spéciale n'est requise et que l'analyse est effectuée à pression ambiante avec un accès complet à l'échantillon pendant l'acquisition. Une limitation de DESI est la résolution spatiale car la "focalisation" de la pulvérisation de solvant chargée est difficile. Cependant, un développement récent appelé ESI d'ablation laser (LAESI) est une approche prometteuse pour contourner cette limitation. [ citation requise ] Plus récemment, les techniques de piégeage d'ions telles que la spectrométrie de masse orbitrap sont également appliquées à la recherche en métabolomique. [53]

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est la seule technique de détection qui ne repose pas sur la séparation des analytes, et l'échantillon peut ainsi être récupéré pour d'autres analyses. Toutes sortes de métabolites de petites molécules peuvent être mesurés simultanément - en ce sens, la RMN est proche d'être un détecteur universel. Les principaux avantages de la RMN sont une reproductibilité analytique élevée et la simplicité de préparation des échantillons. En pratique, cependant, il est relativement peu sensible par rapport aux techniques basées sur la spectrométrie de masse. [54] [55] La comparaison des méthodes métabolomiques les plus couramment utilisées est présentée dans le tableau.

Bien que la RMN et la SM soient les techniques les plus largement utilisées, les techniques modernes sont d'autres méthodes de détection qui ont été utilisées. Ceux-ci incluent la résonance cyclotron ionique à transformée de Fourier, [56] la spectrométrie de mobilité ionique, [57] la détection électrochimique (couplée à la HPLC), la spectroscopie Raman et le radiomarqueur (lorsqu'il est combiné avec la chromatographie en couche mince). [ citation requise ]

Les données générées en métabolomique consistent généralement en des mesures effectuées sur des sujets dans diverses conditions. Ces mesures peuvent être des spectres numérisés ou une liste de caractéristiques des métabolites. Dans sa forme la plus simple, cela génère une matrice avec des lignes correspondant aux sujets et des colonnes correspondant aux caractéristiques des métabolites (ou vice versa). [7] Plusieurs programmes statistiques sont actuellement disponibles pour l'analyse des données de RMN et de spectrométrie de masse. Un grand nombre de logiciels libres sont déjà disponibles pour l'analyse des données métabolomiques présentées dans le tableau. Certains outils statistiques répertoriés dans le tableau ont été conçus pour les analyses de données RMN et ont également été utiles pour les données MS. [58] Pour les données de spectrométrie de masse, un logiciel est disponible qui identifie les molécules qui varient dans les groupes de sujets sur la base de la valeur de masse sur charge et parfois du temps de rétention en fonction de la conception expérimentale. [59]

Une fois la matrice de données des métabolites déterminée, des techniques de réduction des données non supervisées (par exemple, PCA) peuvent être utilisées pour élucider les schémas et les connexions. Dans de nombreuses études, y compris celles évaluant la toxicité des médicaments et certains modèles de maladie, les métabolites d'intérêt ne sont pas connus a priori. Cela fait des méthodes non supervisées, celles sans hypothèses préalables d'appartenance à une classe, un premier choix populaire. La plus courante de ces méthodes comprend l'analyse en composantes principales (ACP) qui peut réduire efficacement les dimensions d'un ensemble de données à quelques-unes qui expliquent la plus grande variation. [32] Lorsqu'il est analysé dans l'espace PCA de dimension inférieure, le regroupement d'échantillons avec des empreintes métaboliques similaires peut être détecté. Les algorithmes PCA visent à remplacer toutes les variables corrélées par un nombre beaucoup plus petit de variables non corrélées (appelées composantes principales (PC)) et à conserver la plupart des informations dans l'ensemble de données d'origine. [60] Ce regroupement peut élucider les modèles et aider à la détermination des biomarqueurs de la maladie - les métabolites les plus corrélés avec l'appartenance à la classe.

Les modèles linéaires sont couramment utilisés pour les données métabolomiques, mais sont affectés par la multicolinéarité. D'autre part, les statistiques multivariées sont des méthodes florissantes pour les données métabolomiques corrélées de grande dimension, dont la plus populaire est la régression de la projection sur les structures latentes (PLS) et sa version de classification PLS-DA. D'autres méthodes d'exploration de données, telles que la forêt aléatoire, les machines à vecteurs de support, etc. font l'objet d'une attention croissante pour l'analyse de données métabolomiques non ciblées. [61] Dans le cas des méthodes univariées, les variables sont analysées une par une à l'aide d'outils statistiques classiques (tels que le test t de Student, l'ANOVA ou les modèles mixtes) et seules celles avec des valeurs p suffisamment petites sont considérées comme pertinentes. [31] Cependant, des stratégies de correction devraient être utilisées pour réduire les fausses découvertes lorsque de multiples comparaisons sont effectuées. Pour l'analyse multivariée, les modèles doivent toujours être validés pour s'assurer que les résultats peuvent être généralisés.

L'apprentissage automatique est également un outil puissant qui peut être utilisé dans l'analyse métabolomique. Récemment, les auteurs d'un article publié dans Analytical Chemistry ont développé un logiciel de prédiction du temps de rétention appelé Retip. Cet outil, développé en collaboration avec NGALAB, le West Coast Metabolomics Center et Riken, permet à tous les laboratoires d'appliquer l'intelligence artificielle à la prédiction du temps de rétention de petites molécules dans une matrice complexe, comme le plasma humain, les plantes, les aliments ou les microbes. La prédiction du temps de rétention augmente le taux d'identification en chromatographie liquide et conduit par la suite à une meilleure interprétation biologique des données métabolomiques. [62]

Un modèle de processus d'exploration de données appelé (MeKDDaM) a été développé à l'Université d'Aberystwyth pour fournir un cadre systématique et formalisé pour guider et effectuer l'analyse des données métabolomiques d'une manière justifiable, traçable et pour promouvoir la réalisation des objectifs analytiques des enquêtes métabolomiques et pour assurer la validité, l'interprétabilité et la reproductibilité de leurs résultats [63] . et a ensuite été appliqué à un certain nombre d'ensembles de données métabolomiques pour démontrer et évaluer son applicabilité à différentes enquêtes, approches et instruments d'acquisition de données métabolomiques d'une part, et à différentes approches, objectifs, tâches et techniques d'exploration de données d'autre part [64] .

