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Dois-je utiliser du saccharose pour induire un promoteur lac ?


J'aimerais optimiser l'expression d'un Fun B fragmenter dans Escherichia coli. Pour l'induction de la lac promoteur sur le vecteur pAK400 J'utilise IPTG et saccharose. Est-ce que j'optimise l'expression au cas où j'ajouterais simplement IPTG ?


Vous pouvez induire l'opéron lac par deux choses : le lactose (ou plus précisément l'allolactose un métabolite de celui-ci) et les analogues du lactose qui ne sont pas métabolisés par les bactéries.

Le lactose induit l'expression et est métabolisé alors que l'IPTG n'est pas une cible de la $eta$-galactosidase et vous procurera une induction forte et permanente. Le saccharose n'aura aucun effet sur le promoteur.


T7 et DH5 alpha - Aidez-moi à clarifier certaines choses (Fév./04/2010 )

Bonjour!
Je fais ma thèse de maîtrise et j'essaie de clarifier certaines choses pour que je les comprenne parfaitement. Maintenant, j'étudie le système d'expression T7. Si je comprends bien, l'ARN polymérase T7 est généralement incorporée dans le génome chromosomique sous le contrôle d'un opérateur lac commençant la transcription avec l'ajout d'IPTG. Ensuite, la polymérase trouve le promoteur T7 sur le plasmide et commence à transcrire l'ARNm à partir de ce site.

Cependant, j'ai lu quelque part que ma souche bactérienne, DH5 alpha, ne porte pas son propre gène d'ARN polymérase T7, et que celui-ci devrait être présent sur le plasmide et avoir besoin d'être transformé. Est-ce vrai? Je soupçonne que non, car je ne peux pas voir que mes plasmides (pTZ19R et pSE420) contiennent une telle chose. Pourriez-vous m'aider à clarifier les choses?

Ce que vous lisez est correct. La plupart de l'expression de T7 se fait dans des souches de bactéries qui ont été lysogénéisées avec le phage DE3, portant l'ARN polymérase T7 sous le contrôle du promoteur lac. DH5a n'a pas cela. Habituellement, les souches ayant cette modification sont indiquées dans leur nom, telles que BL21 (DE3). La raison pour laquelle DH5a ne porte généralement pas cette modification est qu'elle est médiocre pour l'expression des protéines, car elle contient toujours la protéase lon, qui a tendance à dégrader les protéines exprimées. La souche BL21 est assommée pour cette protéase et d'autres.

Vous pourriez certainement porter le promoteur lac et le gène de l'ARN polymérase T7 sur un plasmide (le même ou un co-transformant) dans DH5a. Peu de gens le font, car ils se soucient de l'expression des protéines qui en résulte.

Merci pour votre réponse! J'espérais que je me trompais pour qu'elles aient plus de sens. Je suis retourné à ma source d'origine et ils clonent mon gène dans un vecteur d'expression pTZ19R et se transforment en DH5a pour l'expression. Si DH5a est une souche à faible expression génique, pourquoi quelqu'un voudrait-il faire cela ? Et comment se passe l'expression s'il n'y a pas d'ARN polymérase T7 ?

J'ai essayé de faire des recherches sur le sujet maintenant, mais tout cela me rend encore plus confus. J'ai trouvé ceci dans un document d'information Invitrogen :
Important : DH5α E. coli n'a pas besoin d'IPTG pour induire l'expression du promoteur lac, même
bien que la souche exprime le répresseur Lac. Le nombre de copies de la plupart des plasmides dépasse
le nombre de répresseurs dans les cellules. Si vous êtes soucieux d'obtenir des niveaux maximaux de
expression, ajouter IPTG à une concentration finale de 1 mM.

Ma source d'origine ne mentionne pas du tout l'IPTG, et j'ai supposé que c'était parce qu'ils ne voulaient pas donner toutes les informations sur la production de la protéine, mais peut-être qu'ils ne l'utilisent tout simplement pas ?

Aussi, j'ai remarqué que j'obtiens des résultats plus clairs sur ma SDS-PAGE en utilisant une méthode impliquant PMSF. L'opinion de mes superviseurs est que ce n'est pas nécessaire, mais je suppose que cela bloquerait la protéase longue et aurait une sorte d'effet? Je vais probablement faire d'autres tests là-dessus, juste pour mon amusement personnel.

D'accord, je ne fais que babiller avec mes questions, mais les premières sont les plus importantes. Où est la polymérase ?

Le plasmide pTZ19R a A LA FOIS un promoteur lac et un promoteur T7 en amont de son site de clonage multiple. Dans une souche LacI-, cela s'exprimera à partir du promoteur lac, n'ayant rien à voir avec le promoteur T7. Le promoteur T7 est là pour permettre l'expression dans une souche BL21 (DE3). Si je me souciais de la protéine, je sous-clonerais dans BL21(DE3) et induirais avec IPTG, puis (comme vous le faites) purifierais en présence de PMSF, bien que cela soit moins important dans les souches BL21.


