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La structure des protéines peut-elle être déterminée par diffraction des rayons X sur une seule image ?


Je lis sur l'utilisation de la cristallographie aux rayons X pour déterminer la structure des protéines. Selon mon livre, les données sont collectées à des angles de 30 à 360 (en fonction de la symétrie de la protéine). Une illustration est donnée avec des anneaux concentriques étiquetés avec des distances - plus les points sont éloignés, plus la résolution est élevée.

L'image est-elle un composite (où l'angle du point ponctuel par rapport au centre équivaut à l'angle de la lecture) ou une image distincte est-elle prise à chaque angle ? Y a-t-il d'autres raisons pour lesquelles plus d'images seraient nécessaires ?

Merci.


Vous ne pouvez pas résoudre une structure avec une seule image, même avec une diffraction parfaite.

La raison pour laquelle vous avez besoin d'images sur une large bande d'angles est que le motif de diffraction est également en trois dimensions, dans ce que l'on appelle "l'espace réciproque". Au minimum, une rotation de 180° du cristal est nécessaire pour balayer toute la sphère spatiale réciproque avec le plan de détection, bien que la symétrie dans la structure cristalline puisse encore réduire cela (certaines de mes protéines n'ont besoin que de 90°, je pense que les cellules unitaires hexagonales avec une symétrie d'ordre 6 peut vivre avec 30°). Parce que les cristaux sont des choses réelles (lire : non idéaux, doublement pour les cristaux de protéines), le balayage est étendu pour gagner en redondance.


Probablement pas. Bien que l'on puisse obtenir d'excellentes données de diffraction à partir d'un cristal de haute qualité, il serait extrêmement difficile de résoudre le problème de phase. Les angles supplémentaires aideront à contraindre les solutions.


Pas en analysant une seule protéine. Il y a du travail avec des lasers à rayons X.

Vous devez prendre une image simultanée de millions de protéines et l'utiliser pour obtenir une structure. Ce n'est pas tout à fait l'heure de grande écoute. Les gens le font également avec des faisceaux d'électrons dans des microscopes électroniques.

Ces méthodes reconstruiront des modèles 3D des molécules, parfois dans des états qui ne peuvent être obtenus par cristallographie. Les exemples étant la structure du complexe de nombreux pores nucléaires mégadaltons et la fibre f-actine. L'étude classique est un modèle 3D de bactériorhodopsine, la première structure de protéine membranaire qui était à résolution moléculaire (il s'agissait cependant d'un échantillon cristallin).

Alors qu'en principe, cela semble beaucoup plus simple - obtenez un échantillon pur de votre protéine, ou complexe et congelez-le et zappez-le avec un rayon X ou un faisceau d'électrons, c'est beaucoup plus de travail pour reconstruire l'image et peut prendre aussi longtemps ou plus longtemps que obtenir une structure aux rayons X. La résolution est également généralement médiocre car le cristal renforcera la cohérence, c'est-à-dire que toutes les protéines sont alignées de la même manière et ont presque la même forme 3D dans un cristal.


La structure des protéines peut-elle être déterminée par diffraction des rayons X sur une seule image ?

Oui. En utilisant une technique appelée diffraction de Laue, il est possible d'obtenir suffisamment de données à partir d'une seule image pour résoudre une structure cristalline de protéine. Un exemple est l'étude en temps résolu de la dissociation de la carbonmonoxymyoglobine par photolyse (DOI : 10.1107/S090904959501661X). Ce n'est pas la technique standard à longueur d'onde unique qui est généralement utilisée, mais utilise des rayons X "blancs" avec une gamme de longueurs d'onde disponibles uniquement dans les faisceaux synchrotron. Par exemple, l'installation utilisateur BioCARS fournit une infrastructure pour la cristallographie résolue en temps. Il est également utilisé en « diffraction avant destruction » lorsqu'on travaille avec des lasers à électrons libres, voir par exemple Nature Methods 8, page 283 (2011).

Le reste de la réponse concerne la cristallographie conventionnelle à une seule longueur d'onde.

L'image est-elle un composite (où l'angle du point ponctuel par rapport au centre est équivalent à l'angle de la lecture) ou est-ce une image distincte prise à chaque angle

L'information structurelle souhaitée (densité électronique 3D dans l'espace réel) est une transformée de Fourier des données de diffraction (espace réciproque 3D). Le mot "image" est un jargon pour une image de diffraction unique, c'est-à-dire les taches de diffraction que vous observez lorsque vous pointez un faisceau de rayons X sur un cristal dans une certaine orientation. En utilisant une orientation différente, vous obtenez plus de données (et mesurez également certains points plusieurs fois).

Y a-t-il d'autres raisons pour lesquelles plus d'images seraient nécessaires ?

Plus les images de diffraction sont collectées, plus l'exhaustivité et la redondance des données sont élevées. L'exhaustivité fait référence au fait d'avoir mesuré chaque tache de diffraction au moins une fois. La redondance fait référence à la fréquence à laquelle un spot a été mesuré en moyenne, et l'augmentation de la redondance augmente la qualité de la mesure grâce à la moyenne.


La structure des protéines peut-elle être déterminée par diffraction des rayons X sur une seule image ? - La biologie

Instantané de données expérimentales

Validation wwPDB   Rapport 3D Rapport complet

La première structure cristalline de protéine déterminée à partir de données de diffraction de poudre aux rayons X à haute résolution : une variante du complexe insuline-zinc humaine T3R3 produit par broyage.