Une stratégie de sélection des techniques d'exploration de données et d'apprentissage automatique en métabolomique est également disponible [65] . La stratégie définit des mécanismes pour sélectionner la bonne technique d'apprentissage automatique qui prend en considération les objectifs des techniques d'exploration de données d'une part et les objectifs des enquêtes métabolomiques et la nature des données d'autre part. La stratégie vise à assurer la validité et la justesse des résultats et à favoriser l'atteinte des objectifs de l'enquête.

L'évaluation de la toxicité/toxicologie par profilage métabolique (en particulier des échantillons d'urine ou de plasma sanguin) détecte les changements physiologiques causés par l'agression toxique d'un produit chimique (ou d'un mélange de produits chimiques). Dans de nombreux cas, les changements observés peuvent être liés à des syndromes spécifiques, par ex. une lésion spécifique du foie ou des reins. Ceci est particulièrement pertinent pour les sociétés pharmaceutiques qui souhaitent tester la toxicité de candidats médicaments potentiels : si un composé peut être éliminé avant qu'il n'atteigne les essais cliniques pour des raisons de toxicité indésirable, cela permet d'économiser l'énorme dépense des essais. [43]

Pour la génomique fonctionnelle, la métabolomique peut être un excellent outil pour déterminer le phénotype causé par une manipulation génétique, telle que la suppression ou l'insertion d'un gène. Parfois, cela peut être un objectif suffisant en soi, par exemple pour détecter tout changement phénotypique dans une plante génétiquement modifiée destinée à la consommation humaine ou animale. Plus excitante est la perspective de prédire la fonction de gènes inconnus par comparaison avec les perturbations métaboliques causées par la suppression/insertion de gènes connus. De telles avancées proviendront probablement d'organismes modèles tels que Saccharomyces cerevisiae et Arabidopsis thaliana. Le laboratoire Cravatt du Scripps Research Institute a récemment appliqué cette technologie aux systèmes de mammifères, identifiant les N-acyltaurines comme substrats endogènes précédemment non caractérisés pour l'enzyme amide d'acide gras hydrolase (FAAH) et les éthers de monoalkylglycérol (MAGE) comme substrats endogènes pour l'hydrolase non caractérisée KIAA1363. [66] [67]

La métabologénomique est une nouvelle approche pour intégrer les données métabolomiques et génomiques en corrélant les métabolites exportés par les microbes avec les gènes biosynthétiques prédits. [68] Cette méthode d'appariement basée sur la bioinformatique permet la découverte de produits naturels à plus grande échelle en affinant les analyses métabolomiques non ciblées pour identifier les petites molécules avec une biosynthèse associée et se concentrer sur celles qui n'ont peut-être pas de structures auparavant bien connues.

La Fluxomique est un développement ultérieur de la métabolomique. L'inconvénient de la métabolomique est qu'elle ne fournit à l'utilisateur que des informations de niveau d'équilibre, tandis que la fluxomique détermine les taux de réaction des réactions métaboliques et peut tracer les métabolites dans un système biologique au fil du temps.

La nutrigénomique est un terme généralisé qui relie la génomique, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique à la nutrition humaine. En général, un métabolome dans un fluide corporel donné est influencé par des facteurs endogènes tels que l'âge, le sexe, la composition corporelle et la génétique ainsi que par des pathologies sous-jacentes. La microflore du gros intestin est également un facteur de confusion potentiel très important des profils métaboliques et pourrait être classée comme un facteur endogène ou exogène. Les principaux facteurs exogènes sont l'alimentation et les médicaments. Le régime peut alors être décomposé en nutriments et non-nutriments. La métabolomique est un moyen de déterminer un paramètre biologique, ou empreinte métabolique, qui reflète l'équilibre de toutes ces forces sur le métabolisme d'un individu. [69]


ADME expérimentale et toxicologie

Qi Joy Yang, K. Sandy Pang, dans Comprehensive Medicinal Chemistry III, 2017

4.05.6 Remarques sommaires

Les tests de métabolites attirent actuellement de plus en plus d'attention dans le développement de médicaments. Dans cette communication, nous avons discuté de l'utilisation de la modélisation PBPK comme outil utile pour évaluer simultanément la cinétique du médicament parent et des métabolites. Il est capable de prendre en compte les propriétés physicochimiques du précurseur et du métabolite, ainsi que d'intégrer le processus médié par le transporteur, le métabolisme séquentiel, la liaison aux médicaments, l'hétérogénéité enzymatique et le schéma d'écoulement ségrégué sur l'intestin grêle dans un seul modèle. Le SFM, en particulier, est supérieur au TM dans la description du métabolisme dépendant de la route. Deux études de cas sont présentées pour apprécier les avantages de la GDF par rapport à la MT et à la modélisation compartimentale. De plus, le modèle PBPK peut intégrer des données pharmacocinétiques avec des modifications pharmacodynamiques et des données de toxicité. Enfin, nous avons mis en évidence plusieurs considérations importantes, telles que l'interaction enzyme/transporteur, la distribution zonale des enzymes, la liaison aux protéines et le métabolisme de premier passage séquentiel dans l'analyse de la cinétique des métabolites. Nous avons également discuté du fait que l'utilisation du métabolite dans l'étude de bioéquivalence est discutable, étant donné que la cinétique du métabolite formé dépend de l'endroit et de la manière dont il se forme. Sans aucun doute, la modélisation PBPK est une approche avancée et puissante qui peut être utilisée pour déchiffrer la cinétique des métabolites dans le développement de médicaments.


Que sont les métabolites des médicaments ?

Un métabolite de médicament est un sous-produit du corps qui décompose ou « métabolise » un médicament en une substance différente. The process of metabolizing a drug is predictable and certain everyone metabolizes drugs the same way. Therefore, the presence of a drug metabolite can be a reliable indicator that a person used the “parent” drug of that metabolite.