Systèmes d'expression T7 pour la production inductible de protéines à partir de gènes clonés dans E. coli

Les systèmes d'expression inductibles de T7 sont capables de produire une large gamme de protéines dans E. coli. Les améliorations par rapport à la pratique courante comprennent : (1) la prévention de l'induction involontaire en établissant et en maintenant des souches d'expression dans des milieux de croissance non inducteurs composés entièrement de composants purifiés au lieu de milieux de croissance complexes qui peuvent induire de manière variable des protéines cibles à l'approche de la saturation et (2) l'expression de plusieurs cibler les protéines en parallèle par une auto-induction pratique et productive dans BL21(DE3) et d'autres hôtes appropriés, au lieu de l'induction IPTG. Dès les premiers jours, l'expression basale a empêché l'établissement de souches inductibles pour produire des protéines stressantes pour l'hôte. Les vecteurs pAL nouvellement développés réduisent maintenant l'expression basale à des niveaux où les séquences codantes pour les protéines les plus stressantes peuvent être maintenues et induites. La ligature asymétrique permet un clonage simple et efficace de séquences codantes individuelles ou le clonage simultané de deux ou trois séquences codantes pour la co-expression à partir d'un seul vecteur pAL. © 2018 par John Wiley & Sons, Inc.


Résultats

Ingénierie de Synéchocoque 2973 pour la production de saccharose

Pour concevoir un exportateur de saccharose Synéchocoque 2973, la perméase de saccharose cscB gène a été cloné dans un site neutre 3 (NS3) ciblant le plasmide 17, qui a ensuite été introduit dans Synéchocoque 2973 par conjugaison bactérienne (Fig. 1B). Une souche entièrement isolée a été obtenue en re-patchant les plaques plusieurs fois, et la modification du génome corrigée a été confirmée par génotypage PCR (Fig. 1C). Pour tester la production de saccharose dans Synéchocoque 2973, le 2973-cscB (tableau 1) a été cultivée dans BG11 avec 100-200 mM de NaCl (Fig. 2A). IPTG (1 mM) a été ajouté pour induire cscB l'expression du gène. Les surnageants ont été collectés pour l'analyse du saccharose. Le titre de saccharose le plus élevé, 8 g L -1 en 5 jours, a été observé dans BG11 avec 150 mM de NaCl. La productivité volumétrique la plus élevée était de 1,9 g L -1 jour -1 en 4 jours, ce qui correspond à un rendement en saccharose de 3,1 g.g -1 de biomasse cellulaire. Cette productivité est plus de 2 fois supérieure à celle de la souche étroitement apparentée Synéchocoque 7942 (Fig. supplémentaire S1). Le pH du milieu était plus bas dans des conditions productrices de saccharose car les protons sont exportés avec le saccharose par le symporteur CscB saccharose/H + (tableau supplémentaire S1). De plus, nous avons observé que le stress salin entraînait une altération de la croissance des Synéchocoque 2973 (Fig. 2B), conduisant à une diminution de la DO730 valeurs à mesure que les concentrations de NaCl augmentaient.

Production de saccharose en cscB-exprimer Synéchocoque 2973. (UNE) Évolution dans le temps de la production de saccharose dans le cscB-exprimant la souche en milieu BG11 avec différentes concentrations de NaCl. (B) OD730 du cscB-expression de la tension. (C) Partage du carbone entre le saccharose et la biomasse cellulaire (BG11 avec 150 mM de NaCl). () Production de saccharose dans différentes conditions de culture avec 150 mM de NaCl (5 jours). Le WT Synéchocoque 2973 a été inclus comme contrôle. Les données représentent la moyenne ± écart-type de trois répétitions biologiques. ND, non détecté.

Pour étudier la quantité de carbone fixé par photosynthèse dirigée vers la production de saccharose dans des conditions de stress salin, nous avons analysé la partition du carbone entre le saccharose et la biomasse cellulaire (Fig. 2C). Au cours des 24 premières heures de croissance, 71 % du carbone fixé (0,8 g L -1 ) a été utilisé pour la synthèse de biomasse cellulaire, et seulement 0,3 g L -1 de saccharose a été produit pendant cette période. Du jour 1 au jour 4, le titre de saccharose a augmenté de façon spectaculaire. Au cours de chacun de ces jours, la productivité en saccharose était supérieure à 2 g L -1 jour -1 . La plus grande quantité de saccharose a été produite entre les jours 3 et 4, au cours desquels la productivité en saccharose a atteint 2,8 g L −1 . Après le jour 3, plus de 88 % du carbone fixé était dirigé vers le saccharose. Le titre a diminué au cours des jours 4 à 5, au cours desquels seulement 0,7 g L −1 de saccharose a été produit.