(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 1549-1553

  • PubMed: 11092920  Recherche sur PubMed
  • DOI : 10.1107/s0907444900013901
  • Citation principale des structures connexes :  
    1FU2, 1FUB
  • Résumé PubMed : 

L'analyse par diffraction des rayons X de la structure des protéines est souvent limitée par la disponibilité de cristaux appropriés. Cependant, l'absence de monocristaux ne doit pas présenter un obstacle insurmontable dans la cristallographie des protéines, pas plus qu'elle ne le fait dans la science des matériaux, où les techniques de diffraction des poudres se sont développées au point où les oxydes complexes, les zéolites et les petites structures moléculaires organiques peuvent souvent être résolus à partir de la poudre. données seules.

L'analyse par diffraction des rayons X de la structure des protéines est souvent limitée par la disponibilité de cristaux appropriés. Cependant, l'absence de monocristaux ne doit pas présenter un obstacle insurmontable dans la cristallographie des protéines, pas plus qu'elle ne le fait dans la science des matériaux, où les techniques de diffraction des poudres se sont développées au point où les oxydes complexes, les zéolites et les petites structures moléculaires organiques peuvent souvent être résolus à partir de la poudre. données seules. Ici, ce fait est démontré avec la solution de structure et le raffinement d'une nouvelle variante du complexe T(3)R(3) Zn-insuline humaine produit par broyage mécanique d'un échantillon polycristallin. Les données de diffraction des rayons X sur poudre synchrotron à haute résolution ont été utilisées pour résoudre cette structure cristalline par remplacement moléculaire adapté au raffinement de Rietveld. Un raffinement complet de Rietveld de la protéine de 1630 atomes a été réalisé en combinant 7981 contraintes stéréochimiques avec un modèle de diffraction de poudre de 4800 étapes (d(min) = 3,24 A) et a donné les résidus R(wp) = 3,73%, R(p) = 2,84 %, R(F)(2) = 8,25 %. Il a été déterminé que le changement de phase induit par le broyage s'accompagne de rotations de 9,5 et 17,2 degrés des deux complexes T(3)R(3) qui composent la structure cristalline. Le matériau revient sur 2-3 jours pour récupérer la structure cristalline T(3)R(3) d'origine. Un raffinement de Rietveld de cette protéine de 815 atomes en combinant 3886 contraintes stéréochimiques avec un modèle de diffraction de poudre de 6000 étapes (d(min) = 3,06 A) a donné les résidus R(wp) = 3,46 %, R(p) = 2,64 %, R(F)(2) = 7,10 %. La capacité démontrée à résoudre et à affiner une structure cristalline de protéine à partir de données de diffraction de poudre suggère que cette approche peut être utilisée, par exemple, pour examiner les changements structurels d'une série de dérivés de protéines dans lesquels la structure d'un membre est connue à partir d'un monocristal. étudier.


Article de recherche original

Emma V. Beale 1†, David G. Waterman 2,3*† , Corey Hecksel 4†, Jason van Rooyen 4 , James B. Gilchrist 4 , James M. Parkhurst 1 , Félix de Haas 5 , Bart Buijsse 5 , Gwyndaf Evans 1* et Peijun Zhang 4,6,7*
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  • 7 Département de biologie structurale, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, États-Unis

MicroED a récemment émergé comme une méthode puissante pour l'analyse des structures biologiques à résolution atomique. Cette technique a été largement limitée aux nanocristaux de protéines qui se développent sous forme d'aiguilles ou de plaques mesurant seulement quelques centaines de nanomètres d'épaisseur. De plus, le traitement traditionnel des données microED utilise un logiciel de cristallographie aux rayons X établi qui n'est pas optimisé pour gérer les effets composés propres aux données de diffraction électronique. Ici, nous présentons un flux de travail intégré pour la microED, de la préparation d'échantillons par broyage par faisceau d'ions cryo-focalisé, en passant par la collecte de données avec un détecteur Ceta-D standard, jusqu'au traitement des données à l'aide de la suite logicielle DIALS, permettant ainsi la détermination de routine de la structure atomique des cristaux de protéines. de n'importe quelle taille et forme en utilisant microED. Nous démontrons l'efficacité du flux de travail en déterminant la structure de la protéinase K à une résolution de 2,0 &# x00C5 et montrons l'avantage d'utiliser des lamelles de cristal de protéine par rapport aux nanocristaux.


La forme d'une protéine est spécifiée par sa séquence d'acides aminés

Rappelez-vous du chapitre 2 qu'il existe 20 types d'acides aminés dans les protéines, chacun ayant des propriétés chimiques différentes. Une molécule de protéine est constituée d'une longue chaîne de ces acides aminés, chacun lié à son voisin par une liaison peptidique covalente (Figure 3-1). Les protéines sont donc aussi appelées polypeptides. Chaque type de protéine a une séquence unique d'acides aminés, exactement la même d'une molécule à l'autre. Plusieurs milliers de protéines différentes sont connues, chacune avec sa propre séquence d'acides aminés.

Figure 3-1

Une liaison peptidique. Cette liaison covalente se forme lorsque l'atome de carbone du groupe carboxyle d'un acide aminé partage des électrons avec l'atome d'azote (bleu) du groupe amino d'un deuxième acide aminé. Comme indiqué, une molécule d'eau est perdue dans cette condensation (suite. )

La séquence répétitive d'atomes le long du noyau de la chaîne polypeptidique est appelée squelette polypeptidique. Attachées à cette chaîne répétitive se trouvent les portions des acides aminés qui ne sont pas impliquées dans la formation d'une liaison peptidique et qui confèrent à chaque acide aminé ses propriétés uniques : les 20 chaînes latérales d'acides aminés différentes (Figure 3-2). Certaines de ces chaînes latérales sont non polaires et hydrophobes (craignant l'eau), d'autres sont chargées négativement ou positivement, certaines sont réactives, etc. Leurs structures atomiques sont présentées dans le panneau 3-1, et une brève liste d'abréviations est fournie dans la figure 3-3.