Some metabolites stay in the body much longer than the parent drug. When that is the case, a drug test has a higher probability of identifying a drug user by looking for the metabolites of the drug, rather than the parent drug.

Here are some examples of drug test kits that detect metabolites, rather than the parent drug:

A typical cocaine drug test kit looks for the presence of the metabolite benzoylecgonine. The presence of benzoylecgonine in a person’s system indicates cocaine use. Benzoylecgonine stays in a person’s system significantly longer than cocaine (the “parent” drug).

Nicotine is metabolized into cotinine, which has a much longer life in the body than the parent nicotine drug. Therefore, a urine drug test for “nicotine” looks for the presence of cotinine as an indicator of tobacco use.

THC is the active substance in marijuana. However, the body quickly metabolizes the THC molecule into several metabolites with long chemical names. Urine drug tests typically detect the THC-COOH (nor-delta-9-tetrahydrocannabinol) metabolite to identify marijuana users because it stays in the body much longer than the parent THC drug.

ABOUT ALCOPRO

Since 1982, AlcoPro has supplied and manufactured the most accurate drug and alcohol testing instruments, kits, and supplies for professional use. We take pride in maintaining our industry-wide reputation for précision et quality as we help you—our top priority—perform alcohol and drug screenings and tests with greater precision and confidence.


Secondary Metabolites: Meaning, Role and Types

Plants produce thousands types of chemicals. Some of the organic compounds like carbohydrates, fats, proteins, nucleic acids, chlorophylls, hemes are required for their basic metabolic processes and found throughout the plant kingdom. These organic com­pounds are called primary metabolites or biomolecules. These are produced in large quantities and can easily be extracted from the plants.

Many plants, fungi and microbes of certain genera and families synthesize a number of organic compounds which are not involved in primary metabolism (pho­tosynthesis, respiration, and protein and lipid metabolism) and seem to have no direct function in growth and development of plants. Such compounds are called secondary metabolites (secondary plant products or natural products) (Table 9.7).

These compounds are accessary rather than central to the functioning of the plants in which they are found. These compounds are produced in small quantities and their extraction from the plant is difficult and expensive.

They accumulate in small quantities only in specific parts of plants. These are derivatives of primary metabolites. By the cultivation of plant cells in culture media, secondary metabolites can be produced on large scale.

Role of Secondary Metabolites:

(1) Some of them attract animals for pollination and seed dispersal.

(2) They are used by the plants in their defence against herbivores and pathogens.

(3) They act as agents of plant-plant competition.

(4) They are used in making drugs, insecticides, flavours, pigments, scents, rubber, spices and other industrial materials like gums, resins for human welfare.

Types of Secondary Metabolites:

These secondary metabolites are highly numerous in number, chemically diverse in nature and belong to three groups.


Production of Secondary Metabolites | Biotechnologie

In this article we will discuss about:- 1. Basic Strategies for Secondary Metabolite Production 2. Factors Affecting the Production of Secondary Metabolite Production 3. Specialized Strategies 4. Regulation.

In the beginning of the plant tissue culture, studies were heavily focused on the fundamental assessment of nutrition, growth and differentiation. Several advancements in cell and tissue culture techniques have taken place after 1960 and have paved new avenues for commercialization of in vitro techniques.

Realities on potentialities of plant cells for the in vitro production of secondary metabolites gained a significant momentum during this period. The contribution of Jones and his associates on the cell culture techniques laid an initial foundation for the production of secondary metabolites.

Plants are armed with several fine chemicals which are of immense value in pharmaceutical industry. There have been several persistent endeavours to accomplish tissue culture strategies for the production of pharmaceutically important secondary metabolites. The most commonly referred plant secondary metabolites are phytochemicals, which includes alkaloids, plant phenolics and massive diverse group of terpenes.

Plants are armed with these phytochemicals which are expressed basically in response to environmental factors such as ultraviolet, light intensity and defence related functions against microbial and pest attacks. Earlier conclusions on secondary metabolites have shown that their production in plants do not participate in growth and development of plants.

But, recent evidences proved that these phytochemicals are actively participating in plant defence functions and signal mechanisms. Primary metabolites contribute overwhelmingly in the production of secondary metabolites by specialized pathways common to all plants.

Several secondary metabolites are useful in cosmetic industries which include shikonin and aloe juice for skin treatment. In addition, several insect repellants, colouring and flavouring agents have also been noticed as potential useful compounds (Table 12.2).

Realizing the economic potential of high demanding phytochemicals, cell culture technology has become increasingly significant for the production of secondary metabolites. The first commercial production of shikonin by cell culture using Lithospermum erythrorhizone in 1983 has attracted the researchers at a global scenario. The number of patents issued in Japan shows that secondary metabolites clinched major share of patents during 1975-1985.

Although secondary metabolite production in cell culture is feasible, their economic factors for enhanced production of most of the target metabolites are still handicapped. Therefore, refined cell culture strategy is required to address these problems in booming new technology for secondary metabolites.

Some of the far most advantages of metabolite production over conventional methods are:

(a) In vitro culture, which ensures production of metabolites throughout the year irrespective of the season. On the contrary, production and accumulation of phytochemicals takes place only during specific season in field grown plants.

(b) In vitro production of phytochemicals takes place within a short span of time when compared to the natural plants.

(c) In vitro culture could also ensure high level production of secondary metabolites.

Basic Strategies for Secondary Metabolite Production:

Callus, a homogenous mass of undifferentiated cells can be obtained from all parts of the plant body. In culture, callus can be obtained by placing explants onto a growth supporting media. Generally, callus-inducing media is supplemented with either auxin alone or in combi­nation with low or equal concentration of cytokinin. Auxins such as 2, 4-D, IAA, NAA can yield substantially better results.

The process of cell differentiation occurring in the plant is reversed and the explant tissue becomes dedifferentiated. In vitro raised callus generally exhibits two types—Nodal and Friable types. Friable nature of callus contains loosely aggregated cells which are useful for the production of secondary metabolites. Friable nature can easily transform callus into suspension culture.