De plus, nous avons testé la capacité de production de saccharose sans ajout d'IPTG ou de l'antibiotique kanamycine. Sans induction IPTG, le 2973-cscB souche a produit 6,4 g L -1 de saccharose (Fig. 2D), ce qui est 21 % inférieur à celui dans des conditions induites par IPTG (Fig. 2A). Une étude récente a rapporté que les promoteurs inductibles de l'IPTG (trc, lac, et LlacO-1) fuient dans Synéchocoque 2973 18 . Nos données indiquent également que la lacUV5 le promoteur fuit dans Synéchocoque 2973. De même, le 2973-cscB souche a produit 6,6 g L -1 de saccharose sans addition de kanamycine (Fig. 2D). Bien que le cscB gène a été inséré dans le génome, ce résultat montre que la kanamycine est nécessaire pour maintenir une productivité élevée de saccharose dans Synéchocoque 2973.

Étude du métabolisme des glucides dans la production de saccharose Synéchocoque 2973

Après sa phase de croissance exponentielle, Synéchocoque 2973 accumule une quantité importante de glycogène pour réserver l'excès de carbone fixé 16 . Pour mieux comprendre la répartition du carbone entre le glycogène et le saccharose, nous avons analysé la teneur en glycogène dans le saccharose. Synéchocoque 2973 souche. Le 2973-cscB les cellules ont été cultivées dans BG11 avec ou sans NaCl 150 mM, et les quantités de glycogène et de saccharose ont été analysées. La biomasse cellulaire était 2 fois plus élevée dans le milieu BG11 sans addition de NaCl (Fig. 3A). En l'absence de NaCl, Synéchocoque 2973 n'ont produit que 0,4 g L -1 de saccharose en 5 jours, soit 19 fois moins qu'en présence du sel (Fig. 3B). En revanche, la teneur en glycogène a significativement diminué dans des conditions de production de saccharose. En présence de 150 mM de NaCl, le 2973-cscB souche a accumulé du glycogène à moins de 1% du poids sec des cellules (DW) pendant le jour 1 et le jour 3 (Fig. 3C). Au jour 5, la teneur en glycogène est passée à 10 % de DW, correspondant à 0,2 g L -1 de glycogène (40 fois plus faible que le saccharose). Sans addition de NaCl, les cellules ont accumulé du glycogène à plus de 40 % de DW après 3 jours (Fig. 3C). Ces observations ont en outre confirmé que le stress salin redirigeait les flux de carbone de l'accumulation de glycogène vers la production de saccharose dans cette souche modifiée.

Analyse du métabolisme des glucides dans Synéchocoque 2973 cscB-expression de la tension. Les cellules ont été cultivées dans du milieu BG11 avec ou sans addition de 150 mM de NaCl. (UNE) Accumulation de biomasse. (B) Production de saccharose. (C) Teneur en glycogène. () RT-PCR semi-quantitative pour le suivi de l'expression génique dans les synthèses de glycogène et de saccharose. Le gène du ménage rpoA a été utilisé comme témoin. Les nombres sous le gel représentent les intensités relatives des bandes d'échantillons croissant avec 150 mM de NaCl par rapport à 0 mM de NaCl. Les gels pleine longueur sont présentés dans la Fig. S2 supplémentaire. Les données des panneaux A à C représentent la moyenne ± écart-type de trois répétitions biologiques. DW, poids sec de la cellule rpoA, sous-unité de l'ARN polymérase.

Nous avons ensuite mené une RT-PCR semi-quantitative pour examiner la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse du glycogène et du saccharose, y compris glgC, glgA, et sps (Fig. 1A). GlgC (ADP-glucose pyrophosphorylase) et GlgA (glycogène synthase) sont les enzymes responsables de la biosynthèse du glycogène. Dans Synechococcus allongé, l'enzyme SPS possède à la fois des activités saccharose-phosphate synthase et saccharose-phosphate phosphatase 19 . Par conséquent, l'expression de la sps gène a été surveillé. Le gène du ménage rpoA (codant la sous-unité de l'ARN polymérase) a été utilisé comme témoin pour cette expérience de RT-PCR 20 . Niveaux de transcription de glgC et glgA n'étaient pas significativement différents avec ou sans addition de NaCl (Fig. 3D). En revanche, le gène de synthèse du saccharose sps était fortement exprimé dans des conditions de stress salin (Fig. 3D), suggérant que l'augmentation de la production de saccharose dans le milieu salin est due à une régulation positive de la voie de biosynthèse du saccharose.