Figure 3-2

Les composants structurels d'une protéine. Une protéine est constituée d'un squelette polypeptidique avec des chaînes latérales attachées. Chaque type de protéine diffère par sa séquence et son nombre d'acides aminés, c'est donc la séquence des chaînes latérales chimiquement différentes (plus.)

Panneau 3-1

Les 20 acides aminés présents dans les protéines.

Figure 3-3

Les 20 acides aminés présents dans les protéines. Les abréviations à trois lettres et à une lettre sont répertoriées. Comme indiqué, il existe un nombre égal de chaînes latérales polaires et non polaires. Pour leurs structures atomiques, voir Panel 3-1 (p. 132�).

Comme discuté au chapitre 2, les atomes se comportent presque comme s'ils étaient des sphères dures avec un rayon défini (leur rayon van der Waals). L'exigence selon laquelle deux atomes ne se chevauchent pas limite considérablement les angles de liaison possibles dans une chaîne polypeptidique (Figure 3-4). Cette contrainte et d'autres interactions stériques restreignent sévèrement la variété des arrangements tridimensionnels des atomes (ou conformation) qui sont possibles. Néanmoins, une longue chaîne flexible, telle qu'une protéine, peut encore se replier d'un nombre énorme de manières.

Figure 3-4

Limitations stériques sur les angles de liaison dans une chaîne polypeptidique. (A) Chaque acide aminé contribue à trois liaisons (rouge) à l'épine dorsale de la chaîne. La liaison peptidique est plane (ombrage gris) et ne permet pas la rotation. En revanche, la rotation peut se produire environ (plus. )

Le repliement d'une chaîne protéique est cependant encore plus limité par de nombreux ensembles différents de faibles liaisons non covalentes qui se forment entre une partie de la chaîne et une autre. Ceux-ci impliquent des atomes dans le squelette polypeptidique, ainsi que des atomes dans les chaînes latérales d'acides aminés. Les liaisons faibles sont de trois types : liaisons hydrogène, des liaisons ioniques, et Les attractions de van der Waals, comme expliqué au chapitre 2 (voir p. 57). Les liaisons non covalentes individuelles sont 30 fois plus faibles que les liaisons covalentes typiques qui créent des molécules biologiques. Mais de nombreuses liaisons faibles peuvent agir en parallèle pour maintenir étroitement ensemble deux régions d'une chaîne polypeptidique. La stabilité de chaque forme pliée est donc déterminée par la force combinée d'un grand nombre de ces liaisons non covalentes (Figure 3-5).

Figure 3-5

Trois types de liaisons non covalentes qui aident les protéines à se replier. Bien qu'une seule de ces liaisons soit assez faible, beaucoup d'entre elles se forment souvent ensemble pour créer un arrangement de liaison solide, comme dans l'exemple illustré. Comme dans la figure précédente, R est utilisé comme un général (plus. )

Une quatrième force faible a également un rôle central dans la détermination de la forme d'une protéine. Comme décrit au chapitre 2, les molécules hydrophobes, y compris les chaînes latérales non polaires d'acides aminés particuliers, ont tendance à être forcées ensemble dans un environnement aqueux afin de minimiser leur effet perturbateur sur le réseau de molécules d'eau à liaison hydrogène (voir p. 58 et Panneau 2-2, p. 112�). Par conséquent, un facteur important régissant le repliement de toute protéine est la distribution de ses acides aminés polaires et non polaires. Les chaînes latérales non polaires (hydrophobes) d'une protéine appartenant à des acides aminés tels que la phénylalanine, la leucine, la valine et le tryptophane ont tendance à se regrouper à l'intérieur de la molécule (tout comme les gouttelettes d'huile hydrophobe fusionnent dans l'eau pour former une grosse gouttelette) . Cela leur permet d'éviter le contact avec l'eau qui les entoure à l'intérieur d'une cellule. En revanche, les chaînes latérales polaires telles que celles appartenant à l'arginine, à la glutamine et à l'histidine ont tendance à s'organiser près de l'extérieur de la molécule, où elles peuvent former des liaisons hydrogène avec l'eau et avec d'autres molécules polaires (Figure 3-6). Lorsque des acides aminés polaires sont enfouis dans la protéine, ils sont généralement liés par des liaisons hydrogène à d'autres acides aminés polaires ou au squelette polypeptidique (Figure 3-7).

Figure 3-6

Comment une protéine se replie en une conformation compacte. Les chaînes latérales d'acides aminés polaires ont tendance à se rassembler à l'extérieur de la protéine, où elles peuvent interagir avec l'eau.

Figure 3-7

Liaisons hydrogène dans une molécule de protéine. Un grand nombre de liaisons hydrogène se forment entre les régions adjacentes de la chaîne polypeptidique repliée et aident à stabiliser sa forme tridimensionnelle. La protéine représentée est une partie de l'enzyme lysozyme et de l'hydrogène (plus. )


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1 Juste à titre d'exemple : en supposant une cellule unitaire avec 100 axes dans un cristal de protéine bien ordonné et une distance minimale préférée de cinq pixels entre les pics de Bragg adjacents, la résolution maximale atteignable pour un seul quad est d'environ 3,5 / 8197& #197 si le faisceau direct est centré sur le détecteur. Pour le même cristal, le pavage de quatre quads tel que présenté ici augmenterait la résolution maximale à laquelle les points de Bragg peuvent être identifiés au-delà de 1,0 & 8197 & 197, en supposant à nouveau un faisceau direct central.