Friability of the callus is due to neutralization of galactoside carboxyl group, which reduces the possibility of cross linkage between polysaccharide chain and unequal esterification of the carboxyl groups. It is possible to enhance friability by creating folic acid deficiency in culture medium and increasing vitamin B12 concentration. Callus sys­tem has been exploited for the production of secondary metabolites.

Callus culture of saffron and capsaicin, established on Murashige and Skoog medium produced high level of these metabolites. Similarly, the possibility of steroidal sapogenins production upto 2% was noticed in undifferentiated cultures of Diascoria deltoidea. But differen­tiation of organs results in the decrease of the sapogenins in culture. Insecticidal compound pyrathrine was produced successfully in the callus culture of Chrysanthemum cinerarifolium.

Biosynthetic ability of flavour imparting compound thymol in the callus culture of Carum copticum was found to be greatest in the semi-organized cultures than in unorganized cultures. On several occasions however, alkaloid formation takes place in the shoots regenerated directly from the plant without the callus.

Initiation of Suspension Culture from Callus:

Suspension culture is the mass of free cells or cell clumps in liquid medium. It is gener­ally obtained by transferring the friable callus into agitated media of the same composition as that used for callus growth. Initially, callus is cut into small pieces and transferred into the medium. Generally, large callus inoculum is advantageous as it ensures sufficient release of free cells or cell clumps into the liquid medium. Presence of cell clumps and high cell density facilitates cell to cell contact.

Agitation in one form or the other has been used to facilitate fragmentation of the cell groups and helps in diffusion of metabolites and oxygen. The agitation rates on orbital shaker should be in the range of 30-150 rpm with an orbital motion strike of 2-4 cm. However, plant cell culture requires 90-120 rpm for most of the species (Fig. 12.2). In order to procure fine suspension culture, frequent sub-culturing is indispensable into the fresh medium.

Presence of large cell clumps can be removed by pipette or syringe of suitable orifice diameter to exclude large cell aggregates. Some of the callus types such as nodular or compact callus do not readily breakup to form suspension. It is also possible to increase friability of the callus by repeated subculture. On several instances cell suspension culture was employed as a sole strategy for enhanced production of secondary metabolites.

Types of Suspension Cultures:

It is a type of suspension culture in which cells are grown in fixed volume of the nutrient medium. In most of the batch cultures, volume of the suspension is maintained between 250 mL and 10 L (Fig. 12.2). Increase in the density of the cell suspension is an indication of in­crease in biomass. Cell division and growth continues until the nutrient or oxygen controls the cessation of the cell growth.

The growth kinetics of cells in suspensions undergoes four phases of growth cycle, (a) Lag phase — in which cells prepare to divide, (b) Exponential phase — in which rate of cell division attains maximum, (c) Linear phase — in which reduction of cell division takes place, (d) Stationary phase — where the number and the size of the cells remains constant.

A lag phase is the beginning or the initial phase of the growth cycle. This phase is sometimes crucial for the synthesis of certain specific metabolites. This is followed by the exponential phase, where rapid cell division proceeds resulting in increased biomass. After few cell genera­tions (2-3) growth rate is retarded in linear phase. The last and final stage is the stationary phase during which cell dry weight is reduced. Sub-culturing is followed regularly for every 2-3 days in exponential phase (Fig. 12.1).

(ii) Continuous Culture:

The cells in suspension culture can be maintained for a considerable period of time by replacing with fresh media and cell population. There are two types of continuous culture sys­tems — closed continuous and open continuous culture systems. In closed continuous culture system, the spent medium in the culture vessel is removed and outflow is balanced by inflow of fresh medium.

The cells from outflowing medium is retained and pushed back into the culture. The cell biomass increases continuously in this system. In open continuous culture, inflow of fresh medium is balanced by outflow of spent medium of the same corresponding volume. The cells are harvested and replaced by fresh batch of cells.

One of the advantages of this system is that cell cultures are maintained indefinitely at a constant maximum growth rate. The open continuous culture system is again divided into chemostat and turbidostat. In chemostat, growth and cell density are maintained constantly by fixed rate of input of growth limiting elements like nitrogen and phosphorous.

In turbidostat, inflow of fresh medium takes place in response to increase in turbidity, thus facilitating continuous maintenance of culture at a fixed optimum density of the suspension. The growth of cell suspension culture may be monitored by measure­ment of one or more of the parameters such as packed cell volume (PCV), cell number, wet and dry weight, protein and DNA content and medium conductivity.

Determination of cell density by PCV method involves transfer of a known volume of suspension to 15 mL of graduated centrifuge tubes and spin for 5 min at (200 × g). PCV is the volume of cell pellet and is usually expressed as percentage of the cell numbers in suspension. The cell number in suspension may be counted directly by haemocytometer.

Bergamann Cell-Plating Technique for Single-Cell Culture:

Embryogenic cell suspensions are potential source for the production of several fine chemi­cals and offers large-scale clonal propagation. Thus, it is desirable to produce single cell clones for useful purposes. The technique of single cell culture was shown by Bergamann in 1960, where cell suspensions are initially plating out on agar plate. The technique involved counting of cells from suspension culture in order to adjust density by dilution of the suspension culture.

Equal volumes of agar medium of appropriate temperature (35°C) and suspension are mixed and dispersed into the petri dish and uniform distribution of cells are ensured. The suspension is filtered through a sieve and fine suspension is plated accordingly. The sealed dishes contain cells which are incubated at 25°C for 21 days. The number of cell colonies formed in dishes is counted by photographic document.

Factors Affecting the Production of Secondary Metabolite Production:

Genetic sources of plants have been implicated in the productive level of secondary metabolites. It has been proved that certain plants known as high-yielding cultivars can produce high amount of secondary metabolites in culture as shown in Catharanthus roseus.

Similarly, high-yielding tobacco in culture, accumulated increased level of nicotine than cultures derived from low-yielding cultivar. Therefore, it is possible to recover high amount of fine chemicals from high-yielding plants irrespective of explant source.