Ingénierie de la voie de biosynthèse du saccharose

Chez les cyanobactéries, le stress salin est nécessaire pour induire la production de saccharose. Le gène de biosynthèse du saccharose sps est régulée à la hausse dans le milieu salin BG11 (Fig. 3D). Pour étendre les applications de la production de saccharose chez les cyanobactéries, nous avons conçu Synéchocoque 2973 pour produire du saccharose dans du milieu BG11 sans NaCl ajouté. La voie de biosynthèse du saccharose de Synéchocyste sp. PCC 6803 a été exprimé dans le 2973-cscB souche (Fig. 4A). On sait que la surexpression de la sps et spp gènes de Synéchocyste 6803 conduit à une amélioration de 2 fois de la production de saccharose intracellulaire dans des conditions de stress salin 14 . Pour exprimer le Synéchocyste 6803 sps et spp gènes dans Synéchocoque 2973, nous les avons clonés dans le plasmide auto-répliquant RSF1010 21 sous le contrôle d'un IPTG-inductible trc1O promoteur. Les plasmides exprimant soit sps seul ou sps-spp gènes ont ensuite été introduits dans le 2973-cscB souche (tableau 1). Les deux sps et sps-spp les souches de surexpression étaient capables de produire du saccharose dans du milieu BG11 sans NaCl supplémentaire (Fig. 4B). En l'absence d'IPTG, le sps et sps-spp souches ont produit 1,6 g L -1 et 3,4 g L -1 de saccharose en 3 jours, respectivement, ce qui était 11 fois et 23 fois plus élevé que le témoin 2973-cscB souche (Fig. 4B). Pour le sps souche, les titres de saccharose n'avaient pas de différence significative avec ou sans addition d'IPTG 1 mM. Fait intéressant, le titre de saccharose a diminué de manière significative lors de l'ajout de 1 mM d'IPTG dans le sps-spp souche (Fig. 4B), indiquant que l'induction complète de sps et spp l'expression peut être préjudiciable à la production de saccharose.

Ingénierie de la voie de biosynthèse du saccharose dans Synéchocoque 2973. (UNE) Schémas d'expression de la Synéchocyste 6803 sps et spp gènes dans le 2973-cscB souche. (B) Production de saccharose en sps et sps-spp souches d'expression. Les cellules ont été cultivées dans du milieu BG11 pendant 3 jours sans ajout de NaCl. Le symbole « + » indique que la souche contient la ou les enzymes surexprimées indiquées. Les données représentent la moyenne ± écart-type de trois répétitions biologiques. RBS, site de liaison du ribosome.


La sous-unité σ 70 de l'ARN polymérase induit lacPromoteur UV5-pause proximale de la transcription

La sous-unité σ 70 de Escherichia coli L'ARN polymérase (RNAP) est un facteur d'initiation de la transcription qui peut également être associé à la RNAP lors de l'élongation. Nous fournissons des preuves biochimiques que σ 70 induit une pause de transcription au lacPromoteur UV5 après que RNAP a synthétisé un transcrit de 17 nucléotides. La pause dépendante du 70 nécessite une interaction entre le 70 et une partie du lac séquence opérateur répresseur ressemblant à un promoteur -10 consensus. L'héparine polysaccharidique déclenche la libération de 70 des complexes en pause, soutenant l'idée que pendant la transition de l'initiation à l'élongation, les interactions entre σ 70 et le noyau RNAP sont affaiblies. Nous proposons que la liaison et la rétention de σ 70 dans les complexes d'élongation soient stabilisées par sa capacité à former des contacts avec l'ADN de la bulle de transcription. De plus, nous suggérons que la sous-unité 70 dans le complexe d'élongation peut fournir une cible pour la régulation de l'expression génique.


Embryonnaire

Klaus I. Matthaei, dans Handbook of Stem Cells, 2004

Lac bactérien Opéron

Les lac opéron dans la bactérie Escherichia coli fonctionne par un mécanisme de répression dans lequel une protéine inhibitrice (lacI) se lie à des sites régulateurs (lacO) dans le promoteur et désactive la transcription (Fig. 59-2). Lors de l'ajout de lactose, la protéine lacI subit un changement de conformation, ce qui modifie son affinité de liaison pour le lacO séquences. La protéine lacI se détache ainsi du lacO sites, et la transcription peut se produire. E. coli utilise ce système pour contrôler étroitement les gènes nécessaires à l'utilisation du lactose, et il est complètement réversible.

Illustration 59-2. Opéron lac bactérien. Les lac l'opéron fonctionne par un mécanisme de répression. (A) Une protéine inhibitrice, lacI, se lie aux sites régulateurs lacO dans le promoteur (P) et désactive la transcription des gènes nécessaires au métabolisme du lactose. (B) Lors de l'ajout de lactose, la protéine lacI subit un changement de conformation, ce qui modifie son affinité de liaison pour le lacO séquences. La protéine lacI se détache ainsi du lacO sites et transcription des lac des gènes peuvent apparaître. (A, transacétylase Y, perméase et Z, -galactosidase.)


Matériaux et méthodes

Xénope manipulation d'embryons

Xenopus tropicalis les embryons ont été obtenus par fécondation in vitro, décongelés dans 3% de cystéine et collectés aux stades souhaités. Des œufs fécondés ont été injectés avec 500 ng d'ARNm synthétique au stade 1 cellule et cultivés jusqu'à ce que les embryons témoins atteignent le stade 8. Des chapeaux d'animaux ont été explantés au stade 8 et cultivés jusqu'au stade 10,5 dans 0,1 × MMR. Les licences d'utilisation d'animaux ont été fournies par les permis DEC RU-DEC 2012-116, 2014-122 et l'approbation CCD AVD1030020171826.