Remerciements

Nous remercions Wolfgang Kabsch pour un programme de correction des distorsions elliptiques et pour les discussions sur le traitement des données. Nous remercions Kay Diederichs et Sven Hovmöller pour les discussions sur le traitement des données. Nous remercions Henning Stahlberg et Kenneth Goldie pour leur soutien et leurs discussions. Nous remercions Rishi Matadeen, Sacha de Carlo, Thorsten Blum et Igor Nederlof pour leur aide dans la préparation des échantillons et l'acquisition des données. Nous remercions Robbie Joosten et Garib Murshudov pour les discussions sur le raffinement du modèle. Nous remercions ASI (Amsterdam Scientific Instruments) pour le soutien avec les détecteurs, la lecture et le logiciel. Nous remercions Jan Visser et Bas van der Heijden (NIKHEF, Amsterdam) pour l'assistance, la conception et les tests précoces.

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Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution (CC-BY), qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur tout support, à condition que les auteurs originaux et la source soient cités.


La biologie structurale intègre des techniques et des principes de biologie moléculaire, de biochimie et de biophysique comme moyen d'élucider la structure moléculaire et la dynamique des molécules biologiquement pertinentes. Les récents progrès de l'instrumentation ont donné un nouvel élan à la biologie structurelle, car des molécules biologiques complexes peuvent désormais être analysées avec une facilité et une efficacité sans précédent. La structure tridimensionnelle des protéines et des complexes protéiques fournit de grandes informations sur les lois des activités de la vie et le mécanisme des maladies, permettant ainsi la conception rationnelle de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques. Il existe trois principales techniques de recherche en biologie structurale : la diffraction des rayons X sur monocristal (SC-XRD), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la cryomicroscopie électronique (Cryo-EM). Cependant, il n'y a pas de méthode « tout usage » puisque les trois offrent des avantages uniques ainsi que des limites.

Fig. 1. Trois principales techniques de recherche pour la biologie structurale. Selon les statistiques de PDB (https://www.rcsb.org/), plus de 120 000 structures protéiques résolues par SC-XRD, représentant près de 90 % du total. Et il existe environ 12 000 structures protéiques obtenues par RMN. Bien que le nombre total de structures protéiques résolues par Cryo-EM ne soit pas comparable à celui des deux premières techniques, la croissance explosive des structures de cette technique est remarquable ces dernières années.

La cristallographie aux rayons X utilise les rayons X pour déterminer la position et la disposition des atomes dans un cristal. La méthode la plus classique de cristallographie aux rayons X est la diffraction des rayons X sur monocristal, dans laquelle les atomes cristallins font que le faisceau de rayons X incident produit des faisceaux diffusés. Lorsque les faisceaux diffusés atterrissent sur le détecteur, ces faisceaux produisent un motif de diffraction de speckle. Au fur et à mesure que le cristal tourne progressivement, l'angle et l'intensité de ces faisceaux diffractés peuvent être mesurés, puis une image tridimensionnelle de la densité électronique à l'intérieur du cristal est générée. Sur la base de cette densité électronique, la position moyenne des atomes dans le cristal, les liaisons chimiques, les barrières cristallines et diverses informations peuvent être déterminées. Pour un monocristal avec une pureté, une homogénéité et une régularité suffisantes, les données de diffraction des rayons X peuvent déterminer l'angle et la longueur de la liaison chimique moyenne à quelques dixièmes de degré et à quelques millièmes d'angström, respectivement.

Fig.2. La physique et les principes mathématiques de la cristallographie aux rayons X pour résoudre une structure

La technique de diffraction des rayons X sur monocristal a été proposée et développée en 1912, et elle est devenue l'outil le plus important et le plus utile pour déterminer la structure des protéines, puisque la structure des protéines de la myoglobine a été déterminée pour la première fois en 1958. De nos jours, plus de 140 000 structures de protéines ont ont été déposés dans une banque de données de protéines (https://www.rcsb.org/), dont près de 90 % sont résolus à l'aide de la technique de diffraction des rayons X sur monocristal, suggérant ses avantages dans l'étude de la structure des cristaux de macromolécules biologiques.

Le processus de la technique de diffraction des rayons X sur monocristal peut être grossièrement divisé en quatre étapes. La première étape consiste à obtenir des monocristaux de haute qualité de la protéine cible, appelée cristallisation de la protéine. Lorsque la solution de la protéine solubilisée atteint la sursaturation, elle favorise l'agrégation et la nucléation des protéines. En fin de compte, les molécules de protéines individuelles s'organisent en une série répétée de cellules unitaires en adoptant une orientation uniforme. Les cristaux qualifiés doivent être de taille suffisante (normalement plus de 50 m dans toutes les dimensions) et de qualité (structure régulière, pas de fissures ou de macles). L'obtention de monocristaux de haute qualité est l'étape limitante pour résoudre une structure avec cette méthode.

Après avoir obtenu un monocristal, une expérience de diffraction est nécessaire. Le cristal est immobilisé dans un faisceau de rayons X intense, produisant un diagramme de diffraction, qui est enregistré en tant que données de diffraction (angle et intensité des rayons X diffractés). Au fur et à mesure que le cristal tourne progressivement, les réflexions précédentes disparaissent et de nouvelles réflexions apparaissent. L'intensité de diffraction à chaque tache est enregistrée à partir de chaque direction du cristal.

Par la suite, les données de diffraction obtenues à partir du motif de diffraction sont combinées avec diverses méthodes d'analyse structurelle et d'ajustement des données pour analyser la distribution de la densité électronique dans l'espace tridimensionnel à l'intérieur de la cellule unitaire.

In the last step, based on the electron density map, a model of atomic arrangement in the crystal can be produced and refined.

Fig.3. The process of single crystal X-ray diffraction technique

This method may yield high atomic resolution and is not limited by the molecular weight of the sample. It is suitable for water-soluble proteins, membrane proteins as well as macromolecular complexes. When manipulated properly, it becomes a powerful tool to deliver reliable structural data of biological macromolecules and determine the position and structure of the active center, and helps understand how the protein recognizes and binds ligand molecules at the atomic level.