Although formulations of Murashige and Skoog’s (1962) medium were originally designed for rapid growth of tobacco, it is widely employed even for secondary metabolite production. This medium does not support metabolite production despite its role in rapid growth of the tissue. Secondary metabolite production is generally accomplished by two types of media.

One is growth medium, which encourages rapid growth of the cells leading to increased biomass and, second one is production medium, which induces production of secondary metabolites. Zenk was one of the first persons to use a two-stage culture, in which growth and production medium was combined for the culture of several plants.

In the production of shikonin, a particular MG-5 growth medium from Linsmayer and Skoog (1965 LS medium) was designed and M-5 production medium derived from White’s medium by enhancing the concentration of the nutrients in each medium. A similar success was also noticed in the production of barberine by using two stage cultures.

The composition of the macro-elements of the media can control secondary metabolite production. Several media like Linsmayer and Skoog (1965) and Gamborg (1968), which were originally designed for cell growth, have been modified extensively to suit successful production of secondary compounds. Shikonin was not produced on LS medium, which was originally designed for cell growth.

However, shikonin production was noticed once the cells were transferred onto the White’s medium. Suppression of shikonin production on LS medium is probably due to the presence of high level of NH4, whereas, White’s medium is devoid of NH4, supported shikonin production. It was however shown that removal of NH4 from LS medium could support shikonin production.

In addition to ammonium as the limiting factor, direct reduction of other media components such as nitrate and phosphate results in the production of secondary metabolites. For instance, production of ajmalicine and serpentine occurs when phosphate level is reduced in the medium. Similarly, a spice compound capsaicin is produced when nitrogen level is lowered in the medium.

Culture vessel or bioreactor containing appropriate level of cell density, stimulates sec­ondary metabolite production. The maximum cell density is accomplished when the tanker filled with cells, i.e., 30—120 g dry weight of cells is being packed in 1 L of the bioreactor. Most of the culture shows maximum cell yield of about 15 g per litre. This cell filling culture can be exploited commercially.

The successful cell filling technique with maximum cell density is pos­sible only when adequate agitation is pressed without cell destruction, sufficient oxygen and continuous supply of nutrients. The cell density upto 70 g dry weight per litre was possible by adopting the above parameters. Increased aeration causes the cells to attach to the upper part of the bioreactor wall. In order to control this, the aeration rate must be manipulated and kept low by mixing oxygen with aeration gas.

Production of secondary metabolites in vitro culture is due to the cell multiplication and division. This process invariably requires growth regulators. Participation of growth regulators in metabolite production is well documented in vivo. There are several instances of in vitro culture in which secondary metabolite is produced under the influence of growth regulators.

In the suspension culture of Papaver bractiatum, efficiency of different auxins was compared for Thebaine production. Auxin like IAA was found to be superior to NAA and 2, 4-D in culture for the production of anthoquinine. NAA was found to be highly beneficial whereas, 2, 4-D has negative effect on its production.

Similar results on the poor performance of 2, 4-D was seen in the callus culture of Nicotiana tobaccum for the production of nicotine and anabasine, which was successful with IAA supplied medium. At this juncture it can be concluded that 2, 4-D is a poor candidate in inducing secondary metabolite production. The possible reason for 2, 4-D’s poor response in culture is due to the lower pools of glutamate and aspartate.

After IAA, another ideal candidate NAA, exhibits good response in the production of nicotine. Barring few instances of involvement of cytokinins in inducing accumulation of steroidal sapogenins, reports are still scanty. Plant hormone like gibberellic acid (GA) facilitates diosgenin production in Diascorea cultures.

Efficacy of various carbon sources for secondary metabolite production has been tested. Among all carbon sources tested, sucrose is suited for most of the plants. Positive role of sucrose was noticed on nicotine production by tobacco callus. Glucose on the other hand acts as suitable carbon source for supporting secondary metabolites production.

In tissue culture, low radiant level of broad spectrum quality not only controls various morphogenesis but also influence secondary metabolite production. Several enzymes, which are involved in the biosynthetic pathways leading to the production of cinnamic acid, coumarins, flavanols, chalcons and anthocyanins are controlled by light. For instance, increase in the activ­ity of enzymes of the flavanol pathway takes place when cells are exposed to light resulting in anthocyanin accumulation.

One of the active spectrum regions in blue light increases the activ­ity of phenyl ammonia lyase (PAL). The blue light induction of PAL and other enzymes after exposing parsley cell culture to cool white fluorescent light favours metabolite accumulation. Induction of polyphenol has been noticed in tea callus culture. In addition, continuous light illumination results in the accumulation of catechin and epicatechin in suspension culture.

Generally, tissue cultures maintained at 25°C favours overall growth. But, several evidences have shown that temperature alone can induce secondary metabolite synthesis. More than 100% nicotine accumulation takes place in tobacco seedling exposed to 21°C or 32°C. Differential effect of various temperatures were obtained in the alkaloid production in Peganum callus culture, in which 30°C favours callus growth whereas 25°C stimulates alkaloid accumulation in culture.

Specialized Strategies for the Production of Secondary Metabolites:

Supply of Precursors:

Although, plant cells are totipotent in carrying out secondary metabolic pathways, plant cells in culture generally shows low-level production of secondary metabolites when compared to the natural plants. Only scanty information is available on the exact factors which control metabolite production.

One of the in vitro constraints is that secondary metabolite pathways are blocked by one or more deficient intermediates. To overcome the lacuna, intermediates are supplied in culture media to set right the pathways. Timing of precursor supply is very important because precursor when fed initially may inhibit both cell growth and metabolite production.

Callus culture of Capsicum annum shows that the flavour component of capsaicin is synthesized from valine and phenyl alanine and also can be manipulated by low level of nitrogen and elimination of sucrose in the medium. Capsaicin production is further enhanced by supplying immediate precursors like vanillylamine and isocarpic acid.

Increased production of diosgenin is accomplished by feeding cholesterol (100 mg/L) to Dioscorea culture. Similarly, feeding of phenylalanine to the culture of Coleus blumei enhanced the production of rosemarinic acid. In all these classic examples, timing of precursor feeding has been found to be significant.