ATAC-seq spécifique au stade et au tissu

Après le démultiplexage, les lectures ont été coupées à l'aide de fastp v0.20.1 (Chen et al, 2018 ) et aligné sur le X. tropicalis génome (xt9.0 et xt10.0) avec bwa-mem v0.7.17 en utilisant les paramètres par défaut. Les lectures cartographiées sur l'ADN mitochondrial ont été exclues de l'analyse ainsi que les lectures de faible qualité, y compris les répétitions et les doublons (MAPQ < 10). Toutes les lectures mappées ont été décalées de + 4 pb pour le brin + et de − 5 pb pour le brin -. Les pics ont été appelés pour chaque échantillon en utilisant MACS2 v2.2.7 (Zhang et al, 2008 ) avec les paramètres "-q 0.05 --nomodel –shift −100 --extsize 200 –keep-dup 1".

ATAC-seq à cellule unique

Les noyaux ont été isolés avec une méthode adaptée de Mariano (Mariano, 1964). Bref, 100 Xénope les embryons ont été suspendus dans 300 µl de tampon E1 glacé (110 mM de KCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM d'EDTA, 2 mM de DTT) contenant 0,25 M de saccharose. A l'échantillon, 2,4 ml de tampon El glacé avec 2,2 M de saccharose ont été ajoutés et mélangés doucement. La suspension d'embryons a ensuite été déposée sur un coussin de 150 ul de saccharose 2,2 M glacé dans un tube en polyallomère SW60 Beckman. Les noyaux ont été agglomérés par centrifugation à 130 000 g à 4°C. Le culot a été soigneusement remis en suspension dans 250 µl de tampon nucléaire (25 % de glycérol, 25 mM de Tris-HCl pH 7,4, 70 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 0,2 mM d'EDTA, 2 mM de DTT) et les noyaux ont été lavés deux fois en les faisant tourner à travers un coussin de 20 ul de glycérol à 80 %. Après le dernier lavage, les noyaux ont été remis en suspension dans 200 ul de tampon de noyaux 1x (10x Genomics). Les bibliothèques ont été générées à l'aide de Chromium Single Cell ATAC (v1.1 Chemistry 10× Genomics). L'appel de base, le démultiplexage et la cartographie ont été effectués à l'aide de cellranger-atac (v1.2.0, 10× Genomics). Les lectures ont été mappées sur le X. tropicalis génome (xt10.0), téléchargé depuis Xenbase (http://www.xenbase.org/, RRID:SCR_003280 Karimi et al, 2018 ). Les statistiques de séquençage et de cartographie sont présentées dans Dataset EV7. Les codes-barres avec une faible couverture de séquence (cellules avec < 1000 fragments de transposition), un faible enrichissement (enrichissement TSS < 4.5) ou une couverture chromosomique très variable (fragments uniques par Mbp, calculés par chromosome, coefficient de variation de la couverture chromosomique > 1) ont été exclus de l'aval une analyse.

Préparation et séquençage d'une banque d'ARN unicellulaire et d'ARN total

Les explants d'embryons disséqués ont été dissociés en cellules individuelles en utilisant des milieux sans Ca 2+ et Mg 2+ (Sive et al, 2007 ). 200 cellules ont été sélectionnées pour effectuer l'ARN-seq à cellule unique en utilisant la version modifiée du protocole STRT-seq (Islam et al, 2012 Dong et al, 2018 ) ERCC spike-in RNA (Thermo Fisher Scientific, 4456740) a été ajouté au tampon de lyse. Après la réaction de transcription inverse, nous avons effectué 4 + 16 cycles d'amplification PCR pour la synthèse d'ADNc. L'ADNc amplifié a été purifié avec le kit de purification Zymo et les billes Agencourt AMPure XP, respectivement, et sa concentration a été mesurée avec le fluoromètre Qubit® 2.0 (Q32866, Life Technologies). La qualité de l'ADNc amplifié et la distribution de la taille des fragments d'ADN ont été évaluées par Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) avec le kit High Sensitivity DNA (5067-4626, Agilent). Les bibliothèques de séquençage ont été préparées à l'aide du KAPA Hyper Pre-Kit (KR0961 – v6.17, Kapa Biosystems). Les concentrations des fragments avec les adaptateurs indexés approximatifs ont été quantifiées par la quantification de la bibliothèque KAPA. Les librairies ont été séquencées dans la plateforme Illumina et les données ont été mappées à l'aide de Bowtie (version : 1.2.2 Langmead & Salzberg, 2012 ) aux fichiers indexés du génome xt9 (cf. Dataset EV7).

L'ARN total a été extrait des coiffes d'animaux à l'aide de notre protocole hybride Trizol-Zymo adapté en interne. Les concentrations de tous les échantillons d'ARN ont été mesurées à l'aide du test DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay (numéro de catalogue : KIT-DSDNA-HIGH-1). L'ADNc a été construit en utilisant KAPA RNA HyperPrep avec RiboErase (numéro de catalogue : 08278555702, Kapa Biosystems). Nous avons vérifié la qualité des échantillons par RT-qPCR à l'aide d'amorces couvrant les régions codantes des gènes candidats et domestiques.