However, the single crystal X-ray diffraction method also has several disadvantages. First, the sample must be crystallizable, but crystallization of biological macromolecules with large molecular weight can be difficult, particularly, membrane proteins are more challenging to crystallize because of its large size and poor solubilization. Second, an organized single crystal must be obtained to allow appropriate diffraction. Finally, the obtained three-dimensional structure of biological sample only represents a static form of the tested molecule (one of many possibilities), rather than a dynamic one.

The second method is nuclear magnetic resonance (NMR). Nuclei are charged, fast spinning particles, which are similar to outer electrons. The gyromagnetic ratios of different atomic nuclei are different and therefore have different resonance frequencies. The movement of the nucleus is not isolated--it interacts with the surrounding atoms both intra- and inter-molecularly. Therefore, through nuclear magnetic resonance spectroscopy, structural information of a given molecule can be obtained. Taking protein as an example, its secondary structure, such as α-helix, β-sheet, turn, circular, and curl, reflect the different arrangement of the main chain atoms of protein molecules three-dimensionally. The spacing of the atomic nuclei in different secondary domains, the interaction between nuclei, and the dynamic characteristics of polypeptide segments all directly reflect the three-dimensional structure of proteins. These nuclear features all contribute to spectroscopic behaviors of the analyzed sample, thus providing characteristic NMR signals. Interpretation of these signals by computer-aided methods leads to deciphering of the three-dimensional structure.

Fig.4. Nuclear spin

Since the first observation of condensed-state NMR signals in 1946, NMR technology has experienced a rapid development for over 70 years, and its application has been extended from the area of physics such as nuclear magnetic moment determination to chemistry, medicine, material science, life science and many others. Notably, in the 1980s, NMR technology was applied in the structural analysis of protein creatively, thus promoting the application of NMR in biological field. Although the amount of three-dimensional structure data of proteins obtained by NMR technology is not comparable to that of single crystal X-ray diffraction, the unique advantages of NMR technology have been widely noticed: NMR is able to provide information on a kinetic basis, such that the internal movement of proteins over multiple time scales and their binding mechanism to ligands can therefore be solved.

There are four main steps in an NMR experiment: sample preparation, data acquisition, spectral processing, and structural analysis. NMR analysis is performed on aqueous samples of protein with high purity, high stability, and high concentration. A sample volume ranging from 300 to 600 μL with a concentration range of 0.1-3 mM. The use of stable isotopes 15N, 13C and 2H for protein labeling can effectively increase signal intensity and resolution. Selective labeling of certain amino acids or chemical groups of proteins can greatly reduce signal overlap. Multidimensional NMR experiments are utilized to acquire information about the protein. The spectral processing is then performed to determine the atoms of the protein corresponding to each spectral peak on different NMR spectra. Finally, a series of spatially structured information such as NOE and J coupling constants are used to calculate the spatial structure using distance geometric or molecular dynamics methods.

Fig.5. The process of nuclear magnetic resonance technology

The most important feature of the NMR method is that the three-dimensional structure of macromolecules in the natural state can be measured directly in solution, and NMR may provide unique information about dynamics and intermolecular interactions. The resolution of the macromolecular three-dimensional structure can be as low as sub nanometer.

However, the NMR spectrum of biomolecules with large molecular weight is very complicated and difficult to interpret, thereby limiting the application of NMR in analyzing large biomolecules. Additionally, this technique requires relatively large amounts of pure samples (on the order of several mg) to achieve a reasonable signal to noise level.

The third approach is the cryo-electron microscopy (Cryo-EM) technique, which includes three different methods: single particle analysis, electron tomography and electron crystallography. The essential mechanism of Cryo-EM is electron scattering. The basic principle is described as follows. Samples are prepared through cryopreservation prior to analysis. The coherent electrons are used as a light source to measure the sample. After the electron beam passes through the sample and the nearby ice layer, the lens system converts the scattered signal into a magnified image recorded on the detector. And signal processing is performed to obtain the three-dimensional structure of the sample.

Electron microscopy three-dimensional reconstruction technology was first discovered in 1968. The three-dimensional structure of T4 phage tail was reconstructed by electron micrographs. And then the general concept and methods of three-dimensional reconstruction of electron microscopy were proposed. For reducing the radiation damage, cryogenic electron microscopy was created in 1974. After more than 30 years of development, Cryo-EM has become a powerful tool for studying the structure of biological macromolecules. In recent years, the Cryo-EM technology has made revolutionary progress, particularly in the single particle analysis. Since 2013, with the tremendous advances in electron detector and image processing, Cryo-EM single particle analysis has progressed so rapidly that the resolution of Cryo-EM is now comparable to single crystal X-ray diffraction. At present, Cryo-EM is becoming a powerful tool for determining high resolution structure of biological macromolecules.

Before using the Cryo-EM to observe the sample, negative staining EM can be utilized for rapid screening of homogeneous sample. The Cryo-EM single particle analysis technique begins with the sample vitrification. During this process, the protein solution is instantly cooled, so that the water molecules do not crystallize, forming an amorphous solid. The frozen sample is then screened and data is collected in the system. A series of two-dimensional images can be taken during this period. Next, based on plenty of two-dimensional images acquired, particle alignment and classification are carried out. In the end, the data is processed by reconstruction software to generate a three-dimensional structural model.

Fig.6. The process of Cryo-EM single particle analysis technique

Compared to single crystal X-ray diffraction, the rapid freeze treatment of the sample maintains its closer-to-native state. Moreover, this method requires only a small amount of sample (about 0.1 mg), is more forgiven on sample purity, and does not need the protein to crystalize.