Elicitors are the triggering factors which can elicite the production of secondary metabolites. These are the substances originally derived from microorganisms and actively participate in secondary metabolism. Elicitors are of two types—abiotic and biotic elicitors. Abiotic elicitors are light and metallic co-factors and others. Certain particular wavelengths of the light (Ultraviolet (UV) has a significant influence in the induction of secondary metabolites, for example, flavon glucoside synthesis is most sensitive to UV light at wavelength below 300 nm.

Similarly, induction of anthocyanine takes place at the peak of 312 nm and 438 nm. Certain metallic co-factors such as gold, copper and silver are added into the medium which can induce secondary metabolite production by acting as abiotic elicitors. These metabolic co-factors can be a part of the enzymatic activity involving secondary metabolic pathways.

Most of the elicitor systems employed in culture systems are biotic elicitors, mainly fungal extractions. Biotic elicitors can elicite the production of phytoalexins in culture as part of a plant-defence mechanism against pathogens. Phytoalexins are a diverse group of compounds like isoflavonoids and phenylpropanoids.

Biotic elicitors are simply the extracts of fungi and fungal cell wall material, which are generally included in the medium. Soyabean cell culture when inoculated with the strain of Pseudomonas syringa, triggered glyeollin (phytoalexin) production. Addition of culture filtrate of micromucor to the cell culture of Catharanthus roseus enhances tryptomine biosynthesis.

Elicitors are also probably involved in controlling gene expression. As a result, increased level of enzyme production can stimulate the synthesis of compounds which are new to the cells. Fungal elicitors when supplemented into tobacco cell suspension result in the induction of sesquiterpenoids, like capsidiol.

Imposition of stress on the cell culture triggers secondary metabolite production. Accumulation of indol alkaloids takes place by supplementing a stress hormone abscisic acid into the suspension culture of Catharanthus roseus.

Designing of Bioreactors:

Maintenance of cell suspension culture for considerable period of time essentially requires certain facilities such as aeration, monitoring of O2 et Cie2 level and replacement of spent media. Continuous culture system generally fulfills all the conditions essential for long-term maintenance. It is however indispensable to design a suitable bioreactor convenient for cell growth and production of secondary metabolites.

Some of the commonly used bioreactors available for large scale culture of cells are stirred tank bioreactors. Several types of stirred tank bioreactors including low-speed tank minimize cell damage and degradation during culture. Modified version of stirred tank like air lift bioreactor has been found to be well suited for plant cell growth (Figs. 12.3 and 12.4) depending on air lift loop vessels have several advantages like low shear, proper mixing of cells, no sedimentation and minimal cell lysis.

Fujira and Tabota (1987) designed two culture tanks suitable for the culture of Lithospermum erythrorhizon for the production of shikonin. Although paddle impeller supports cell growth of Lithospermum, the average yield of shikonin was found to be lower than in the regular flask culture.

Increase in rotatory speed of the impeller reduces shikonin production. Rotary drum tank was designed to overcome this constraint and was successful in the culture of Lithospermum. One of the key advantages of rotary drum cultures is low injury to the cells due to its gentle mix by the revolution of the tank. As a result, cells are adhered to the wall of the tank.

Imprisonment of plant cells for secondary metabolite production has several advantages. This can be used to prolong production phase and thus total product yield has been achieved. This newly designed strategy of cell immobilization can ensure rapid growth of cells in suspension and secondary metabolite production.

Entrapment of cells or tissue can be accomplished by variety of gel entrapment or encapsulation systems in which, different gel matrices like agar, gelatin, agarose, sodium alginate, cellulose and polysaccharides are em­ployed. Several simple and non-toxic materials such as sodium alginate, polysaccharide, agar agar and xanthan gum are used for cell immobilization.

The technique is simple, cheap and gives high surface area to the volume ratio. The cells or cell aggregates can be imprisoned within the inert matrix, permitting easy flow of liquid media across the cell. Capsaicin produc­tion by immobilization of cells and placental tissue of Capsicum annum was compared and analyzed that immobilized placental tissue exhibits greater potential for capsaicin synthesis than immobilized cells.

Placental tissue is the site of capsaicin synthesis. Addition of elicitors, curtlan, was effective on capsaicin production in immobilized cells. In addition, several cell cultures of Catharanthus rosues, Morinda citrifolia and Daucas carota have been successfully immobilized by polyurethane and polyester.

Several bioreactors have been designed for accumulation of immobilized cells in gel ma­trix. Utility of fluidized flatbed system is effective in maintaining entrapped cells. The modified version of flat-bed system is column culture in which vertical reservoir containing nutrient solution and culture vessel enclosed entrapped cells. The nutrient media present in the reser­voir is sprinkled on entrapped cells by drop arrangement (Fig. 12.5).

Several advantages are associated with immobilization of cells for the production of sec­ondary metabolites. Immobilization of cells increases cell to cell proximity, communications and cell to cell interactions. This is possible during adhesion of cells after division. Variation of cell shapes in terms of the size and number shows heterogeneity of culture system and science of organ initiation or pro-embryoid occurring in foam-immobilized culture.

Other advantages are the release of products into the medium instead being retained within the cells. Removal of secondary metabolites for analysis is possible without any constraints. Therefore, immobilized cell techniques are preferred over other methods for the basic investigations of product biosynthesis and manipulation without affecting cultural system. In addition, the production of H2 gas as a fuel has been analyzed by immobilization of cyanobacterial cells.

Biotransformation is one of the major thrust areas of biotechnological applications of plant cell and tissue culture. It is the production of the valuable products by plant cells in culture from cheap precursors which cannot be transformed by chemical or microbial systems. In addition, it is a novel approach to synthesize the substance of unknown structure and exhib­its new pharmaceutical properties in cell culture.

There are two methodological approaches followed in biotransformation. One is to obtain novel compounds from substrates that are not normally available to the plants or products from other species. The second approach is to transform natural intermediates of important plant products.