Analyse des données ATAC-seq

Analyse des données RNA-seq unicellulaires

L'ensemble de données a été filtré et vérifié pour les cellules et les gènes à l'aide du package Scater (McCarthy et al, 2017 ). L'ensemble de données filtré a ensuite été chargé dans le package R Seurat (Satija et al, 2015 ). Les gènes hypervariables ont été utilisés pour l'analyse en composantes principales, à partir de laquelle les PC statistiquement significatifs ont été utilisés pour la projection UMAP (réduction de la dimensionnalité). Nous avons identifié sept groupes distincts de cellules à l'aide de la fonction FindClusters dans Seurat. Sur la base des groupes prédits, les gènes marqueurs pertinents pour chaque groupe ont été prélevés pour une analyse plus approfondie avec d'autres ensembles de données. Traitement et visualisation des données de séquençage de l'ARN unicellulaire de l'embryon entier (Briggs et al, 2018 ) ont été réalisées avec scanpy (Wolf, Angerer & Theis, 2018 ). Des grappes unicellulaires AC et DMZ de stade 10½ ont été placées dans les données sur l'embryon entier sur la base des corrélations de Spearman entre les grappes des deux ensembles de données, sur la base de l'expression moyenne des grappes des gènes hypervariables communs aux deux ensembles de données.

Intégration d'ATAC-seq et d'ARN-seq unicellulaire

Les gènes hypervariables supérieurs (HVG) de l'analyse scRNA-seq ont été associés aux pics AC-DMZ ATAC-seq les plus proches en utilisant l'analyse GREAT (Fig. 5B et C). Ce modèle pic à gène comprenait une matrice, avec des lignes comme emplacements de pics et des colonnes comme valeurs d'expression des gènes cibles dans les sept groupes. Cela a été utilisé comme entrée de prédiction de motifs à l'aide de la fonction gimme maelstrom de GimmeMotifs (preprint : Bruse & Heeringen, 2018). Les facteurs de transcription associés aux motifs prédits ont ensuite été criblés en fonction de leur corrélation entre l'activité des motifs et leur expression génique à travers les grappes.

  • Séquençage ATAC en masse : numéro d'accès GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • Séquençage ATAC monocellulaire : numéro d'accès GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • Séquençage d'ARN monocellulaire : numéro d'accès GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • Séquençage d'ARN en masse : numéro d'accès GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).

Dois-je utiliser du saccharose pour induire un promoteur lac ? - La biologie

a) En présence de fortes concentrations de tryptophane, seul un court transcrit de l'opéron trp est synthétisé en raison de l'atténuation de la transcription en 5' des gènes de structure. Ceci est médié par la reconnaissance de deux codons Trp dans la séquence leader. Si ces codons étaient mutés pour être des mutations non-sens de l'UAG ambre, quel effet cela aurait-il sur la régulation de l'opéron en présence ou en l'absence de tryptophane ? Expliquer

Rappelez-vous, contrairement à l'opéron his, l'opéron t rp est contrôlé à la fois par la répression et l'atténuation.

Si beaucoup de trp est présent, l'opéron sera réprimé.

L'effet des mutations non-sens serait révélé sous des niveaux de trp intermédiaires où l'atténuateur module normalement l'efficacité de terminaison de la transcription. Normalement, à des concentrations trp intermédiaires, certains transcrits se terminent et certains passent par l'opéron, en fonction de la vitesse à laquelle les codons trp du leader sont traduits. Les changer pour arrêter les codons provoquerait le blocage des ribosomes, imitant efficacement la famine extrême du trp conduisant à une expression maximale de l'opéron.

L'opéron trp serait exprimé à des niveaux maximum en l'absence de tryptophane, puisque le répresseur trp serait non lié et la région leader mutante permettrait une expression complète.

b) Un gène de fusion lacI-lacZ a été identifié qui produit une protéine chimérique avec à la fois une fonction répresseur et une fonction ß-gal. À quel(s) phénotype(s) Lac vous attendriez-vous pour une souche portant ce gène de fusion.

Le mutant devrait exprimer l'activité lacZ de manière constitutive mais à des niveaux très faibles puisque l'expression de la protéine de fusion serait entraînée par le promoteur lacI.

Ce serait phénotypiquement Lac - puisque l'expression de bas niveau ne permettrait pas la croissance sur le lactose. Rappelez-vous qu'il n'y a aucun moyen d'induire la synthèse de la protéine de fusion ou du gène lacY car la région du promoteur-opérateur lac est supprimée.

c) Lorsqu'une souche Hfr portant un prophage lambda est accouplé à un receveur non lysogène, le prophage est induit à croître par voie lytique peu de temps après le transfert au receveur. Qu'est-ce que cela suggère sur le mécanisme par lequel le prophage lambda est maintenu dans le chromosome bactérien ?

Ceci est exactement analogue à l'expérience PaJaMo et indique que la lysogénie est contrôlée par la répression.

d) Lorsqu'un mâle d'une souche P de drosophile est croisé avec une femelle de type M, la descendance est généralement stérile. Si un mâle de type M ou P est croisé avec une femelle de type P, la descendance est fertile.

i) Qu'est-ce que cela implique sur le mécanisme par lequel la transposition de l'élément P est contrôlée ?