The main defect in this technique is that the particles are detected in unknown orientations. High levels of noise, due to the use of limited electron doses to minimize radiation damage, especially at high resolution, tends to complicate the determination of these orientations, and this is particularly a concern for smaller particles. Hence, structure determination of biological macromolecules by Cryo-EM was limited to large complexes or low-resolution models over the last few years.

Fig.7. Cryo-electron microscopy

In summary, each technology has its own advantages in certain applications such that one method might be used extensively in some cases but rarely in others. Thus, understanding the nature of the analysis is the key in method selection. Not only will the inappropriate selection of method produce compromised results, it may also cause significant delays of the project, and result in financial losses. For more information, please see Table 1.


Résumé

Single-crystal X-ray diffraction analysis was performed on a magnetically oriented microcrystal array (MOMA a composite in which microcrystals are oriented three-dimensionally in a polymer matrix) to demonstrate its potential to determine protein structure from a powder sample. Recrystallized hen egg-white lysozyme was pulverized to prepare a microcrystalline powder as a model system from which a MOMA was prepared. The microcrystalline powder was suspended in an ultraviolet (UV)-curable monomer and rotated nonuniformly in a static magnetic field (8 T), and then, the crystalline alignment was consolidated by UV light irradiation. The obtained sample was subjected to conventional single-crystal X-ray diffraction measurement. The structure determined for the MOMA was found to belong to the space group P212121 with unit-cell dimensions une = 51.26, b = 59.79, and c = 29.95 Å, in agreement with the structure of the single crystal from which the MOMA was prepared. The protein structure was refined at the highest resolution of 3.0 Å, which agreed with that determined with an independently grown single crystal under comparable conditions. The fabrication method presented here provides a powerful means of determining the structure of proteins that do not crystallize to sizes suitable for conventional single-crystal X-ray analyses.


Résumé

We demonstrate that ion-beam milling of frozen, hydrated protein crystals to thin lamella preserves the crystal lattice to near-atomic resolution. This provides a vehicle for protein structure determination, bridging the crystal size gap between the nanometer scale of conventional electron diffraction and micron scale of synchrotron microfocus beamlines. The demonstration that atomic information can be retained suggests that milling could provide such detail on sections cut from vitrified cells.

Despite the explosive growth in cryoelectron microscopy (cryo-EM) following the “resolution revolution” (1), X-ray methods were responsible for nearly 20-fold as many macromolecular structure depositions as single-particle cryo-EM in 2017, and diffraction remains the favored method for genuine atomic resolution analysis. Crystal growth is often a bottleneck for such analyses, and it can sometimes be difficult to grow crystals of sufficient size for analysis at conventional synchrotron macromolecular crystallography (sMX) beamlines. This has led to the development of microfocus beamlines that can routinely analyze crystals down to ∼5 μm (2). However, it is unknown how often crystallographic analyses fail due to the failure to recognize smaller crystals. The next generation of synchrotron beamlines may reduce the size requirement to around 1 μm, and the potential for structure determination from submicron crystals has been demonstrated by application of X-ray free electron laser (XFEL) sources, which achieve a brightness ∼10 8 -fold greater than a typical synchrotron beamline (3). XFEL sources also sometimes mitigate, by achieving “diffraction before destruction,” the radiation damage problem that limits the collection of synchrotron X-ray data (4, 5).

Electron diffraction (ED) can provide high-resolution structure determination from 3D crystals (6 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –12). Electrons have potential advantages over X-rays for the analysis of very small crystals: Their interaction with matter is sufficiently strong for a measurable signal to be obtained from a typical laboratory instrument the experiment is performed in a vacuum, thereby reducing background scatter and the useful data obtained before radiation damage occurs are much greater (6, 13, 14). However, the strong interaction with matter is also a limitation for ED, since the beam is absorbed very strongly by a few hundred nanometers of crystal. Furthermore, it has often been held that kinematic theories of diffraction, upon which X-ray analysis rests, are useless for crystals of such thickness (15, 16). For protein crystals, due to the large size of the unit cell, many diffracted beams are stimulated simultaneously and, through conservation of energy, the amplitude of each is greatly reduced, mitigating the effects of multiple scattering. Although dynamical effects have been observed with thicker protein crystals (6), the utility of the kinematic theory for thin crystals is shown in our study below, where systematic absences, which would be polluted by multiple scattering, are maintained. Indeed, in recent years, the power of ED to analyze nanometer-sized crystals has been amply demonstrated (6, 12, 17) however, there remains a significant range of size, from a few hundred nanometers to a few microns, that is accessible only using XFEL radiation, which is both hard to access and extremely expensive.

Micromachining using a focused ion beam (FIB milling) has been established in physical science applications for many years (18), and, although far from routine, cryo-FIB milling is now increasingly applied in the life sciences, for instance, to create thin lamella milled from frozen, hydrated cells to reveal cellular architecture (19). Cryo-FIB milling has been shown to preserve the structure of frozen, hydrated biological samples better than mechanical cryosectioning, although how far the preservation of order extends has not been established (19).