One of the most classic examples and widely proven potential is the biotransformation of cardenolides, is of special pharmaceutical consideration because of glucosides which are widely used in medicines for heart disease. Digitoxin and digoxin are the two important pharmaceuti­cal compounds extracted from Digitalis lanata.

Therapeutically digoxin is superior to digitoxin. D. lanata, however, contains high level of digitoxin. Digoxin is different from digit oxin only by a hydroxyl group at C12 region. Biotransformation of digitoxin to digoxin takes place by cell culture of Digitalis to several products. Some of which are hydroxylated at C12 and produces digoxin.

The Digitalis lanata cell culture strain 291 cultivated in air lift bioreactor was found to be effective in the conversion of P-methyl digitoxin into p-methyl digoxin. In addition, ability of some cultures of D. lanata to effect glucosylation, hydroxylation and acetylation were estab­lished. Several examples of biotransforming cited in the cell culture are listed in Table 12.3.

Immobilized cells are used to bio-transform chemical substrates in the production of use­ful compounds. Immobilized cells exhibit more stability and inflict biotransformation more efficiently than cells in suspension system.

The efficiency of biotransformation still needs to be investigated due to lack of preliminary knowledge of biosynthetic pathways and its related enzymes involved. However, many bio-transformations using plant cells that have potential industrial applications are hydrogenation, hydroxylation and hydrolysates.

The potentials of hairy root cultures from plant transformation by Agrobaderium rhizogens for the biosynthesis of secondary metabolites have been well documented. Hairy roots can be produced by incubating a piece of plant tissue in Agrobacterium rhizogens solution. Transfor­mation takes place due to the transfer of T-DNA from bacteria into the plant cells.

The Ri plasmid of A. rhizogens contains auxin-related genes in T-DNA. The successful integration of T-DNA inside plant DNA resulted in the expression of auxin-related genes and consequently, over production of IAA. As a result, numerous hairy roots are induced from the explant. Several examples on the secondary metabolite production by hairy root culture have been reported.

Production, accumulation and release of nicotine and nicotine-related alkaloids are facilitated by hairy root culture of Nicotiana rustica and the accumulation of betacyanine and betaxanthin in Beta vulgaris. There have been reports on the production and secretion of novel therapeutic protein using hairy root culture. Hairy root cultures are novel possible poten­tial sides for the synthesis and easy secretion of recombinant proteins. Thus, avoiding expen­sive downstream processing.

Altered DNA Methylation:

Role of DNA methylation in the regulation of gene expression has been established. Hypermethylation decides the nature of expression of genes. Hypomethylations are believed to be involved in hypergene expression. Synthesis of secondary metabolites involves participation of several enzymes in these pathways.

Any interference in their production may hinder the synthesis of metabolites. There have been reports on the enhanced production of secondary metabolite by hypomethylation process. Azacytidine is used as an effective chemical in cell culture for the induction of DNA hypomethylation.

Regulation of Secondary Metabolic Pathways:

The current knowledge about the regulation of metabolic products in plant cell culture is scanty and available only in few examples like:

(a) Influence of media on secondary product,

(b) Role of key enzyme for the regulation of secondary product,

(c) Degradation of secondary product and

(d) Inhibition of synthesis.

Concept on two-step culture has been implicated in microbial system. In plant cell culture proposal on two-step culture media was found to be suited for secondary metabolite production. As described earlier, first media is meant for cell growth and the second media for secondary metabolite induction.

The real breakthrough in the metabolite production is achieved when nitrate or phosphate or both are reduced in the media. Downsizing of sugar concentration can have greater influence on secondary metabolite production. Phytochemical production in Catharanthus rosues and Nicotiana tobaccum was achieved by employing induction medium, in which both phytohormones and inorganic phosphates are totally removed from the medium.

It was conceded that copper in the medium has no influence on growth. But, its concentration several times stronger than in White’s medium can induce shikonin production at increased rate. The dependency of the secondary metabolite production in the requirement of phytohormones has not been characterized. In some instances, high doses of growth factors can increase the production of secondary metabolite.

The role of certain enzymes in the regulation of secondary compound production cannot be ruled out. The production is correlated with the activity to enzyme that links primary and secondary metabolic pathways. Gene-cloning technique has laid a foundation in understanding regulatory activity of enzymes. One of the best studied examples of regulation of secondary metabolism in plant cell culture is the induction of enzymes catalyzing the synthesis of isoflavanoids and flavanoids.

In the cell culture of Glycine max flavanoids are induced by spontaneous process or light. Similarly irradiation by ultraviolet can decide accumulation of flavons. In addition, certain enzymes like phenylalanine ammonialyase (PAL) activity to be a crucial factor in the regulaton of secondary compound in several plants.

Degradation of secondary compound is a major factor determining alkaloid content of the plant. It was able to show that quinolizidine alkaloid in the cells and medium of Lupins cell cultures are subjected for fast turnover and probably regulated by light. Regulation of secondary compound sterol production was revealed by the use of sterol inhibitor when a particular enzyme in the pathway is blocked.

Some plant bioregulatros exhibit their effect on plant growth by interfering with gibberellic acid biosynthesis. For example, 2-chloroethyl, 1-trimethylammonium chloride known to inhibit the cyclization of geranyl-geranylpyrophosphate. They also show activity on triterpenoid metabolism and carotenoid metabolism.


Metabolite

That’s because the technology needed for observing their colorful neuronal responses already exists, but the technology necessary for mimicking neuronal binding to flying molecules—the chemical sensors to detect our metabolite s—is yet to be created.

Intriguingly, ATP is a very abundant metabolite in cells, with a typical concentration of 3-5 millimolar.

The root microbiome delivers many of its metabolite s to a plant’s roots as well as minerals, other nutrients, and beneficial compounds found in the soil.

That suggests mom shares her gut metabolite s with her young.

“Those metabolite s … have an aroma and a flavor,” says Kate Howell, a biochemist at the University of Melbourne in Australia.

The chief metabolite is undoubtedly carbonic acid, and this diffuses very rapidly and is quickly carried away by the blood.