Ceci est exactement analogue au cas avec lambda ci-dessus et à l'expt PaJaMo. Vous apportez des éléments P dans un cytotype M et obtenez une transposition. Dans l'autre sens ou P dans P rien ne se passe. Le contrôle est négatif.

ii) Pourquoi les descendants du croisement P X &trade M sont-ils viables mais stériles ?

Parce que la transposition est limitée à la lignée germinale. La mobilisation des éléments P se produit uniquement dans les gonades de la descendance. Ainsi la descendance est normale somatiquement mais du fait de la mobilisation massive des éléments P dans leurs gonades, elle est stérile.

Q) Un assistant d'enseignement pré-med a conçu une expérience pour démontrer le concept de mutations cis-dominantes à une classe de laboratoire. Le TA a demandé à la classe de créer deux clones recombinants dans le vecteur plasmidique multicopie pBR322. Le premier plasmide portait la région promoteur-opérateur lac de type sauvage et les gènes de structure mutants Z et Y. Le second plasmide portait la région promoteur-opérateur de type sauvage et les gènes Z+ et Y+. Les plasmides ont été introduits dans des souches d'E. coli de génotypes I + o c Z + Y + et I + o c Z - Y - et dosés pour l'activité lacZ par étalement sur des plaques X-gal avec les résultats suivants :

Phénotype de colonie sur plaques X-gal

I + o + Z + Y + contrainte de contrôle

I + o c Z + Y + contrainte de contrôle

pBR322 o + Z - Y - / I + o c Z + Y +

pBR322 o + Z + Y + / I + o c Z - Y -

a) Pourquoi les résultats ont-ils été surprenants pour l'AT ?

L'AT s'attendait à ce que la contrainte dans la rangée du bas du tableau soit inductible et non constitutive. L'implication des résultats dans le tableau est que la mutation o c est trans-dominante et non cis-dominante.

b) Qu'est-ce qui n'a pas fonctionné ? Fournissez une explication pour les résultats apparemment anormaux.

Le problème est dû au plasmide multicopie. Le TA voulait imiter l'état diploïde mais au lieu d'utiliser un F' à copie unique, a utilisé le pBR322 à copies multiples. Cela signifie que la séquence opérateur était présente en multicopie et titrait la quantité limitée de répresseur (

10 molécules) présentes dans la souche sauvage. Ainsi, la plupart des plasmides exprimaient les gènes lacZ et Y dans la rangée du bas, donnant l'impression que o c agit en trans.

c) Proposez une expérience pour tester votre réponse à la partie b).

Si cela est vrai, on devrait pouvoir imiter la situation en clonant uniquement l'opérateur de type sauvage (pas de gènes Z + ou Y +) sur le plasmide et en l'introduisant dans une souche de type sauvage. On s'attendrait à une expression lac constitutive puisque l'opérateur plasmidique titrera le répresseur.

Un deuxième test consisterait à inclure le gène répresseur sur le plasmide multicopie. Dans ce cas, un répresseur suffisant devrait être créé pour réprimer tous les opérateurs o + et l'on verrait l'effet cis-dominant de la mutation o c.

Un troisième test consisterait à utiliser un plasmide à copie unique. Là, la situation serait comme dans le cas d'un F' et le caractère agissant en cis de l'allèle o c serait apparent.

Q) Les trois graphiques suivants illustrent la croissance d'E. coli et la production de ß-galactosidase (produit lacZ) lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu contenant à la fois du glucose et du lactose comme sources de carbone.

Q) Les trois graphiques suivants illustrent la croissance d'E. coli et la production de ß-galactosidase (produit lacZ) lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu contenant à la fois du glucose et du lactose comme sources de carbone.

(a) Expliquez la signification du graphique de gauche.

Le graphique illustre le processus de croissance diauxique. Les cellules utilisent d'abord la meilleure source de carbone (glucose) et n'utilisent le lactose que lorsque le glucose est épuisé. Les gènes lac restent réprimés tant que le glucose est présent même si l'inducteur (lactose) est présent, et ne sont synthétisés que lorsque le glucose est épuisé.

(b) Les résultats indiqués dans les graphiques du milieu et de droite sont-ils cohérents avec l'idée que la diauxie glucose-lactose (répression des catabolites) est régulée directement par la concentration d'AMPc cellulaire ? expliquez pourquoi ou pourquoi pas.

Non, les données sont incompatibles avec l'idée. Le graphique central indique que la B-gal est synthétisée à un taux élevé en présence de glucose s'il n'y a pas de protéine répresseur. Ceci indique que le complexe CRP-AMPc doit être lié au promoteur de l'opéron lac même en présence de glucose. Selon le modèle de concentration d'AMPc, les niveaux d'AMPc devraient être faibles en glucose et donc l'opéron lac devrait être essentiellement éteint même en l'absence de répresseur. Les données du graphique de droite suggèrent essentiellement la même chose. Lorsque l'inducteur IPTG est ajouté en présence de glucose, l'opéron lac est immédiatement induit. Cela indique également que la CRP-AMPc doit être liée au promoteur lac en présence de glucose.