Méthodes

Expression et purification des protéines

HCA II was expressed in BL21 DE3 pLysS E. coli cells that were transformed with an expression plasmid based on pET31F1 coding for protein with UniProt accession code P00918 45 . The cells were grown in shaker incubators at 180 rpm and 37 °C in LB media supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin. Once the cells reached an optical density of

1 at 600 nm, protein expression was induced with the addition of 1 mM isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) and 1 mM ZnSO4. Protein expression was allowed to continue for 3 h. At this point, the cells were harvested by centrifugation in a JLA 8.1 rotor (Beckman) at

6800 × g for 20 min and frozen at −20 °C. Cells were resuspended in buffer A (0.2 M Na2DONC4, 100 mM Tris, pH 9.0) and lysed by addition of lysozyme while stirring in the cold room for 3–4 h. The cell lysate was centrifuged in a JA-25.50 rotor (Beckman) at

18,000 × g for 60 min at 4 °C, and the supernatant containing the soluble cellular fraction was loaded onto affinity resin (para-aminomethylbenzensulfonamide, Sigma Aldrich A0796). Unbound protein and nucleic acids were removed by repeated wash steps with buffer A, followed by buffer B (0.2 M Na2DONC4, 100 mM Tris, pH 7.0). Bound HCA II was eluted with 50 mM Tris, pH 7.8, and 0.4 M NaN3. The eluted protein was concentrated with Amicon Ultra concentration devices (10 kDa molecular weight cutoff), purified, and buffer-exchanged by size-exclusion chromatography on HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Life Sciences) in 50 mM Tris, pH 8.5. Fractions were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis to assess protein purity and homogeneity prior to crystallization. Eluted fractions containing HCA II were pooled and concentrated to

20 mg/ml by using Amicon Ultra Centrifugal Filter Units (Merck) with a molecular weight cutoff of 10 kDa.

Cristallisation

Crystals of HCA II were grown in sitting-drop vapor-diffusion setups using microbridges (Hampton Research) and 24-well Linbro crystallization plates (Hampton Research). The drops were prepared by mixing 10 μl of protein solution (20 mg/ml) with 10 μl of precipitant solution (2.8 M (NH4)2DONC4, 0.1 M Tris, pH 8.5), and were equilibrated against 1 ml of reservoir solution of the precipitant. Plates were incubated at 20 °C, and crystals appeared in 2–3 days. Crystals were harvested by crushing and repeated pipetting into 1.5 ml Eppendorf tubes to collect slurries of small crystals in mother liquor and stored at 20 °C until cryo-grid preparation.

Sample preparation

Complexes of HCA II with inhibitor AZM (Sigma Aldrich, A6011) were prepared by soaking the crystal slurries with inhibitor solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO) for 20 min, with a final concentration of 0.5 mM HCA II and 4.5 mM AZM. Grids were prepared by pipetting 3 μl on a QUANTIFOIL 1.2/1.3 (300 mesh) Cu holy carbon TEM grid. Excess liquid was removed via pressure-assisted backside blotting using Preassis 46 . The grid was vitrified manually by flash-cooling in liquid ethane. The sample was transferred to a Gatan 914 cryo-transfer holder.

L'acquisition des données

Microcrystal electron-diffraction data were collected on a JEOL JEM-2100 (LaB6 filament) TEM operated at 200 kV equipped with a Timepix hybrid pixel detector (Amsterdam Scientific Instruments). Grids were screened for suitable microcrystals in defocused diffraction mode, and diffraction data were collected from an area of 1.5 μm diameter defined by a selected-area aperture using the Instamatic software interface 40 . The effective sample-to-detector distance was 1481.74 mm. Data were collected using continuous rotation with an angular increment of 0.68° and an exposure time of 1.5 s per frame. Individual crystal datasets were typically collected over a tilt range of on average 10–30°, with an acquisition time of 22–66 s per crystal dataset. The total range of tilt angles covered during data collection from several crystals was −60 to +60°. The electron dose rate applied during data collection was approximately 0.1 e − /Å 2 /s, and the total exposure dose for each crystal dataset was within 2.0–6.0 e − /Å 2 .

Traitement de l'information

Data were integrated using XDS 47 with the Laue group constrained to 2/m. Reflections from different crystal datasets were merged in XSCALE 47 using a weighted average of the unit-cell parameters obtained from individual crystal processing (see Supplementary Tables 1 and 2). Selection criteria for including data were based on merging statistics and correlation coefficients between individual datasets as reported by XSCALE. A cutoff value of 0.7 was used for the ligand-bound HCA II data for the native HCA II data, a cutoff of 0.6 was used. Data were truncated at approximately jeje ≥ 1.0 and CC1/2 ≥ 0.4 with a correlation significant at the 0.1% level 48 (see Supplementary Tables 3 and 4). Data were merged and converted into MTZ format using AIMLESS 49 .

Structure solution

A search model of the apo structure with the metal cofactor, ligands, and water removed was generated from a high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4 29 ) using Sculptor 50 . The structure was solved using maximum-likelihood molecular replacement in Phaser 36 using the MicroED reflection intensities. For both native and ligand-bound data, a well-contrasting single solution was found with LLG = 1871, TFZ = 18.6, and LLG = 2494, TFZ = 19.6, respectively.

Model building and refinements

Starting electrostatic potential maps were generated from the molecular replacement solution using rigid-body refinement in phenix.refine 51 . The starting model and maps were used for remodeling several side chains and manually placing the metal cofactor Zn 2+ using Coot 37 . After restrained reciprocal space refinement in phenix.refine, the resulting map was inspected for any difference potential, indicating the presence of the bound inhibitor. The AZM ligand was imported in Coot using the get monomer command, and we used the find ligands command to fit the ligand using the precalculated mFo–DFc difference potential map at 2.8??.

Furthermore, upon inspection of the map, a clear blob of difference potential was observed in the solvent region, appropriate for accommodating a single DMSO molecule that was used as solvent to solubilize the ligand. The DMSO molecule was manually fitted using the get monomer command in Coot. Its position is in agreement with the neutron structure (PDB ID 4g0c) 30 where the space is occupied by three waters, and with a glycerol (GOL) solvent molecule occupying the same region in the high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4) 29 .

The HCA II:AZM model was then completed, automatically placing water molecules, and using restrained reciprocal space refinement in phenix.refine 51 . All refinement steps were preformed using a test set representing 5% of all reflections, atomic scattering factors for electrons, automatic weighting of the experimental data to stereochemistry and atomic displacement parameter terms, and group B-factor refinement per residue 51 .