Systems Cell Biology

Résumé

Metabolomics a powerful tool for hypothesis generation in biology and it has developed rapidly becoming widely accepted as a standard approach to many problems. Initially, metabolomics was ‘sold’ as a hypothesis free technique to answer questions you do not even know to ask. Fifteen years later although still an active area of research, it has matured. Most practitioners of metabolomics see it as another tool that can be used to help solve significant biological problems. Metabolomics requires a rigorous and multidisciplinary approach to be carried out successfully. In the following article many of the issues and possible solutions are highlighted.


Metabolism: Definition & Methods | Organic Processes | Organism | La biologie

In this article we will discuss about:- 1. Introduction to Metabolism 2. Definition of Metabolism 3. Methods.

Introduction to Metabolism:

The different food materials (mostly complex and unsuitable for absorption) are transformed into their simple and soluble form by digestion prior to the entry from the lumen of the intestine into the body through its gateway (absorption).

After their entry into the body, they undergo a series of biochemical reactions in different organs catalyzed by enzymes, coenzymes, catalysts, and governed by hormones and vitamins to serve the following purposes:

je. Synthesis of many specialized substances for the organization of these substances into the types of charac­teristic protoplasm of different varieties of cells and tissues forming up the organism, resulting develop­ment growth and maintenance of a living organism. Those reactions which are included in the process of synthesis of larger protoplasmic molecules from lower ones for building up tissues are collectively known as synthesis or anabolism.

ii. Production of energy required for the protoplasmic synthesis and other process of the body, viz., main­tenance of temperature, movement, and generation of electrical potentials, the secretion and excretion of fluid and transport of substances against concentration gradient. Those reactions which are included in the process of breakdown of large protoplasmic molecules to smaller ones for the supply of energy are collec­tively called analysis or catabolism.

Definition of Metabolism:

Thus the term metabolism of a food substance is meant by a series of specific biochemical reactions occurring within the living organism from the time of its incorporation into the cell or tissue till its excretion, of which some are concerned with tissue synthesis and others with tissue breakdown what are termed as anabolism and catabolism respectively. Although both anabolism and catabolism are reversible biochemical reactions but growth and loss of tissue mass (breakdown of tissue) depends on predominance of one over the other opposite reaction.

Methods of Metabolic Study:

The chemical reaction of the tissue is so numerous and fast that the study of these reactions, either individual or overall pictures of these reactions had been encountered with much difficulty due to lack of suitable equipment and methods in the past.

But recent advancement in researches in the field of development of different techniques and methods at modern times, it has been possible today in unfolding the total picture of metabolism.

The general principles of the different methods employed in the study of metabolism are as follows:

je. Study of the Metabolic Process:

Few steps in the path of metabolism may be known by the biochemical analysis of body fluids of patients suffering from diseases either congenital or acquired whose metabolic reactions checked or inhibited or deviated abnormally without passing to its final end products, e.g., Diabetes mellitus, ketosis, alcaptonuria, give some information of glucose, fat and protein metabolism respectively. These abnormal metabolic conditions may be produced experimentally in animals and the results may be confirmed.

ii. Study of Metabolism by Arresting Few Metabolic Steps with Certain Metabolic Poisons:

This is an important method of studying the breakdown of fatty acids (vide oxidation of fatty acids.)

iii. Study of Metabolism under the Influence of Endocrines:

This may be observed by extirpation of the gland and introduction of the hormone, and the results are compared and confirmed with the picture obtained in diseases suffering from hypo-activity and hyperactivity of the gland.

iv. Study of Different Organs in Determination of Site of Reaction:

(a) Extirpation of liver (by Mann et al), spleen or other viscera and noting the consequent effect on general metabolism or the metabolism of a particular administered substance.

(b) Perfusion of isolated organs with a solution of the test material and to note to changes therein.

(c) Incubation of the test solution with thin slices of the organ or with the minced tissues of the organ.

(d) Fistula preparations with the purpose of bypassing an organ, such as Eck’s fistula in which communication is established between portal vein and inferior vena cava. The portal blood directly drains into inferior vena cava and liver is by-passed. With this preparation, the role of liver on the metabolism of many substances can be studied.

(e) Angiostomy experiments. Insertion of cannulae into suitable blood vessels through which blood can be withdrawn as well as a test solution can be easily injected. Dogs with such cannulae in the hepatic, portal and renal veins have survived normally for many months.

v. Feeding Experiments:

(a) This is done by altering the quality and quantity of foodstuffs, vitamins, minerals etc., and observing the consequent metabolic changes.

(b) Administration of all theoretically possible intermediate compounds of a substance, to animals, and to see whether such compounds are metabolized in the same way as the parent substance itself. In this way the intermediate stages of metabolism of a substance may be found out.

vi. Biochemical Changes:

Study of biochemical changes of blood, urine, faeces, tissues, organs, etc., is also valuable, particularly in accompaniment with other metabolic experiments.

vii. Study of Basal Metabolic Rate (B.M.R.):

Study of basal metabolic rate (B.M.R.), respiratory quotients (R.Q.) nitrogen equilibrium, specific dynamic action, etc.

viii. Application of Isotopes:

The latest advancement in the study of metabolic processes is the application of natural and radioactive isotopes. Compounds to be studied, is labelled or marked by replacing it’s one of the element by isotope and administered. The changes undergone by such ‘labelled’ compounds, their migration from place to place and finally their excretion from the body are observed with the help of suitable instruments and by other physio-chemical methods.

Since isotopes are treated by the tissues in the same way as their normal homologue, this process is extremely valuable for metabolic studies and all disadvantages of metabolic studies can be overcome with isotopes. Natural isotopes remain as mixtures in all natural sources and can be isolated by careful fractionation. Radioactive isotopes can be estimated by the electroscope or the Gieger-Muller counter, that is, those instruments which can detect radiations.

Stable or partial stable compounds have been prepared by replacing the relevant atoms with the corresponding natural or radioactive isotopes respectively (as and when required) and have been extensively applied in the study of a absorption, metabolism and excretion of proteins, fats, carbohydrates, salts, water and hormones, etc.