6 ) Le VIH infecte les cellules humaines par un processus qui implique une interaction physique entre la glycoprotéine d'enveloppe virale gp120 et la protéine CD4 présente à la surface de nombreuses cellules du système immunitaire. Pour que le VIH pénètre dans les cellules, on pense que la gp120 doit également interagir avec le produit du gène ccr-5 (alias ckr-5). Une autre possibilité est que la protéine de capside virale interagisse avec le CCR-5 après fusion de la membrane cellulaire et des enveloppes virales, et que cette interaction permette à la capside virale d'entrer dans le cytoplasme.

a) Proposer un test génétique qui distinguera s'il s'agit de gp120 ou de la protéine de capside qui contacte physiquement le CCR-5. Décrivez les expériences, y compris tous les contrôles que vous jugez utiles, et indiquez les résultats attendus si la première hypothèse est vraie.

Utilisez le système à deux hybrides. Fusionnez CCR-5 et CD4 au domaine de liaison à l'ADN lexA et gp120 et la protéine de capside au domaine d'activation de la transcription GAL4. Construire une construction rapporteur qui place lacZ sous le contrôle d'un promoteur basal de levure et des sites opérateurs lexA. Testez les différentes protéines de fusion en examinant l'expression de lacZ. Des niveaux élevés d'activité ß-gal indiquent une interaction positive entre la protéine fusionnée au domaine de liaison à l'ADN et celle fusionnée au domaine d'activation.


Types de promoteurs inductibles

Chemical agents, temperature, and light are all examples of factors that can lead to the induction of a promoter. Below, you’ll find a short description of these three types of inducible promoters, and examples of each type. Many of these promoter systems are available at Addgene!

Chemically inducible promoters

Chemically regulated promoters are among the most common inducible promoters. The positive inducible tetracycline ON (Tet-On) system, a versatile tool developed for use in prokaryotes and eukaryotes, works via direct activation. Dans ce système, le activator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) is normally inactive and cannot bind the tetracycline response elements (TRE) in a promoter. Tetracycline and its derivatives serve as inducing agents to allow promoter activation.

One of the most commonly used prokaryotic promoters is the negative inducible pLac promoter. This promoter requires removal of the lac repressor (lacI protein) for transcription to be activated. In the presence of lactose or lactose analog IPTG, the lac repressor undergoes a conformational change that removes it from lacO sites within the promoter and ceases repression of the target gene. A simplified lac inducible system is found in many bacterial expression vectors.

Negative inducible promoter pBad is another popular prokaryotic promoter often used for bacterial protein purification. When arabinose is absent, regulatory protein AraC binds O and I1 sites upstream of pBad, blocking transcription. The addition of arabinose causes AraC to bind I1 and I2 sites, allowing transcription to begin. In addition to arabinose, cAMP complexed with cAMP activator protein (CAP) can also stimulate AraC binding to I1 and I2 sites. Supplementing cell growth media with glucose decreases cAMP and represses pBad, decreasing promoter leakiness.

Other examples of chemically induced promoters include positive inducible alcohol et steroid regulated promoters commonly used in plant research.

Temperature inducible promoters

Temperature sensitive expression systems are typically less leaky than chemically induced promoters they show near-zero expression at regular temperatures but can be induced by heat or cold exposure. Examples include the heat shock-inducible Hsp70 or Hsp90-derived promoters, in which a gene of choice is only expressed following exposure to a brief heat shock. In the case of Hsp70, the heat shock releases heat shock factor 1 (HSF-1), which subsequently binds to heat shock elements in the promoter, thereby activating transcription. Addgene depositors have developed heat shock-inducible Cre and Cas9 for easy genome engineering in species like C. elegans and Drosophila.

Light inducible promoters

Light is another way to activate gene expression, and two-component systems used in synthetic biology use light to regulate transcription. Red flame plasmid pDawn contains the blue-light sensing protein YFI. When light is absent, YFI phosphorylates FixJ, which binds to the FixK2 promoter to induce transcription of the phage repressor cI. Repressor cI inhibits transcription from phage promoter pR, preventing expression of a reporter gene. When light is present, YFI is inactive, preventing repressor cI synthesis and allowing reporter gene transcription to take place. Addgene also has yellow flame light-regulated two component systems designed by the Tabor lab.


This work was supported by grants from the National Key R&D Program of China (2018YFA0900600), the National Natural Science Foundation of China (31788103, 31971370 and 31900301), the Chinese Academy of Sciences (QYZDY-SSW-SMC030), and R&D Program in Key Areas of Guangdong Province (2018B020202005).

Sinian Xing and Kunling Chen contributed equally to this work.

Affiliations

State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Center for Genome Editing, Institute of Genetics and Developmental Biology, Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Sinian Xing, Kunling Chen, Haocheng Zhu, Rui Zhang, Huawei Zhang & Caixia Gao

College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China


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