Validation

The geometry of the native and ligand-bound structural models was validated using MolProbity 52 (Table 1). A simulated annealing (SA) composite omit map was calculated using phenix.composite_omit_map 51 by sequentially omitting 5% fractions of the structure. No missing reflections were filled in for map calculations. The MicroED model of the native structure shows a backbone Cα root-mean-square (r.m.s.) deviation of 0.23 Å with a structure from joint refinement against neutron and X-ray diffraction data (PBD ID 3tmj) 27 , and 0.22 Å with an X-ray structure of native HCA II (PBD ID 3ks3) 53 . The inhibitor-bound MicroED model shows a backbone Cα r.m.s. deviation of 0.29 Å with a previously determined model from joint X-ray and neutron refinement (PDB ID 4g0c 30 ), and of 0.22 Å with a high-resolution X-ray model of the same inhibitor-bound complex (PDB ID 3hs4) 29 , that was used as search model for molecular replacement. Root-mean-square deviation values between structural models were calculated by the secondary-structure matching (SSM) tool 54 .

Les figures

Figures 2–4 were prepared using the PyMOL Molecular Graphics System, version 2.2.3 Schrödinger, LLC.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.


Docking of X-Ray Crystallographic Structures Within Cryo-EM Maps

In the past decade, the most widely accepted combinatorial approach of X-ray crystallography and cryo-EM technique has been the practice of docking X-ray crystallographic atomic models into a cryo-EM map at low resolution. 5 This practice started in 1990s when crystal structures were attempted to be docked into low-resolution cryo-EM maps of icosahedral viruses or cytoskeletal helical filaments. 6 In the past two decades, several dozen docking software packages have been developed but only a few are still being actively developed today. The docking methods can be classified mainly into two categories: rigid-body docking and flexible docking. Rigid-body docking is used to find the optimal orientation and position of sub-component atomic crystallographic structures in the cryo-EM map. The most popular docking software packages include Situs, 7 EMfit, 8 and UCSF Chimera docking utility. 9 In cases where some minor conformational differences exist between the crystal structure of an individual component and its counterpart in the cryo-EM map, flexible docking algorithms, such as normal mode analysis and molecular dynamic simulation, are used by introducing conformational changes to the X-ray structure to fit into the cryo-EM map while maintaining the stereo-chemistry of the atomic models. Some flexible docking software packages include Situs, Flex-EM, 10 MDFF, 11 iMODFIT 12 and more recently Rosetta. 13

The docking can be quite useful in defining the protein location and protein–protein interface within a complex and new interaction modes that are not revealed by X-ray crystallography. If the cryo-EM density is of good enough quality, the docking can be quite precise even at lower resolution. In a recent example, the crystal structure of Ryanodine receptor 1's SPRY2 domain (∼50 kDa) was docked as a rigid body into a 10 Å resolution cryo-EM map of the entire complex (∼1.5 MDa) (Fig. 2). 14 The best scored result by the Colores program of Situs turned out to define the domain's location and orientation quite precisely to agree with the same domain in the high resolution structure of the complex in a 3.8 Å structure solved more recently by single particle cryo-EM. 15 The RMSD between the C?? atoms of the docked SPRY2 model and the high resolution atomic model of the complex was only 2.1 Angstrom. This underscores both the quality of the low-resolution cryo-EM map and the robustness of the docking algorithm.

Docking of atomic models into the 3D cryo-EM map of Ryanodine receptor 1 complex at 10 Angstrom resolution. The 3D EM map of the Ryanodine receptor 1 (EMD-5041) is shown in semi-transparent rendering in two orthogonal views. The atomic model of a ryanodine receptor monomer (grey) is docked in the map. The atomic model of SPRY2 domain docked in the map with rigid docking algorithm is shown in red color. Its equivalent domain in the atomic model of the full-length protein is shown in blue color. The atomic models of the two SPRY2 domain are in very similar orientation and location.

In our study, elucidating the architecture of yeast RNA exosome complex, docking of atomic models into low-resolution EM 3D reconstruction maps was critical for us to uncover new mechanistic insights of the complex's function. We solved a 3D reconstruction of the yeast exosome complex comprising ten subunits using single particle EM at about 18 Angstrom resolution, in which we were able to dock homologous atomic models of the nine-subunit human core complex and bacterial RNase III protein determined by X-ray crystallography. 16 This allowed us to reveal the mode of interaction between the Rrp44 subunit and the core complex. In a later study, we docked the crystal structure of RNA-bound yeast exosome 10-mer 17 into a 3D EM reconstruction of the complex in conformations induced by different lengths of RNA substrates with high fidelity. 18 Alternatively, we revealed a different conformation of the exosome bound by RNAs with short 3′-ss tails and built atomic models by docking available crystal structures of the core complex and Rrp44 separately in the 3D EM reconstruction. The two docking results allowed us to reveal distinct pathways of RNA substrate recruitment and processing within the complex. Interestingly, the most recent near-atomic-resolution structure of the apo-exosome complex (PDBID: 5G06) 19 verified the interfaces between the subunits calculated from the previous docking models in the low-resolution cryo-EM map of the apo-exosome complex.


Protein Mapping

Mapping of the location and expression level of proteins in specific cells, tissues, and organs aids in the functional study of the proteome. Spatial distribution of proteins is key to protein function, with improper localization or expression triggering various disease states. Mapping projects such as the Human Protein Atlas provide a proteomic resource for biomarker discovery and aid in the understanding of disease pathology. Mapping of the interactome helps define the molecular interactions that occur on a cellular level, assisting in the understanding of protein function and providing valuable potential drug targets for disease.


Voir la vidéo: Analyse cristallographique dun solide cristallin par diffraction de rayons X et loi de Bragg (Janvier 2022).